Summary
Os adipocytes existem em depósitos discretos e têm papéis diversos dentro de seus microambientes originais. Como as diferenças regionais no caráter e na função do adipócitos são descobertas, a identificação estandardizada e a isolação dos depósitos são cruciais para o avanço do campo. Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a excisão de vários depósitos adiposos do rato.
Abstract
Os tecidos adiposos são órgãos complexos com uma ampla gama de funções, incluindo armazenamento e mobilização de energia em resposta às necessidades locais e globais, desacoplamento do metabolismo para gerar calor, e secreção de adipocinas para regular a homeostase de corpo inteiro e respostas imunes. A pesquisa emergente está identificando diferenças regionais importantes nos perfis desenvolventes, moleculars, e funcionais dos adipócitos situados em depósitos discretos durante todo o corpo. As propriedades diferentes dos depósitos são medicamente relevantes desde que as doenças metabólicas demonstram frequentemente efeitos depósito-específicos. Este protocolo fornecerá investigadores com um guia anatômico detalhado do Atlas e da dissecção para a identificação e a excisão reprodutíveis e exatas de vários tecidos adiposos do rato. A dissecção padronizada de depósitos adiposos discretos permitirá comparações detalhadas de suas características moleculares e metabólicas e contribuições para estados patológicos locais e sistêmicos várias condições nutricionais e ambientais.
Introduction
Os tecidos adiposos desempenham papéis críticos na homeostase do corpo inteiro, incluindo armazenamento e liberação de energia em resposta às necessidades locais e globais, termorregulação e secreção de adipocinas para regular o equilíbrio energético, metabolismo e respostas imunes1 , 2. os adipócitos são distribuídos por todo o corpo em depósitos discretos, e em alguns casos servem papéis especializados dentro de seus microambientes3,4,5. Historicamente, o estudo do tecido adiposo centrou-se no tecido adiposo branco (WAT), e seu papel na manutenção da homeostase energética. A maioria dos adipócitos são distribuídos por todo o corpo em depósitos de WAT subcutâneos e viscerais. As características desses depósitos são importantes para a suscetibilidade diferencial às doenças metabólicas. Os adipócitos subcutâneos, localizados a pele, têm sido associados a efeitos metabólicos protetores5. Os adipócitos viscerais, que cercam os órgãos vitais e estão contidos dentro dos depósitos gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental e pericárdico, estão comumente ligados a distúrbios metabólicos, incluindo diabetes tipo 2 e doença cardiovascular2 . Os tecidos adiposos marrons (BAT) também foram estudados extensivamente. Marrom e marrom-como adipócitos expressam desacoplamento proteína 1 (UCP1) e desempenham papéis importantes na termogênese adaptativa e homeostase de glicose6,7. Os adipócitos marrons clássicos estão contidos no depósito interescapular BAT8. Aglomerados de adipócitos marrons também são encontrados em outros locais, incluindo os depósitos supraclavicular, infra/subescapular, cervical, paravertebral e periaórtico8,9.
Além de sua localização em grandes depósitos de WAT e BAT, os adipócitos existem em nichos discretos em todo o corpo4, onde podem desempenhar funções especializadas dentro de seus respectivos microambientes. Por exemplo, o tecido adiposo da medula óssea (BMAT) serve como um reservatório lipídico, é uma importante fonte de Adiponectina circulante, e interage estreitamente com osteoblastos, osteoclastos e células hematopoiéticas10,11. Os adipócitos dérmicos contribuem para processos generalizados, incluindo cicatrização de feridas, resposta imune, termorregulação e crescimento do folículo piloso12,13. Além disso, os adipócitos epicárdicos podem produzir várias adipocinas e quimiocinas que exercem efeitos locais e sistêmicos no desenvolvimento e progressão da doença arterial coronariana14. A expansão do WAT inter/intramuscular tem sido positivamente correlacionada com aumento da adiposidade, resistência insulínica sistêmica e diminuição da força muscular e da mobilidade15. Além disso, os adipócitos poplíteo servem como um reservatório lipídico para expansão linfática durante a infecção16. Enquanto os papéis específicos de diferentes depósitos articulares são geralmente desconhecidos, o depósito de Hoffa (infrapatelar) dentro do joelho é agora pensado para contribuir para patologias, incluindo dor no joelho anterior e osteoartrite17.
