Summary
Detta protokoll beskriver en snabb metod för att samtidigt generera melanocyte och fibroblast kulturer från huden på 0-4 dag gamla möss. Dessa primära kulturer kan underhållas och manipuleras in vitro för att studera en mängd fysiologiskt relevanta processer, inklusive hud cellbiologi, pigmentering, sårläkning och melanom.
Abstract
Defekter i fibroblast eller melanocyte funktion är förknippade med hudsjukdomar, inklusive dålig barriärfunktion, defekt sårläkning, pigmentering defekter och cancer. Avgörande för förståelsen och förbättringen av dessa sjukdomar är experiment i primär fibroblast och melanocyte kulturer. Icke desto mindre, nuvarande protokoll för melanocyte isolering kräver att epidermal och dermal lagren av huden trypsinized och manuellt disassociated. Denna process är tidskrävande, tekniskt utmanande och bidrar till inkonsekvent avkastning. Dessutom, metoder för att samtidigt generera ren fibroblast kulturer från samma vävnadsprov är inte lätt tillgängliga. Här beskriver vi ett förbättrat protokoll för att isolera melanocyter och fibroblaster från huden på möss på postnatala dagar 0-4. I detta protokoll, hela huden är mekaniskt homogeniseras med hjälp av en vävnad chopper och sedan kortfattat smält med kollagenase och trypsin. Cell populationer isoleras sedan genom selektiv plätering följt av G418 behandling. Detta förfarande resulterar i konsekvent melanocyt och fibroblast avkastning från en enda mus i mindre än 90 min. Detta protokoll är också lätt skalbart, vilket gör det möjligt för forskare att bearbeta stora kohorter av djur utan en betydande ökning av hands-on tid. Vi visar genom flödescytometriska bedömningar att kulturer etablerade med detta protokoll är mycket berikade för melanocyter eller fibroblaster.
Introduction
Däggdjurs skinn är ett flerskiktade organ som skyddar kroppen från främmande patogener och ultraviolett strålning (UVR). Huden spelar också en avgörande roll i homeostatiska processer såsom sårläkning, temperaturreglering och D-vitaminproduktion1,2,3. Däggdjurs skinn består av tre stora celltyper: melanocyter, fibroblaster och keratinocyter. Dessa celltyper befolkar olika lager av huden, med keratinocyter som utgör epidermis, fibroblaster bosatta i dermis och melanocyter lokalisera till epidermal-dermal korsning och hårsäckar4. Här, vi detalj en enkel procedur som möjliggör samtidig generering av primära melanocyte och fibroblast kulturer från murina hud.
Melanocyter är pigment-producerande celler som finns på många platser i hela människokroppen, inklusive basal epidermis, iris, cochlea, hjärna och hårsäckar5. Den primära funktionen av melanocyter är att generera och utsöndra melanin-innehållande blåsor som kallas melanosomer5,6. Melanosomes innehåller två stora klasser av melanin: brun/svart eumelanin och gul/röd Pheomelanin6,7. Biokemiska processer inom melanocyten reglera den relativa överflöd av varje melanin arter och hjälpa till att bestämma hår, hud och ögonfärg8,9. Melanin tjänar också till att absorbera UVR och skydda solexponerade vävnader från mutagenes10.
Melanocyte dysfunktion kan orsaka pigmentdefekter och öka hudcancer känslighet. Till exempel, den hyperpigmenterade hud fläckar karakteristiska för melasma är resultatet av fokal melanin överproduktion, medan köns cells genetiska mutationer som kompromiss gener inblandade i melanin syntes leda till albinism11,12 . Intim kunskap om melanocytbiologi krävs för att utveckla strategier som kommer att korrigera sådana pigment defekter och i slutändan förbättra den psykosociala välbefinnande hos individer som drabbats av dessa sjukdomar. Underskott i melaninproduktionen och/eller förmåns syntesen av Pheomelanin är också förknippade med ökad hudcancer risk10. Denna risk tros bero på reducerat UVR-skydd6,13. Sålunda, metoder för att förbättra eller återställa eumelanin produktion i melanocyter kan minska förekomsten av hudcancer i dessa populationer.
