Summary
Bu protokol, 0-4 gün eski farelerin derisinden melanosit ve fibroblast kültürlerini eşzamanlı olarak oluşturmak için hızlı bir yöntem özetliyor. Bu primer kültürler, cilt hücresi biyolojisi, pigmentasyon, yara iyileşmesi ve melanom dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili süreçlerin çeşitli çalışma için muhafaza ve manipüle edilebilir.
Abstract
Fibroblast veya melanosit fonksiyonunda hatalar, zayıf bariyer fonksiyonu, arızalı yara iyileşmesi, pigmentasyon kusurları ve kanser gibi cilt hastalıkları ile ilişkilidir. Bu hastalıkların anlaşılması ve iyileştirilmesi için hayati önem taşıyan primer fibroblast ve melanosit kültürlerinde deneyler vardır. Bununla birlikte, melanosit izolasyonu için geçerli protokoller cildin Epidermal ve dermal katmanlarının tripsinize ve el ile ilişkilendirilmemiş olmasını gerektirir. Bu işlem zaman alıcı, teknik olarak zorlu ve tutarsız verimler katkıda bulunur. Ayrıca, aynı zamanda aynı doku örneğinden saf fibroblast kültürlerini aynı anda oluşturmak için yöntemler kolayca kullanılabilir değildir. Burada, postnatal günlerde 0-4 farelerin derisinden melanosit ve fibroblastlar izole etmek için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokolde, tüm cilt mekanik bir doku helikopteri kullanılarak homojenize ve sonra kısaca kolajenaz ve tripsin ile sindirilir. Hücre nüfusu daha sonra seçici kaplama ile G418 tedavi takip izole edilir. Bu prosedür, tek bir fareyle 90 dakikadan az bir sürede tutarlı melanosit ve fibroblast verimleri ile sonuçlanır. Bu protokol de kolayca ölçeklenebilir, araştırmacılar el-zamanında önemli bir artış olmadan hayvanların büyük Kohortlar işlemek için izin. Bu protokol kullanılarak kurulan kültürlerin melanosit veya fibroblastlar için son derece zenginleşmesini sağlayan akış cytometrik değerlendirmelerini gösteriyoruz.
Introduction
Mammalin derisi, vücudu yabancı patojenlere ve ultra menekşe ışınlarına (UVR) karşı koruyan çok katmanlı bir organıdır. Deri aynı zamanda yara iyileşmesi, sıcaklık düzenlemesi ve D vitamini üretimi1,2,3gibi homeostatik süreçlerde de kritik bir rol oynar. Memeli cilt üç büyük hücre türlerinden oluşur: melanosit, fibroblastlar ve keratinositler. Bu hücre türleri cildin farklı katmanlarını doldurur, epidermis yapan keratinositler, dermis ve melananosit epidermal-dermal kavşak ve saç folikülleri lokalize yaşayan fibroblastlar4. Burada, duvar derisinden primer melanosit ve fibroblast kültürlerinin eşzamanlı üretimi sağlayan basit bir prosedür ayrıntılarıyla.
Melanosit, bazal epidermis, İris, koklea, beyin ve saç folikülleri5de dahil olmak üzere insan vücudu boyunca birçok yerde bulunan pigment üreten hücrelerdir. Melanositlerin primer işlevi, melanom5,6olarak adlandırılan melanin içeren veziküller oluşturmak ve salgılayacaktır. Melanosomes melanin iki ana sınıfları içerir: kahverengi/siyah eumelanin ve sarı/kırmızı pheomelanin5/6. Melanosit içinde biyokimyasal süreçler her melananin türünün göreceli bolluk düzenleyen ve saç belirlemek için yardım, cilt ve göz rengi8,9. Melanin de UVR absorbe ve mutagenez10güneş maruz dokular korumak için hizmet vermektedir.