Considerando que as diferenças regionais no caráter e na função do adipócitos estão o estudo intenso, o campo é limitado atualmente pela falta de um protocolo estandardizado para a identificação e a dissecção de depósitos de rato diversos. Os métodos previamente publicados descreveram tipicamente a isolação de um ou dois depósitos específicos e faltam o nível de detalhe exigido para a excisão uniforme18,19. O protocolo descrito neste manuscrito fornece um guia detalhado para as posições anatômicas específicas e as etapas da isolação de muitos depósitos adiposos diferentes do rato. Embora os depósitos de WAT sejam o foco preliminar deste manuscrito, a excisão do bastão interescapular é descrita igualmente em detalhe. Os tecidos adiposos extirpado usando este protocolo podem ser usados para uma grande variedade de pontos finais experimentais, incluindo estudos do explante, histologia, e análises da expressão de Gene.
O objetivo deste manuscrito é fornecer aos pesquisadores um protocolo detalhado para identificar e isolar de forma clara e precisa os depósitos de adiposo de camundongo proeminentes e menos estudados (Figura 1). Este recurso facilitará uma investigação mais completa das características desenvolventes, moleculars, e funcionais dos adipócitos dentro dos nichos diversos.
Figura 1: descrição esquemática dos depósitos adiposos do rato dissecados neste protocolo. Esta imagem foi adaptada de Bagchi et al., 20184. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os procedimentos animais são realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Michigan.
1. eutanização
Nota: Para efeitos deste protocolo de vídeo, são utilizados 4 a 6 meses de idade C57BL/6J ratos.
- Coloque o rato numa câmara de vaporizador isoflurano e ajuste o caudal de isoflurano para 5% ou superior. Continue a exposição ao isoflurano até um minuto após a respiração parar. Em seguida, retire o rato da câmara do vaporizador e confirme a eutanásia utilizando uma medida secundária aprovada.
Nota: As medidas secundárias aprovadas variam de acordo com a instituição e o protocolo animal e podem incluir luxação cervical ou decapitação. - Coloque o rato eutanasiado na bandeja de dissecção. Esterilizar as superfícies externas dorsal e ventral do rato utilizando 70% de etanol. Assegure-se de que a superfície externa do rato esteja suficientemente molhada para minimizar a contaminação da pele durante a dissecção.
2. identificação e isolamento dos principais Ddepósitos de Adipose subcutâneo (subcutâneo anterior, dorsolumbar, inguinal, glúteo) e tecido de Aadipose marrom interescapular
- Identificando e isolando a via subcutânea anterior Wat
Nota: O WAT subcutâneo anterior está localizado entre as escápulas, descendo da nuca para as axilas do camundongo7. Este depósito tem sido descrito alternativamente como o supraescapular8 ou o interescapular20 Wat e encontra-se diretamente sobre o depósito INTERESCAPULAR do bastão.- Para isolar o depósito subcutaneous anterior, coloque o rato em seu estômago em uma posição prona. Fixe os membros superiores e inferiores à bandeja de dissecção com os pinos de dissecção.
- Use fórceps para levantar a pele dorsal na nuca do pescoço. Use a tesoura da íris para fazer um pequeno (1 milímetro) cortado na pele.
- Insira uma lâmina das tesouras da íris no corte inicial e faça uma incisão vertical de linha média (2 – 3 cm) através da pele, começando na nuca e descendo ao longo da espinha até meados de trás.
- Faça duas incisões horizontais (1 cm cada) utilizando as tesouras da íris, estendendo-se lateralmente da linha média, na parte superior e inferior da incisão vertical inicial.
- Use fórceps para descascar cuidadosamente para trás a pele e expor o depósito subcutaneous anterior.