Mesenkymala fibroblaster fastställa bindväv och strukturellt stöd för alla organ i kroppen, inklusive dermal lagret av huden14. Utsöndring av proteiner som kollagen, elastin, laminin och Fibronektin gör det möjligt för fibroblaster att bilda den extracellulära matrisen (ECM) som är nödvändig för vävnadens integritet1,14. Fibroblaster spelar också viktiga roller i processer såsom sårläkning, inflammation, angiogenes och cancer bildning/progression1,15,16.
Liknar melanocyter, defekter i fibroblast aktivering och funktion kan främja tumorigenes och sjukdom. Till exempel, olämplig fibroblast aktivering leder ofta till bildandet av fibros, till följd av den förbättrade deposition av överskott ECM komponenter i den omgivande vävnaden. Eftersom fibroblaster upprätthåller mycket av kroppens strukturella integritet, främjar fibros sjukdomar som påverkar många vävnader och organ, inklusive idiopatisk lungfibros, systemisk skleros, levercirros och hjärtfibros15. Fibroblaster spelar också en kritisk roll i cancer16. Cancer associerade fibroblaster (CAFs) är de vanligast förekommande icke-maligna celler i mikromiljön av många tumörer. CAFs har visat sig främja tumörproliferation, progression och terapeutiskt motstånd genom att modulera vävnad stelhet, lokal cytokin produktion och immunförsvaret16.
Primära cellkulturer ger forskare med genetiskt tractable modeller för att identifiera och mildra melanocyte och fibroblast defekter som leder till sjukdom. Men nuvarande metoder för att etablera melanocytkulturer är tidskrävande och tekniskt utmanande. Behovet av trypsinization och delikat separation av epidermis och dermis bidrar till variationer i experimentell avkastning och gör det svårt att utföra storskaliga experiment. Dessutom, protokoll för att samtidigt isolera melanocyter och fibroblaster från hela huden saknas för närvarande i området.
Vi har utvecklat en metod för att minska bearbetningssteg, variation och tid som krävs för att etablera melanocyte och fibroblastkulturer från samma hela hudprov. Med hjälp av en mekanisk homogenisering metod följt av en kort matsmältning, vår strategi minskar avsevärt mängden hands-on tid som krävs för att isolera primära melanocyter samtidigt möjliggöra samtidig fibroblast isolering. Den ökade hastigheten, effektiviteten och konsekvensen i detta protokoll, i kombination med förmågan att isolera melanocyter från 0-4 dagar gamla möss, ger forskarna flexibiliteten att utföra ett bredare spektrum av experiment än vad som tidigare varit möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Inhämta godkännande från din institutionella djur etikkommitté innan du påbörjar denna eller någon annan studie som involverar djur. Experiment som utfördes i detta protokoll godkändes av Ohio State Universitys institutionella djur vårds-och användnings utskott (IACUC, Protocol #2012A00000134).
1. förberedelse av protokoll
Anmärkning: Följande reagensprepareringsinstruktioner är lämpliga för generering av 9 cm2 melanocyte och fibroblastkulturer från en enda mus. Se reagensprepareringsguiden i tabell 1 för storskaliga isoleringar.
- Bered 1,5 mL kollagen lösning som innehåller 50 μg/mL kollagen i 0,1 M isättika.
- I ett laminärt flöde skåp, päls en brunn av en 6-brunn cellkultur skålen med 8 μg/cm2 (1,44 ml) kollagen lösning. Säkerställ att brunnen täcks helt av kollagen lösningen. Inkubera skålen vid 37 ° c i 3 h eller vid 4 ° c över natten. Före användning, tvätta kollagen-belagda väl två gånger med 1,35 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (150 μL av PBS per 1 cm2).