Melanosit disfonksiyon pigmente kusurları neden olabilir ve cilt kanseri duyarlılığını artırabilir. Örneğin, hiper-pigmentli cilt melazma karakteristik yamalar fokal melanin aşırı üretim sonucudur, ancak germline genetik mutasyonlar, melanin sentezi, albinizm neden katılan genler taviz11,12 . Melanosit biyolojisinin samimi bilgisi, bu tür pigmente kusurları düzeltecek ve sonuçta bu hastalıklarla oluşan bireylerin psikososyal refah kalitesini artıran stratejiler geliştirmek için gereklidir. Melanin üretimindeki açıkları ve/veya feomelanin Tercihli sentezini de artan cilt kanseri riski ile ilişkilidir10. Bu risk düşük UVR koruma6,13sonucu olduğuna inanılmaktadır. Böylece, melanositlerde eumelanin üretimini geliştirmek veya geri yüklemek için yöntemler bu nüfusun cilt kanseri insidansı azaltabilir.
Mezenkimal fibroblastlar cilt14dermal tabakası dahil olmak üzere vücudun tüm organları için bağ dokusu ve yapısal destek kurmak. Kollajen, elastin, laminin ve fibronektin gibi proteinlerin atılımı, fibroblastların doku bütünlüğü için gerekli olan (ECM) ekstrellüler matrisini oluşturmaya olanak tanır1,14. Fibroblastlar da yara iyileşmesi, inflamasyon, anjiyojenez ve kanser oluşumu/ilerlemesi1,15,16gibi süreçlerde temel roller oynar.
Melanositlere benzer şekilde, fibroblast aktivasyonu ve fonksiyonunda kusurlar tümörijenezde ve hastalığı teşvik edebilir. Örneğin, uygunsuz fibroblast aktivasyonu genellikle fibrozis oluşumuna yol açar ve bu da aşırı ECM bileşenlerinin çevreleyen dokuya gelişmiş birikmesinden kaynaklanan. Fibroblastlar vücudun yapısal bütünlüğünü çok koruyup, fibrozis idiyopatik pulmoner fibrozis, sistemik skleroz, karaciğer sirozu ve kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere çok sayıda doku ve organı etkileyen hastalıkları teşvik etmektedir15. Fibroblastlar da kanserde kritik rol oynamaktadır16. Kanser ilişkili fibroblastlar (CAFs) birçok tümörlerin mikroortamında en bol olmayan malign hücreler. Cafs doku sertliği, yerel sitokin üretimi ve bağışıklık fonksiyonu16modüle tarafından tümör proliferasyonu, progresyon ve terapötik direnç teşvik gösterilmiştir.
Primer Hücre kültürleri, hastalıklara yol açacak melanosit ve fibroblast kusurları tanımlamak ve azaltmak için genetiği izlenmeli modeller ile araştırmacılar sağlar. Ancak, melanosit kültürlerini kurmak için geçerli yöntemler zaman alıcı ve teknik olarak zordur. Tripsinizasyon ve epidermis ve dermis hassas ayrılması için ihtiyaç deneysel verim değişkenliğine katkıda bulunur ve zor büyük ölçekli deneyler gerçekleştirmek için yapar. Ayrıca, protokollerin aynı anda tüm cildin melanosit ve fibroblastları izole etmek için şu anda alanda eksik.
Aynı tüm cilt örneğinden melanosit ve fibroblast kültürlerini kurmak için gereken işlem adımlarını, değişkenliği ve zamanı azaltmak için bir yöntem geliştirdik. Kısa bir sindirimi takiben mekanik homojenizasyon yöntemi kullanılarak, stratejimiz, eşzamanlı fibroblast yalıtımı sağlayarak primer melanositlerin yalıtılması için gerekli olan el süresini önemli ölçüde azaltır. Artan hız, verimlilik ve bu protokol tutarlılık, 0-4 gün eski fareler melanosit yalıtma yeteneği ile birlikte, araştırmacılar daha önce mümkün olandan daha geniş bir dizi denemeler yapmak için esneklik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu veya hayvanları içeren başka bir çalışma başlamadan önce kurumsal hayvan etiği komitesinden onay alın. Bu protokolde gerçekleştirilen deneyler Ohio State Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıayuc, protokol #2012A00000134) tarafından onaylanmıştır.