- Use a tesoura da íris para remover o depósito que segue as beiras naturais do tecido.
Nota: Este método isola o WAT subcutaneous anterior e o bastão interescapular. - Coloque o depósito dissecado na bandeja de dissecção e Retire cuidadosamente o bastão contaminante usando tesouras de íris.
- Identificando e isolando c bat elementos
Nota: O bastão clássico é localizado abaixo do depósito subcutaneous anterior de WAT.- Para isolar BAT, use a tesoura de íris para cortar horizontalmente ao longo da borda inferior do tecido subcutâneo anterior, seguindo a borda natural do depósito.
- Em seguida, use a tesoura de íris para fazer duas incisões verticais ao longo das bordas laterais do depósito, seguindo as bordas naturais do tecido.
- Use o fórceps para lanç com cuidado o depósito acima e revele o bastão interescapular borboleta-dado forma encaixado dentro do WAT. Dissecar cuidadosamente o bastão para fora do WAT circundante.
- Identificando e isolando posterior subcutânea Wat,
- Coloque o mouse sobre as costas em uma posição supina.
- Depois de fixar os membros superiores e inferiores com os pinos de dissecção, use fórceps para levantar a pele na base do esterno e fazer um pequeno (1 mm) corte na pele.
- Insira uma lâmina da tesoura de íris no corte inicial e faça uma incisão na linha média (4 – 5 cm) através da pele, começando na base do esterno e descendo até a base da cauda. Tome cuidado ao fazer esta incisão porque a pele ventral é muito fina e está intimamente associada com a parede da cavidade peritoneal subjacente.
- Faça duas incisões horizontais (1 cm cada) usando tesouras da íris, estendendo lateralmente da linha média, na parte superior da incisão vertical inicial.
- Use fórceps para descascar cuidadosamente a pele da cavidade peritoneal e a perna para encontrar o WAT subcutâneo posterior, que deve permanecer associado com a pele. Fixe a pele estendida com os pinos da dissecção para facilitar a excisão completa do WAT.
Nota: Embora o Wat subcutaneous do posterior pareça ser contínuo, é compreendido realmente de três depósitos discretos: dorsolumbar, inguinal, e glútea1. O depósito de dorsolumbar estende-se da espinha lombar até a base do membro posterior. O depósito inguinal triangular estende-se da base do membro posterior ventralmente através da virilha e contém um linfonodo proeminente. O depósito glúteo se estende inferiormente da base da virilha e envolve a perna até a base da cauda.
3. identificação e isolamento de depósitos de Adipose visceral (gonadal, Perirenal, retroperitoneal, omental, pericárdico)
- Identificando e isolando depósitos de Wat visceral
Nota: Os depósitos de Wat, que são contidos pela maior parte dentro das cavidades torácicas e peritoneais, mantêm o rato em uma posição supina. Fixe os membros superiores e inferiores à bandeja de dissecção com os pinos de dissecção.- Use fórceps para levantar a parede da cavidade peritoneal fina na base do esterno e fazer um pequeno corte (1 mm) usando tesouras de íris.
- Insira uma lâmina da tesoura de íris no corte e faça uma incisão vertical descendente (4 – 5 cm) do topo da cavidade peritoneal (base do esterno) para o reto.
- Faça duas incisões horizontais (1 cm cada) com tesouras de íris, estendendo-se lateralmente da linha média, na parte superior e inferior da incisão vertical.
- Use o fórceps para descascar para trás o peritônio e expor os índices da cavidade abdominal. Fixe o peritônio estendido na panela de dissecção.
- Identificando e isolando g onadal Wat
Nota: O WAT gonadal rodeia o útero e os ovários em fêmeas (ovarianas ou parametrial) e o epidídimo e testículos em machos (epididimômicos). O WAT ovariano rodeia os ovários, o útero e a bexiga. Em animais obesos, o WAT gonadal e perirrenal pode parecer contínuo — neste caso, separar os depósitos no chifre uterino e nos ovários. O Wat de epididimal é encontrado limitado ao epididymis, aos testículos, e à embarcação de sangue epididimal proeminente.- Localize as gônadas (testículos ou ovários) e use fórceps para levantar o WAT gonadal associado.