- Montera vävnads helikoptern i ett laminärt flödes skåp genom att försiktigt placera en hacknings skiva på plattformen för vävnads chopper och säkra ett sterilt blad till den rörliga armen.
- Bered 3 mL 1x antibiotika/antimykotisk lösning genom att späda 100x antibiotikum/antimykotisk stamlösning i steril PBS.
- Förbered 3 mL av färsk Hudrötnings buffert som innehåller 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin lösning, 1% L-glutamin, 10 mg/mL kollagenas typ I, 0,25% porcin trypsin och 0,02 mg/mL deoxyribonuclease i i RPMI 1640.
- Bered 6 mL färskt Melanocytmedia innehållande 10% fetalt bovint serum, 7% Horse serum, 1% penicillin/streptomycin lösning, 1% L-glutamin, 0,5 mM di-butyryl cyklisk AMP (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA) och 200 pM kolera toxin (CT) i Näringsämne mix F-12 Ham: s media.
Anmärkning: Koncentrerad dbcAMP, TPA och CT lagerlösningar kan göras, aliciteras och lagras för > 1 år vid-80 ° c. Basmedia som saknar dessa komponenter kan förvaras i upp till 1 månad vid 4 ° c. - Förbered 4 mL fibroblast media som innehåller 10% foster bovint serum, 1% penicillin/streptomycin och 1% L-glutamin i Dulbecco modifierade Eagle medium. Detta medium kan förvaras vid 4 ° c i upp till 1 månad.
- Bered 40 mL 4% Paraformaldehydlösning genom att späda 16% PARAFORMALDEHYD i PBS. Förvara eventuellt överskott vid 4 ° c i 1 månad eller-20 ° c i upp till 1 år.
- Förbered en 1% saponin stamlösning genom att blanda 0,5 g saponin i 50 mL PBS vid 37 ° c tills saponin har helt upplöst. Sterilisera lösningen för långtidsförvaring med en 50 mL spruta försedd med ett 0,2 μm PES-filter. Den resulterande saponin stamlösning kan hållas vid 4 ° c för 1 månad.
- Förbered 200 μL av 0,1% saponin lösning per mus genom att späda 1% saponin stamlösning i PBS som innehåller 3% bovint serum albumin (BSA).
- Bered 1 mL av livskraft lösningen genom att späda 1 μL fixerbar livskraft färg i 1 mL PBS.
2. melanocyt och fibroblast isolering
- Euthanize 0 till 4 dag gamla manliga och/eller kvinnliga C57Bl/6J valpar genom halshuggning och ta bort extremiteter från euthanized möss med kirurgisk sax.
- I ett laminärt flöde skåp, rulla snabbt stammen av varje mus i en steril petriskål som innehåller 70% etanol. Ta bort stammen från etanol och placera den i en tom, steril petriskål.
- Använda kirurgisk sax, steriliseras i 70% etanol, gör ett snitt i huden på den ventrala sidan av stammen från halsen till svansen. Skala huden från bakluckan på musen med hjälp av sterila tång.
- Placera huden dermis sida ner i en 6-väl skålen som innehåller 3 mL 1x antibiotika/antimykotisk lösning och inkubera i rumstemperatur för 2-3 min.
- Slå på vävnaden Chopper med följande inställningar på plats: slice tjocklek: 1 μm; Blad kraft: ~ 60% av den maximala; Hastighet: ~ 50% av max.
- Överför huden, dermis sida ner, till en steril vävnad Chopper disk och passera huden helt genom den aktiverade vävnad Chopper 3 gånger.
- Överför den homogeniserade huden till ett sterilt, 15 mL koniskt rör som innehåller 3 mL Huddigestionbuffert. Blanda den resulterande suspensionen genom att Pipettera upp och ner 10-15 gånger med en P1000 micropipett.