1. protokol hazırlığı
Not: Aşağıdaki reaktif hazırlama talimatları tek bir fareyle 9 cm2 melanosit ve fibroblast kültürlerinin oluşturulması için uygundur. Daha büyük ölçek yalıtımları için Tablo 1 ' deki reaktif hazırlama kılavuzuna bakın.
- 0,1 M buzul asetik asit içinde 50 μg/mL kollajen içeren kollajen çözeltisi 1,5 mL hazırlayın.
- Bir laminar akış kabininde, 8 μg/cm2 (1,44 ml) kollajen çözeltisi ile 6-iyi hücre kültürü çanak bir kat iyi. İyi tamamen kollajen solüsyonu ile kaplıdır emin olun. Çanak, 37 °C ' de 3 saat veya 4 °C ' de bir gecede. Kullanım öncesinde, 1,35 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) (1 cm2başına 150 μL) ile kollajen kaplamalı kuyusu iki kez yıkayın.
- Dikkatle doku Chopper platformuna bir doğrama diski yerleştirerek ve taşınabilir kol steril bir bıçak güvenliğini sağlayarak bir laminar akış kabine doku Chopper birleştirin.
- Steril PBS 'de 100x antibiyotik/Antimikotik stok çözeltisi seyreltilerek 3 mL 1x antibiyotik/Antimycotik çözelti hazırlayın.
- Hazırlamak 3 ml taze cilt sindirim tampon içeren 10% fetal Sığır serum, 1% penisilin/streptomisin çözeltisi, 1% L-glutamin, 10 mg/ml kolajenaz tip ı, 0,25% domuz tripsin ve 0,02 mg/ml deoksirribonuclease ı rpmi 1640.
- Hazırlamak 6 ml taze melanosit medya içeren 10% fetal sığır serumu, 7% at serumu, 1% penisilin/streptomisin çözeltisi, 1% L-glutamin, 0,5 mm di-butyryl döngüsel amfi (dbcamp), 20 Nm tetradecanoylphorbol 13-asetat (TPA) ve 200 PM Kolera toksin (CT) Besin Mix F-12 ham 'ın medya.
Not: Konsantre dbcAMP, TPA ve CT hisse senedi çözümleri, > 1 yıl-80 °C ' ye kadar alınabilir ve depolanabilir. Bu bileşenlerin bulunmayan temel medya 4 °C ' de 1 aya kadar depolanabilir. - % 10 fetal sığır serumu, 1% penisilin/streptomisin ve Dulbecco 'nun değiştirilmiş kartal ortamında% 1 L-glutamin içeren 4 mL fibroblast medya hazırlayın. Bu medya 1 aya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
- PBS 'de% 16 civarında formaldehite seyreltilerek 40 ml% 4 civarında formaldehite çözeltisi hazırlayın. 4 °C ' de 1 ay veya-20 °C ' ye kadar 1 yıla kadar herhangi bir fazlalığını saklayın.
- Saponin tamamen çözünene kadar 37 °C ' de 50 mL PBS 'de 0,5 g saponin karıştırılarak% 1 saponin stok solüsyonu hazırlayın. 0,2 μm PES filtresine sahip 50 mL şırıngayı kullanarak uzun süreli depolama için solüsyonu sterilize edin. Elde edilen saponin stok çözeltisi 1 ay boyunca 4 °C ' de tutulabilir.
- % 3 Sığır serum albümin (BSA) içeren PBS 'de% 1 saponin stok çözümünü seyreltilerek, fare başına 200 μL% 0,1 saponin çözeltisi hazırlayın.