- Use tesouras da íris para extirpar com cuidado o WAT das gônadas.
- Identificando e isolando p erirenal Wat
Nota: Perirenal WAT rodeia os rins bilateralmente. Em animais obesos, este depósito pode parecer estender-se inferiormente ao topo do chifre uterino e ovários. Embora o Wat perirrenal tenha sido tradicionalmente classificado como um depósito visceral21, vários grupos identificaram-no como um depósito marrom baseado em rastreamento de linhagem e estudos de captação de glicose radiolabeled8,9, 20. histologicamente é composto de uma mistura de adipócitos brancos e marrons.- Para extirpar o depósito perirrenal, localizar o rim e usar fórceps para levantá-lo e puxá-lo Midline para ver uma divisão clara entre os depósitos perirrenal e retroperitoneal.
- Imposto o WAT diretamente associado com os rins. Assegure-se de que as glândulas supra-renais, localizadas acima dos rins, sejam removidas do WAT.
- Identificando e isolando r etroperitoneal Wat
Nota: O WAT retroperitoneal está localizado em uma posição paravertebral, ao longo da borda entre a parede abdominal posterior e a medula espinhal.- Para o consumo deste depósito, use fórceps para levantar o rim para cima e para a linha média para ver claramente a fronteira entre os depósitos perirrenal e retroperitoneal.
Nota: Em animais obesos, identificar esta fronteira pode ser desafiador. - Então, use a tesoura da íris para dissecar com cuidado o WAT retroperitoneal da parede peritoneaa do posterior.
- Para o consumo deste depósito, use fórceps para levantar o rim para cima e para a linha média para ver claramente a fronteira entre os depósitos perirrenal e retroperitoneal.
- Identificando e isolando o WAT omental
Nota: Omental WAT está localizado ao longo da maior curvatura do estômago. Embora o adiposo omental seja um depósito importante nos seres humanos, é geralmente presente somente em ratos mórbidos obesos.- Para identificar visceral omental WAT, use fórceps para levantar o estômago para cima. Use a tesoura da íris para remover o tecido adiposo associado ao longo da borda inferior do estômago. Não confunda o WAT omental com o pâncreas.
- Identificando e isolando mesentérica Wat
Nota: O WAT mesenteric é uma estrutura Web-like que circunda e associada com os intestinos pequenos e grandes.- Para o consumo deste depósito, retire os intestinos do resto do trato digestivo cortando na base do estômago e do reto. Use fórceps para levantar os intestinos para fora da cavidade visceral e desvende-los.
- Use a tesoura da íris para dissecar com cuidado o Wat mesentérica longe dos intestinos, começando no duodeno e continuando ao fim dos dois pontos. Remova cuidadosamente os linfonodos que estão intimamente associados com o depósito mesentérico.
- Identificando e isolando o WAT pericárdico
Nota: O WAT pericárdico está localizado fora do pericárdio visceral e na superfície externa do pericárdio parietal, muitas vezes ao longo do aspecto inferior do coração14.- Para obter acesso à cavidade torácica, mantenha o mouse em uma posição supina. Fixe os membros superiores e inferiores à bandeja de dissecção com os pinos de dissecção.
- Use fórceps para levantar o processo xyphoid (cartilagem na base do esterno) e fazer um pequeno (1 mm) corte na parede da cavidade torácica.
- Insira uma lâmina da tesoura de íris no corte e faça duas incisões horizontais (1 cm cada) estendendo-se lateralmente a partir da base do esterno. Isto irá expor o diafragma e a borda inferior da cavidade torácica.
- Use tesouras de dissecação para fazer duas incisões verticais ascendentes (3 – 4 cm) através da nervuras, estendendo-se superiormente das bordas laterais da cavidade torácica até a clavícula.