- Locket den koniska röret och inkubera provet i en 37 ° c vattenbad i 15 min, Invertera röret varje 3-5 min.
- Pelleten cellerna i huden Homogenisera genom centrifugering det koniska röret i en svängig hink rotor vid 750 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Med hjälp av en P1000 micropipett, långsamt och helt ta bort huden rötnings bufferten är noga med att inte störa pelleten.
Anmärkning: En del av hela huden kan sparas i detta skede och användas som en kontroll för steg 3: bekräftelse av cellulär renhet. Sila dessa celler genom en 70 μm cell sil och sedan börja i steg 3,5 för vidare bearbetning. - Grundligt Omsuspendera cellpelleten i 1 mL Melanocytmedia genom att Pipettera upp och ner 15-20 gånger med en P1000-mikropipett. Tillsätt den resulterande cell lösningen droppvis till en obestruket brunn av en 6-väl skålen som innehåller 1 ml melanocyte media.
- Placera den pläterade huden homogenisering i en vävnadsodling inkubator inställd på 37 ° c och 5% CO2. Låt kulturerna Inkubera för 40 min.
Anmärkning: Under denna tid, vissa fibroblaster i huden homogena kommer att följa den obestruket skålen medan melanocyter och keratinocyter kvar i suspensionen. - Överföra kulturen supernatanten från obestruket skålen till en brunn av en förtvättad, kollagen-belagda 6-väl skålen. Tillsätt G418 till medierna så att den slutliga koncentrationen är 100 ng/mL.
- Tillsätt 2 ml fibroblast media till en brunn av obestruket skålen, som nu innehåller anhängare fibroblaster.
- Inkubera båda kulturer över natten i en vävnadsodling inkubator inställd på 37 ° c och 5% CO2.
- Separat aspirera media och allt skräp från varje kultur, 16-24 h efter plätering. Tvätta varje maträtt två gånger med 1 mL steril PBS, och tillsätt sedan 2 mL färsk melanocyte Media Plus 100 ng/mL G418 till melanocytkulturen och 2 mL färsk fibroblast media till fibroblast kulturen.
- Efter melanocyte kulturer har behandlats med G418 för 48 h, tvätta cellerna två gånger med 1 mL steril PBS och tillsätt 2 mL färskt melanocyte media utan G418 till kulturen.
Anmärkning: Som fibroblaster i melanocyte kulturen fortsätter att dö ut efter G418 behandling, tvätta skålen med steril PBS att ta bort döda celler och tillsätt färska melanocyte media. Melanocyte och fibroblast kulturer bör blint när de når 70-80% confluency.
3. bekräftelse av cellulär renhet
- Aspirera media från varje kultur och tvätta omsorgsfullt varje maträtt med 1 mL steril PBS.
- Tillsätt 0,7 mL 0,25% trypsin till varje kultur och inkubera kulturerna i trypsin vid 37 ° c och 5% CO2 under 1 min.
- Ta bort cellerna genom att Pipettera trypsin mot botten av skålen med en P1000 micropipett.
- Tillsätt 0,7 mL av lämpligt medium till varje trypsinized kultur och överför cell lösningen till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
- Pelleten cellerna genom centrifugering vid 750 x g för 2 min vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten med en P1000-mikropipett.
Anmärkning: Steg 3.1-3.5 kan användas för passage melanocyte och fibroblastkulturer. Den resulterande pelleten bör återsuspenderas i lämpliga medier och placeras i en ny, obestruket (fibroblaster) eller förtvättad, kollagen-belagda (melanocyter) skålen. - Omsuspendera cellpelleten i 0,5 mL iskall PBS.
- Räkna upp och överföra 500 000 celler till en pre-kyld 1,5 mL microcentrifug röret.
- Upprepa steg 3,5 och sedan Omsuspendera cellerna i 100 μL genomförbarhet lösning. Inkubera cellsuspensionen i 30 minuter vid 4 ° c i mörker.