- 1 ml PBS 'de 1 μL düzeltilebilir canlılığı boya seyreltilerek 1 ml canlılığı solüsyonu hazırlayın.
2. melanosit ve fibroblast yalıtım
- Ötenize 0-4 gün-yaşlı erkek ve/veya kadın C57Bl/6J pups delevite ve cerrahi makas kullanarak ötenize fareler ekstremite kaldırın.
- Bir laminar akış kabininde, kısaca% 70 etanol içeren steril Petri çanak her fare gövde rulo. Etanol gelen gövde çıkarın ve boş, steril Petri çanak içine yerleştirin.
- 70% etanol içinde sterilize cerrahi makas kullanarak, kuyruk boyun başlayarak gövdenin ventral tarafında cilt bir kesi yapmak. Steril forseps kullanarak fare gövdesinin cilt soyma.
- Cilt DermIS yan aşağı yerleştirin 6-iyi yemek içeren 3 mL 1x antibiyotik/Antimikotik eriyik ve oda sıcaklığında inkük 2-3 dk.
- Aşağıdaki ayarlarla doku helikopterini açın: dilim kalınlığı: 1 μm; Bıçak kuvveti: ~% 60 maksimum; Hız: ~% 50 maksimum.
- Cilt, dermis yan aşağı, steril bir doku helikopter diske aktarın ve tamamen aktif doku helikopter aracılığıyla cilt geçmek 3 kez.
- Homojenize deri steril, 15 mL konik Tüp 3 mL cilt sindirim tampon içeren aktarın. Bir P1000 mikropipet ile 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme elde edilen süspansiyon karıştırın.
- Konik tüpü kap ve numuneyi 37 °C ' lik su banyosuna 15 dakika boyunca, her 3-5 dakikada bir tüp ters çevirir.
- Cilt hücreleri Pellet bir sallanan kova rotor içinde konik tüp santrifüpleme tarafından Homojenat 750 x g oda sıcaklığında 5 dakika.
- Bir P1000 mikropipet kullanarak, yavaşça ve tamamen cilt sindirim tampon Pelet rahatsız etmek için dikkatli olmak kaldırmak.
Not: Tüm cildin bir kısmı bu aşamada kaydedilebilir ve adım 3 için bir kontrol olarak kullanılan: hücresel saflık onayı. Bir 70 μm hücre süzgeci ile bu hücreleri strain ve daha sonra adım 3,5 daha fazla işleme için başlar. - Bir P1000 mikropipet ile 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetleme tarafından 1 ml melanosit medya hücre Pelet iyice pelletini. Elde edilen hücre solüsyonu, 1 mL Meloksit medya içeren 6-kuyu çanak kaplanmamış bir iyi dropwise ekleyin.
- 37 °C ve% 5 CO 2 ' de yer alan bir doku kültürü kuluçteninde kaplama cilt homojenini yerleştirin. Kültürler 40 dk için inkübe izin verin.
Not: Bu süre zarfında, melanosit ve keratinositler askıya alınırken deri Homojenat bazı fibroblastlar kaplanmamış çanak uyacaktır. - Kültür süpernatant kaplanmamış çanak bir iyi bir önceden yıkanmış, kollajen kaplı 6-well yemek aktarın. Son konsantrasyon 100 ng/mL gibi ortama G418 ekleyin.
- Şimdi yapışan fibroblastlar içeren, kaplamasız yemeğin bir kuyusu için fibroblast medya 2 mL ekleyin.
- 37 °C ' de ve% 5 CO2' de bulunan bir doku kültürü küvatörü içinde her iki kültürü de kuluçat.
- Ayrı olarak medya ve her kültürden herhangi bir enkaz Aspire, 16-24 h kaplama sonra. 1 mL steril PBS ile iki kez her çanak yıkayın ve sonra 2 mL taze melanosit medya artı 100 ng/mL G418 melanosit kültürü ve 2 mL taze fibroblast medya fibroblast kültüre ekleyin.