- Use fórceps para levantar a metade ventral da nervgaiola. Use tesouras de dissecação para fazer um corte final (2 cm) ao longo do comprimento inferior da clavícula para remover a caixa torácica e expor o conteúdo da cavidade torácica.
- Se presente, dissecar cuidadosamente o adiposo pericárdico da superfície externa do pericárdio.
4. identificação e isolamento de outros depósitos adiposos
- Identificando e isolando o WAT epicárdico
Nota: O epicardial WAT está contido no pericárdio visceral e está diretamente associado à superfície do miocárdio.- Se presentes, os adipócitos epicárdicos podem ser observados histologicamente após o isolamento e a fixação do coração perusado em formalina tamponada neutra a 10% por 24 h.
- Identificando e isolando p opliteal Wat
Nota: O Wat poplítea é localizado na fossa poplítea no joelho do posterior e contem um grande nó de linfa. Este depósito não é tipicamente visível em animais jovens.- Para isolar o Wat poplítea, use a tesoura da íris para remover com cuidado a pele da base do membro traseiro ao pé.
- Coloc a patela de encontro à bandeja da dissecção e prenda a perna estendida com um pino no pé. Assegure-se de que a fossa poplítea na parte de trás do joelho esteja voltada para cima.
- Use a tesoura da íris para fazer um corte na beira inferior das cabeças medial e laterais do músculo do gastrocnêmio. Use fórceps para levantar o músculo e revelar o depósito poplítea triangular.
- Use a tesoura da íris para extirpar o depósito ao longo das beiras naturais do tecido.
- Identificando e isolando o WAT dérmico
Nota: O Wat dérmico é uma fina camada de adipócitos localizado entre a derme reticular e a camada de músculo panículo carnosus.- Para identificar adipócitos dérmicos por métodos histológicos, coloque o mouse em seu estômago em uma posição prona. Depois de fixar os membros superiores e inferiores com os pinos de dissecção, pulverize a superfície externa do rato com 70% de etanol para molhar a pele.
- Use um bisturi para remover a pele molhada de uma porção quadrada de pele na parte de trás do mouse.
- Use tesouras da íris para extirpar com cuidado a porção raspada da pele, que incluirá a derma reticular, o Wat cutâneo, o carnosus do panículo, e o algum Wat subcutaneous.
- Use um bisturi para cortar a pele extirpada em tiras verticais finas.
- Posicione as tiras verticais finas com a camada de WAT subcutânea pegajosa virada para baixo.
- Começando em uma extremidade, role a tira para si mesma para formar uma espiral. A camada de WAT subcutânea pegajosa na parte externa da espiral permitirá que o rolo mantenha sua forma durante a fixação.
- Coloc a espiral em um poço de uma placa de 24 poços que contem o formalina tamponado neutro de 10% para 24 h antes do processamento histológico22.
- Identificando e isolando o WAT intermuscular
Nota: O WAT intermuscular é amplamente definido como adipócitos localizados abaixo da fáscia profunda dos músculos. Este termo inclui adipócitos intercalados entre as fibras musculares do músculo esquelético, também conhecido como WAT intramuscular, e adipócitos localizados dentro de feixes musculares si. Camundongos wildtype geralmente não têm um grande número de adipócitos intermusculares. No entanto, é possível, certas condições, identificar o WAT intermuscular por métodos histológicos. algumas condições, os adipócitos intermusculares também podem ser encontrados em músculos lisos, como o diafragma.- Para isolar o músculo tibial anterior (TA), por exemplo, coloque o mouse sobre as costas em uma posição supina e prenda os membros inferiores à bandeja de dissecção usando pinos de dissecção. Molhe a pele com 70% de etanol para minimizar a contaminação com peles.
- Use tesouras de íris para remover cuidadosamente a pele da perna e expor o grupo muscular do quadríceps, localizado acima do joelho no eixo do fêmur, e o TA localizado abaixo do joelho na superfície ventral da tíbia.