- Upprepa steg 3.5-3.6 två gånger.
- Upprepa steg 3,5 och fixera sedan cellerna genom att rekyl pelleten i 100 μL av iskall 4% Paraformaldehydlösning. Inkubera suspensionen i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Upprepa steg 3,5 två gånger, varje gång du återupplägger pelleten i 0,5 mL 3% BSA i 1x PBS.
- Upprepa steg 3,5, sedan Omsuspendera cellpelleten i 100 μL av 0,1% saponin lösning. Inkubera suspensionen i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Upprepa steg 3,5, sedan Omsuspendera cellpelleten i 100 μL av 0,1% saponin lösning som innehåller 0,5 μg kanin anti-gp100 antikropp, 0,5 μg kanin anti-fibroblast-specifika protein 1 (FSP1) antikropp och 0,025 μg mus anti-cytokeratin 14 (k14) antikropp. Inkubera suspensionen i 1 h vid rumstemperatur i mörker.
Anmärkning: Medan k14-antikroppen köptes förkonjugerat till Alexa fluor 647 konjugerades gp100-och FSP1-antikropparna till CF 555 respektive CF 488. Infärgning av kontrollpopulationer bör också inledas i detta steg. Kontroll cells populationer bör isoleras från kulturen och bearbetas enligt beskrivningen i steg 3.5-3.12. - Upprepa steg 3,11 två gånger för att ta bort obunden antikropp.
- Upprepa steg 3,5, sedan Omsuspendera cellpelleten i 200-400 μL med 3% BSA i 1x PBS.
- Passera cellen lösningen genom en 40 μm cell SIL i en 5 mL polystyren rund-botten röret och analysera de ansträngda cellerna med flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manliga och kvinnliga C57Bl/6J möss var euthanized på postnatal dagar 0-4 och truncal huden utsattes för mekanisk dissociation som beskrivs ovan. Efter hackning, bildade huden en trögflytande flytgödsel saknar några tecken på strukturell vävnad. Centrifugering av denna flytgödsel resulterade i bildandet av en stor cell pellet i botten av det koniska röret och ett skikt av fett flyter ovanpå supernatanten. Detta fettlager förkastades med supernatanten medan kvarvarande cellpelleten återsuspenderas och överfördes till en obelagd brunn av en 6-välskål. Den höga densiteten av celler orsakade att mediet visades grumligt. Men efter 40 min av inkubering, större cell-och vävnads konglomerat observerades i medierna och anhängare fibroblaster kunde ses med en inverterad ljusmikroskop (figur 1).
De icke-anhängare celler från fibroblast kulturen överfördes till en brunn av en kollagen-belagda 6-väl skålen för att isolera melanocyter. Tillsats av G418 dödade alla kvarvarande fibroblaster i homogena, lämnar många döda celler flyter i medierna för de kommande 5 dagarna (figur 2A-C). Efter 4-5 dagar av tillväxt, den pläterade melanocyter började ta på en stereotypa dendritiska fenotyp med melanocytiska granulat (figur 2C). Denna fenotyp kvarstod efter passaging av kulturen (figur 2D). Medan kluster av kontaminerande keratinocyter observerades initialt i melanocytkulturer (figur 2A), var dessa populationer förlorade vid efterföljande passaging.