- Melanosit kültürler 48 h için G418 ile tedavi edildikten sonra, iki kez steril PBS 1 mL ile hücreleri yıkayın ve kültür için G418 olmadan taze Meloksit medya 2 mL ekleyin.
Not: Melanosit kültüründeki fibroblastlar Post-G418 tedavisi dışında ölmeye devam ederken, ölü hücreleri kaldırmak ve taze melanosit Media eklemek için steril PBS ile çanak yıkayın. Melanosit ve fibroblast kültürler% 70-80 konfluency ulaştığında geçmeli.
3. hücresel saflık onayı
- Her kültürden medyayı aspirate ve her çanak 1 mL steril PBS ile dikkatlice yıkayın.
- Her kültürde% 0,25 tripsin 0,7 ml ekleyin ve 37 °c ' de tripsin kültürlerini ve 1 dakika boyunca% 5 Co2 ' sini inküyeyin.
- Bir P1000 mikropipet kullanarak çanak alt karşı tripsin pipetleme hücreleri dislodge.
- Her tripsinized kültür için uygun medya 0,7 mL ekleyin ve bir 1,5 mL mikrosantrifüjle tüp içine hücre çözümünü aktarın.
- Oda sıcaklığında 2 dakika için 750 x g 'de santrifüjleme ile hücreleri Pellet. Bir P1000 mikropipet kullanarak süpernatant dikkatle kaldırın ve atın.
Not: 3.1-3.5 adımlar melanosit ve fibroblast kültürlerine geçiş için kullanılabilir. Elde edilen Pelet uygun medyada resuspended ve yeni bir yerleştirilir olmalıdır, kaplanmamış (fibroblastlar) veya önceden yıkanmış, kollajen kaplı (melanosit) çanak. - 0,5 ml buz-soğuk PBS içinde hücre Pelet resuspend.
- 500.000 hücreleri önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne numaralandırın ve aktarın.
- 3,5 adım yineleyin ve sonra 100 μL viability çözüm hücreleri yeniden pelletini. Hücre süspansiyonunu karanlıkta 4 °C ' de 30 dakika boyunca inküat.
- 3,5-3.6 arasındaki adımları iki kez yineleyin.
- Adım 3,5 tekrarlayın, daha sonra 100 μL buz soğuk% 4 Paraformaldehyde çözeltisi içinde Pelet resuspending tarafından hücreleri düzeltin. Süspansiyonu, karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kulyatın.
- Adım 3,5 iki kez yineleyin, her seferinde 1x PBS 'de 0,5 mL% 3 BSA 'da Pelet resuspending.
- 3,5 adım yineleyin, sonra 100 μL% 0,1 saponin çözeltisi içinde hücre Pelet pelletini. Süspansiyonu, karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kulyatın.
- Adım 3,5 tekrarlayın, sonra 100 μL içinde 0,1% saponin çözümü, tavşan Anti-GP100 antikor, 0,5 μg tavşan Anti-fibroblast-spesifik protein 1 (FSP1) antikor ve 0,025 μg fare Anti-sitozatin 14 (K14) antikor içeren 0,5 μg hücre Pelet pelletini. Süspansiyon, karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkük.
Not: K14 antikor Alexa Fluor 647 için önceden konjuç satın alındığında, GP100 ve FSP1 antikorları sırasıyla CF 555 ve CF 488 ' ye konjuç edildi. Kontrol nüfuslarının boyama da bu adımda başlaması gerekir. Denetim hücresi nüfusu kültürden yalıtılmış ve 3.5-3.12 adımlarda açıklandığı gibi işlenir. - Herhangi bir ilişkisiz antikor kaldırmak için iki kez adım 3,11 yineleyin.
- 3,5 adımı tekrarlayın, sonra da 1x PBS 'de 200-400 μL 'de% 3 BSA 'da hücre Pelet 'ini yeniden pelletini.