Nota: O ta é espesso perto da extremidade proximal da tíbia e mais tendíneas perto da extremidade longe do ponto de origem. - Use a tesoura da íris para extirpar um pedaço do músculo e fixar em 10% de formalina tamponada neutra para 24 h antes do processamento histológico22.
- Identificando e isolando os depósitos intra-articulares do WAT
Nota: Os depósitos intra-articulars de Wat são situados dentro das junções sinovial.- Para identificar o WAT infrapatelar, por exemplo, por métodos histológicos, os ossos da perna da colheita como detalhado na seção de BMAT.
- Após a remoção do complexo fêmur-tibial, use tesouras de íris e compressas de gaze para remover o máximo de tecido conjuntivo e muscular possível. Não quebre a articulação tibiofemoral.
- Fixar o complexo fêmur-tibial em formalina tamponada neutra de 10% por 24 h antes da descalcificação e processamento histológico (descritos abaixo, etapa 4.6.8).
- Identificando e isolando o tecido adiposo da medula óssea
Nota: O tecido adiposo da medula óssea (BMAT) está contido dentro dos ossos, intercalados com células hematopoiéticas. Anatomicamente, o BMAT pode ser classificado como constitutivo (tíbia distal e vértebras caudais) ou regulado (tíbia média a proximal, fêmur e vértebras lombares)10,11. O isolamento limpo dos adipócitos da medula óssea para análises de RNA e proteínas é desafiador em camundongos. Entretanto, os ossos do rato podem prontamente ser colhidos, fixados, descalcificados e parafina-incorporados para análises histológicas.- Para colher ossos da perna, por exemplo, primeiro retire as pernas do mouse. Use a tesoura da dissecção para cortar a junção acetabulofemoral, mantendo a cabeça femoral intacta.
- Use tesouras de íris para remover cuidadosamente a pele da perna, revelando os músculos da perna.
- Dissecar cuidadosamente os músculos principais do fêmur e da tíbia usando tesouras de íris e compressas de gaze.
- Quando o fêmur é exposto, siga a borda do osso para a articulação da pélvis e do fêmur e solte cuidadosamente a cabeça femoral da articulação acetabulofemoral. Use gaze para limpar qualquer tecido remanescente do fêmur.
- Siga a borda da tíbia para a articulação do tornozelo. Solte cuidadosamente o maléolo medial, localizado na ponta da tíbia, da articulação do tornozelo.
- Uma vez que o complexo fêmur-tibial foi isolado, retire tanto músculo e tecido conjuntivo quanto possível usando tesouras de íris e/ou gaze.
- Separe a tíbia do fêmur inserindo uma lâmina das tesouras da íris na articulação tibiofemoral e corte suavemente através dos ligamentos colaterais medial e lateral e dos ligamentos cruciados anterior e posterior. Não retire a cápsula da articulação do joelho para garantir que a tíbia permaneça intacta. Use gaze para limpar qualquer tecido remanescente da tíbia.
- Fixe os ossos em formalina tamponada neutra de 10% durante 24 h à temperatura ambiente e depois lave e armazene de acordo com as necessidades futuras.
- Para analisar os parâmetros ósseos por meio de tomografia computadorizada (μCT), armazenar ossos no tampão fosfato de Sorensen, pH 7,423.
- Para a quantificação de BMAT e análises histológicas, descalcificar os ossos em 14% EDTA, pH 7,4, por 10-14 dias.
- Após a descalcificação, use a coloração do tetróxido do ósmio e a análise do μct para quantificar bmat24. Caso contrário, processo e parafina-incorporar ossos para histologia23.
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Representative Results
A identificação e a isolação bem sucedidas de vários depósitos adiposos do rato podem ser conseguidas usando o protocolo descrito acima. As localizações anatômicas brutas dos depósitos subcutâneo (A, E-F), marrom (B), visceral (C, D, G-J) e poplíteo (K) são mostradas na Figura 2.