Flödescytometriska analyser användes för att bekräfta renheten hos de resulterande primära melanocyte-och fibroblastkulturerna. C5N mus keratinocyter17, dag 10 primära melanocyte kulturer och dag 6 primära fibroblast kulturer färgas med: anti-gp100 (differentierade melanocyter), anti-cytokeratin 14 (k14; keratinocyter) och anti-fibroblast-specifikt protein 1 ( FSP1 fibroblaster) (figur 3). I dessa celler, gp100 färgning var specifik för de primära melanocyterna, medan FSP1 positivitet observerades endast i fibroblaster (figur 3A, B). Uttryck för k14 begränsades till C5N keratinocyter (figur 3C). Ytterligare analyser utfördes för att bestämma renheten hos våra melanocytkulturer 1, 2, 3, 4 och 10 dagar efter isoleringen (figur 4). Kombinerad fibroblast och keratinocyt förorening översteg aldrig 25% av de totala cellerna i kulturen (figur 4B, C). Ändå observerades dramatiska ökningar i gp100 inte förrän den fjärde dagen i kulturen (figur 4A). Vi tillskriver denna observation till reducerat uttryck av gp100 i melanocytprekursorer (dvs. melanoblasts), av vilka många förefaller helt differentiera vid dag 10 i kulturen (figur 4a). Sammanfattnings Visa visar dessa data att vårt protokoll för snabb isolering samtidigt producerar kulturer berikade för melanocyter och fibroblaster.
| Steg # | Reagens | 1 valp | 5 valpar |
| 1,1 | Kollagen lösning | 1,5 mL | 4,5 mL |
| 1,2 | Plåt storlek | 6-well | 10 cm |
| 1,4 | Antibiotika/antimykotisk lösning | 3 mL | 15 mL |
| 1,5 | Huduppslutning buffert | 3 mL | 15 mL |
| 1,6 | Melanocyte Media | 6 mL | 30 mL |
| 1,7 | Fibroblast Media | 4 mL | 20 mL |
Tabell 1: förberedelse guide för reagenser för olika kohort storlekar.
Figur 1 : Representativa bilder av primära murina fibroblastkulturer. Visas 20x bilder av fibroblaster omedelbart efter isolering (A), samt 24 (B) och 48 (C) h efter isolering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av primära melanocytkulturer. Visas är 20x bilder av melanocytkulturer 1 (a), 2 (B) och 4 dagar (C) efter isolering. Kontaminerande keratinocyter indikeras med pilen i "A". Drepresentativ bild av primära melanocytkulturer efter passaging. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Flödescytometriska bedömningar av kulturens renhet. Representativa histogram visar gp100 (A; differentierade melanocyter), FSP1 (B; fibroblaster) och k14 (C; keratinocyter) positivitet i primära melanocyter (dag 10), primära fibroblaster (dag 6) och C5N keratinocyter. Efter gating på levande celler, 10 000 händelser analyserades från varje population. Enda färg kontroller användes för kompensation och den resulterande data visualiserades med FlowJo programvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Tid kurs analys av melanocytrenhet. Representativa histogram som visar melanocytrenhet 1-10 dagar efter initial isolering. Proverna färgas, analyseras och graferas enligt beskrivningen i figur 3. Positiva och negativa kontrollpopulationer var följande: gp100--humana melanocyter (+), primär murina fibroblaster (-); FSP1--primär murina fibroblaster (+), mänskliga melanocyter (-); K14--C5N celler (+), humana melanocyter (-). Den genomsnittliga positiviteten och standardavvikelsen för minst tre distinkta melanocytkulturer visas i det övre högra hörnet på varje graf. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in vitro-kulturen av primära melanocyter och fibroblaster har lett till betydande framsteg i vår förståelse av hudbiologi och sjukdom. Detta protokoll förbättrar på tidigare melanocyte isoleringsmetoder genom att minska den tid och tekniska kunniga som behövs för att generera konsekventa melanocyte kulturer samtidigt som den möjliggör samtidig isolering av hud fibroblaster. En roman, tidsbesparande inslag i detta förfarande är att dermis och epidermis inte behöver separeras. Istället, hudceller isoleras med hjälp av konsekvent hugga kraft och granularitet av en mekanisk vävnad Chopper tillsammans med selektiva medier och plätering tekniker. Genom att minska bearbetningen komplexitet och hands-on tid, detta förfarande gör det också möjligt för forskare att genomföra storskaliga experiment effektivt.