- 40 μm hücre süzgeci ile hücre çözümünü 5 mL polistiren yuvarlak alt tüpüne geçirin ve Akış sitometrisi ile gergin hücreleri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erkek ve kadın C57Bl/6J fareler postnatal günlerde ötenize edildi 0-4 ve kesme cildi yukarıda açıklandığı gibi mekanik ayrışma maruz kalmıştır. Doğrama sonrasında, cilt herhangi bir yapısal doku belirtisi bulunmayan viskoz bir bulamaç oluşturdu. Bu Bulamaç santrifüjleme konik tüp altında büyük bir hücre peleti oluşumu ve süper natant üzerinde yüzen adipoz bir katman sonuçlandı. Kalan hücre Pelet resuspended ve 6-well çanak bir kaplanmamış iyi transfer iken bu yağ tabakası süpernatant ile atıldı. Hücrelerin yüksek yoğunluğu ortam bulutlu görünmesini neden oldu. Bununla birlikte, 40 min. İnkübasyon sonrasında medyada daha büyük hücre ve doku konglomeraları gözlendi ve bağlı fibroblastlar tersine çevrilmiş bir ışık mikroskobu ile görülebilir (Şekil 1).
Fibroblast kültüründen bağlı olmayan hücreler, melanosit yalıtmak için bir kollajen kaplı 6-well çanak bir iyi transfer edildi. G418 eklenmesi Homojenat kalan herhangi bir fibroblastları öldürdü, sonraki 5 gün için medyada çok sayıda ölü hücre yüzen bırakarak (Şekil 2A-C). 4-5 gün sonra büyüme, kaplama melanositler melositik granül ile bir stereosital dendritik fenotipi üzerinde almaya başladı (Şekil 2C). Bu fenotip kültür geçişin sonra kalıcı (Şekil 2D). Keratinositlerin kirletici kümeleri başlangıçta melanosit kültürlerinde gözlenen iken (Şekil 2A), bu nüfus sonraki paslanma üzerine kayboldu.
Elde edilen primer melanosit ve fibroblast kültürlerinin saflığını onaylamak için akış cytometrik analizler kullanılmıştır. C5N fare keratinositler17, gün 10 primer melanosit kültürler ve gün 6 primer fibroblast kültürler ile lekelenmiş edildi: Anti-GP100 (farklılaşmış melanosit), Anti-sitokeratin 14 (K14; keratinositler) ve anti-fibroblast özgü protein 1 ( FSP1; fibroblastlar) (Şekil 3). Bu hücrelerde, GP100 boyama primer melanositlere özeldir, FSP1 pozitifliği sadece fibroblastlar içinde gözlenmiştir (Şekil 3A, B). K14 ifadesi C5N keratinositlere sınırlıdır (Şekil 3C). Melanosit Kültürlerimizin saflığını belirlemek için 1, 2, 3, 4 ve 10 gün sonra izolasyonda ek analizler yapıldı (Şekil 4). Kombine fibroblast ve keratinosit kirliliği, kültürdeki toplam hücrelerin% 25 'ini aşmadı (Şekil 4B, C). Bununla birlikte, GP100 'de dramatik artış kültürdeki dördüncü güne kadar gözlemlenmemiştir (Şekil 4A). Bu gözlem GP100 melanosit öncüleri (yani, melanblastlar), birçoğu tamamen gün 10 kültür (Şekil 4A) ayırt görünür azaltılmış ifadesine niteliyoruz. Özetle, bu veriler hızlı yalıtım protokolünün aynı anda melanosit ve fibroblastlar için zenginleştirilmiş kültürler ürettiğini göstermektedir.
| Adım # | Reaktif | 1 yavru | 5 yavrular |
| 1,1 | Kollajen solüsyonu | 1,5 mL | 4,5 mL |
| 1,2 | Plaka boyutu | 6-well | 10 cm 'lik |
| 1,4 | Antibiyotik/Antimikotik çözelti | 3 mL 'Lik | 15 mL 'Lik |
| 1,5 | Cilt sindirim tamponu | 3 mL 'Lik | 15 mL 'Lik |
| 1,6 | Melanosit medya | 6 mL 'Lik | 30 mL 'Lik |
| 1,7 | Fibroblast medya | 4 mL 'Lik | 20 mL 'Lik |
Tablo 1: farklı kohort boyutları için reaktif hazırlama kılavuzu.
Şekil 1 : Primer murine fibroblast kültürlerinin temsili görüntüleri. Gösterilen 20 x fibroblastların görüntüleri hemen yalıtım (A), yanı sıra 24 (B) ve 48 (C) h Post-Isolation. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Primer melanosit kültürlerinin temsili görüntüleri. Gösterilen melanosit kültürlerin 20X görüntüleri 1 (A), 2 (B) ve 4 gün (C) sonrası yalıtım. Kontamine keratinositler ' A ' içindeki oka göre belirtilir. (D) geçiş sonrası primer melanosit kültürlerinin temsili görüntüsü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Kültür saflık akış cytometrik değerlendirmeler. Primer melanosit (10. gün), primer fibroblastlar (6. gün) ve C5N keratinositlerde GP100 (A; farklılaşmış melanosit), FSP1 (B; fibroblastlar) ve K14 (C; keratinositler) pozitifliği gösteren temsili histogralar. Canlı hücrelerde gating sonra, 10.000 olaylar her nüfus analiz edildi. Tek renk kontrolleri tazminat için kullanıldı ve elde edilen veriler FlowJo yazılımı ile görselleştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Melanosit saflığının zaman kursu analizi. Temsili histograları gösteren melanosit saflık 1-10 gün ilk yalıtım sonra. Örnekler Şekil 3' te açıklandığı gibi lekelenmiş, analiz edilmiş ve grafiklenmiş. Pozitif ve negatif kontrol nüfus aşağıdaki gibidir: GP100--insan melanosit (+), primer murine fibroblastlar (-); FSP1--primer murine fibroblastlar (+), insan melanosit (-); K14--C5N hücreler (+), insan melanosit (-). Her grafiğin sağ üst köşesinde en az üç ayrı melanosit kültüründe ortalama pozitiflik ve standart sapma gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primer melanosit ve fibroblastların in vitro kültürü, cilt biyolojisi ve hastalığı anlayışımızda önemli gelişmelere yol açtı. Bu protokol, cilt fibroblastları eşzamanlı izolasyonu için izin verirken tutarlı melanosit kültürler oluşturmak için gerekli zaman ve teknik savvy azaltarak önceden melanosit yalıtım yöntemleri üzerine geliştirir. Bir roman, bu prosedürün zaman kazandıran unsuru dermis ve epidermis ayrı olması gerekmez olmasıdır. Bunun yerine, cilt hücreleri, seçici medya ve kaplama teknikleri ile birlikte mekanik bir doku helikopter tutarlı doğrama kuvveti ve parçalı yapı kullanılarak izole edilir. Bu prosedür, işleme karmaşıklığını ve uygulamalı zamanı azaltarak, araştırmacıların büyük ölçekli denemeleri verimli bir şekilde yürütmesini de sağlar.