Vi rekommenderar flera steg för att öka avkastningen och konsekvens med hjälp av detta protokoll. Först, före steg 2,4, vi rekommenderar att du använder böjda tång att skrapa bort någon fettvävnad från dermal sida av huden. Denna process kommer att minska fett kakan bildas efter centrifugering. Nästa, ordentlig mekanisk dissociation av huden är avgörande för framgången för detta protokoll och kan förbättras genom att rotera Homogenisatorer disk ~ 60 ° efter varje pass av bladet. Ett annat nyckelsteg är att se till att alla Hudsammanfattningsbufferten tas bort i steg 2,10. Underlåtenhet att göra detta kommer att hindra cellernas vidhäftning till skålen och avsevärt minska avkastningen. Eftersom pelleten inte är ordentligt fäst på botten av 15 mL koniska röret i steg 2,10, kan cellerna lätt aspireras om supernatanten inte långsamt avlägsnas. Om noggrann borttagning av huden uppslutning buffert är en utmaning, föreslår vi tvätta pelleten i 2-3 mL av melanocyte media och sedan upprepa steg 2.9-2.10 före plätering. Slutligen, när återupplivar cellpelleten i steg 2,11, är det viktigt att Pipettera kraftigt för att bryta upp några klumpar och se till att cellerna fördelas jämnt på ytan av cellkultur skålen. Skräp och döda celler kommer att observeras i kulturen under de första dagarna efter isoleringen. Dessa döda celler kan hindra tillväxten av kulturen och bör avlägsnas genom att tvätta skålen med PBS och sedan lägga till färska medier.
Detta protokoll beskriver en metod för att generera primära melanocyte och fibroblast kulturer från en enda mus. Förfarandet kan dock justeras effektivt för att rymma större kohorter av möss (se tabell 1). För större kohorter, kombinera huden homogena från 4-5 pups resulterar i en 30-40% konfluenta 10 cm maträtt av melanocyter inom 4-5 dagar av isolering. Flera tekniker kan användas för att effektivisera detta protokoll när man arbetar med flera djur. Först, vi euthanize vanligtvis djuren i uppsättningar av fyra, bearbetning två djur i taget. Vi har funnit att homogeniserad hud från två pups kan kombineras i steg 2.7-2.8 genom att öka volymen av huden Digest buffert till 6 mL. För att spara tid, börjar vi isolera huden från nästa par valpar medan den första uppsättningen genomgår homogenisering och matsmältning. Denna metod säkerställer att cellpopulationer isoleras strax efter eutanasi och minskar bearbetningstiden som krävs för flera djur. När du arbetar med äldre möss (i.e., postnatal dagar 2-4), vi har funnit att passerar huden en fjärde gång genom aktiv vävnad Chopper (steg 2,6) förbättrar hudens homogenisering och cellulära avkastning. Med hjälp av denna teknik, vi ser ingen åldersberoende skillnad i melanocyten eller fibroblast avkastning.
Detta protokoll Detaljer hur man samtidigt generera fibroblast och melanocyte kulturer från samma hudprov. Vi har observerat att keratinocyter i den initiala melanocytkulturen förblir kvar till skålen när kortsiktig trypsinization utförs tillsammans med den kraftfulla fördrivning av melanocyter (se steg 3.2-3.3). Även om vi inte har optimerat spridningsmetoder för dessa kvarvarande celler, vi hypotes om att fortsatt kultur av sådana anhängare populationer i keratinocyter Media kompletteras med 100 ng/mL G418 kan resultera i en berikad cellpopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 till C.E.B.) och Pelotonia (B.M.M.) för ekonomiskt stöd. Vi är tacksamma mot C. Haines och C. Wormsbaecher som lämnat synpunkter för att förbättra manuskriptet texten. Detta arbete dragit nytta från Ohio State Comprehensive Cancer Centers analytiska cytometry delad resurs som stöds av NIH P30 CA016058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A.
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K.
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T.
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