Bu protokol kullanılarak verim ve tutarlılığı artırmak için birkaç adım öneririz. İlk olarak, adım 2,4 öncesinde, cildin dermal tarafındaki herhangi bir adipoz dokusunu kazımak için kavisli forseps kullanmanızı öneriyoruz. Bu süreç santrifüjleme sonrası oluşturulan yağ pastası azaltacaktır. Sonra, cildin uygun mekanik dağılma bu protokol başarısı için kritik ve homojenizer disk döndürülerek geliştirilebilir ~ 60 ° bıçak her geçişte sonra. Başka bir anahtar adım 2,10 tüm cilt Özet arabellek kaldırıldığından emin olmaktır. Bunu yapmak için başarısızlık çanak hücre yapışma engeller ve önemli ölçüde verim azaltır. Pelet, adım 2,10 içinde 15 ml konik tüpün altına sıkıca yapıştırılmadığından, süpernatant yavaşça kaldırılırsa hücreler kolayca Aspirasyona neden olabilir. Cilt sindirimi tampon kapsamlı kaldırılması bir meydan okuma ise, biz Melocyte medya 2-3 mL Pelet yıkama ve sonra adımlar 2.9-2.10 kaplama önce tekrarlanan öneririz. Son olarak, adım 2,11 hücre Pelet resuspending zaman, herhangi bir küme kırmak ve hücrelerin hücre kültürü çanak yüzeyine eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için şiddetle pipetmek önemlidir. Kalıntı ve ölü hücreler, izole edildikten sonra ilk birkaç gün içinde kültürde gözlemlenecektir. Bu ölü hücreler kültürün büyümesini engelleyebilir ve PBS ile çanak yıkama ve sonra taze medya ekleyerek kaldırılmalıdır.
Bu protokol tek bir fareyle primer melanosit ve fibroblast kültürlerini üretmek için bir yöntem özetliyor. Ancak, yordam farelerin daha büyük kohorts karşılamak için etkili bir şekilde ayarlanabilir (bkz: Tablo 1). Daha büyük kohorts için, 4-5 pups gelen cilt homojenlik birleştirerek bir 30-40%%% 100 melanositler konfluent, izolasyon 4-5 gün içinde oluşur. Birden fazla hayvan ile çalışırken bu protokolün verimliliğini artırmak için çeşitli teknikler kullanılabilir. İlk olarak, biz genellikle dört setleri içinde hayvanları ötenize, bir defada iki hayvan işleme. Biz iki pups homojenize Cilt 6 mL cilt Digest buffer hacmini artırarak 2.7-2.8 adımda kombine edilebilir bulduk. Zaman kazanmak için, ilk set homojenizasyon ve sindirim geçiren iken biz yavruları bir sonraki çifti cilt izole başlar. Bu yaklaşım, hücre nüfus ötenazi sonra izole ve birden fazla hayvan için gerekli işlem süresini azaltır sağlar. Eski Fareler (yani, postnatal gün 2-4) ile çalışırken, biz deri homojenizasyon ve hücresel verim artırır aktif doku helikopter (adım 2,6) üzerinden dördüncü kez cilt geçen bulduk. Bu tekniği kullanarak, melanosit veya fibroblast verim hiçbir yaş bağımlı fark görmek.
Bu protokol, aynı cilt örneğinden aynı anda fibroblast ve melanosit kültürlerini nasıl üretecek ayrıntıları. İlk melanosit kültüründeki keratinositlerin, kısa vadeli tripsinizasyon ile birlikte melanositlerin güçlü dislodizasyonunu gerçekleştirdiğinde çanak üzerine takılacağı gözlenmiştir (bkz. adımlar 3.2-3.3). Biz bu kalan hücreler için yayılma yöntemleri optimize edilmemiştir iken, biz keratinosit medyada bu tür yapışkan nüfusun sürekli Kültür 100 ng/mL G418 ile tamamlayıcı bir zenginleştirilmiş hücre nüfus neden olabilir hipotez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Damon Runyon Vakfı (Yenilik Ödülü #38-16-C.E.B.) ve Pelotonia (B.M.M.) mali destek için teşekkür ederiz. Biz C. Haines ve C. Wormsbaecher kim el yazması metin geliştirmek için yorum sağlanan minnettar. Bu iş Ohio Devlet kapsamlı Kanser Merkezi 'nin analitik Cytometri paylaşılan kaynak NıH P30 CA016058 tarafından desteklenmektedir benefitted.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A.
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K.
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T.
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