Figura 2: locais anatômicos brutos de depósitos adiposos de camundongo. Anatomia bruta de (A) subcutânea anterior, (b) marrom, (C) epididimário (b, bexiga), (D) ovário (u, chifres uterinos), (E) posterior subcutâneo (dorsolumbar (D), inguinal (i), glútea (g)), (F) inguinal, (G) mesenteric, (h) perirrenal (k, rim), (I) retroperitoneal (k, rim), (J) pericárdico (h, coração), e (k) depósitos de adiposo poplíteo em camundongos adultos C57Bl/6J. As setas apontam para depósitos específicos se forem representados vários depósitos. Órgãos relevantes são designados por cartas apropriadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As características histológicas dos depósitos adiposos subcutâneos (A-D), marrom (E), visceral (F-K), poplíteo (L), constitutivo (M) e regulado da medula (N), intramuscular (O) e infrapatelar (P) foram avaliadas por hematoxilina e eosina (H & E) coloração22 e são mostrados na Figura 3.
Figura 3: avaliação histológica de depósitos discretos de adiposo de camundongo. Histologia de (A) subcutânea anterior, (B) dorsolumbar, (C) inguinal, (D) gluteal, (E) marrom, (F) gonadal, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) mesentérico, (K) pericárdico, (L) poplíteo, (M) constitutivo e (N) regulado de medula óssea adiposa, (O) intermuscular, e (P) depósitos infrapatelares em camundongos adultos C57Bl/6J. Os tecidos foram isolados de acordo com o protocolo determinado, fixo durante a noite em formalina tamponada neutra de 10%, processado e incorporado em parafina. as secções de 5 μm foram coradas com H & E. A maioria das imagens foram tiradas em ampliação de 100x; Barra de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como a importância das diversas características moleculares e funcionais de clusters de adipócitos discretos é cada vez mais reconhecida, é crucial que os investigadores dentro do campo identifiquem uniformemente e distribuam depósitos adiposos para análises complementares. Até o momento, existem poucos protocolos para localização padronizada e isolamento da ampla gama de depósitos adiposos do mouse. Os métodos previamente publicados são centrados primeiramente em um ou dois depósitos e faltam os detalhes necessários para a identificação e a excisão uniformes por investigadores diferentes18,19. Este manuscrito é uma contribuição nova e importante para o campo da biologia adiposa, uma vez que fornece um guia detalhado para a localização anatômica e dissecção precisa de depósitos comumente estudados e menos conhecidos em todo o mouse. A localização anatômica bruta e as análises histológicas são fornecidas para demonstrar a diversidade de nichos de adipócitos.
A isolação bem sucedida de depósitos adiposos discretos usando este protocolo é dependente de diversas etapas críticas. A manutenção de um ambiente de dissecção limpa é crucial; 70% etanol pode ser usado como necessário para remover os cabelos contaminantes ou sangue da bandeja de dissecação e ferramentas. Quando isolando o WAT subcutaneous do posterior, é imperativo que a incisão inicial na pele não penetra a cavidade peritoneaa pròxima associada de modo que as duas camadas possam eficientemente ser separadas para expor o WAT. Similarmente, ao cortar através da parede peritoneal para expor os índices da cavidade abdominal, as incisões não devem perfurar os intestinos subjacentes para impedir a contaminação com elementos digestivos. O bastão interescapular deve ser cuidadosamente extirpado do tecido circundante para evitar a contaminação do WAT, o que irá distorcer as análises futuras. A identificação consistente dos depósitos dorsolumbar, inguinal e glúteo posteriores da via subcutânea depende da utilização de marcos anatômicos precisos descritos no protocolo. A distinção entre estes depósitos é particularmente importante; Embora os depósitos possam parecer ser contínuos, os adipócitos inguinal centralmente situados adquirem características marrons-como mais prontamente do que suas contrapartes circunvizinhas.
Os tecidos adiposos isolados usando este protocolo podem ser analisados usando uma variedade de técnicas. Além da avaliação histológica (por exemplo, coloração de H & E, imuno-histoquímica), os tecidos adiposos podem ser usados para uma ampla gama de análises moleculares, desde a regulação da transcrição até as modificações de proteínas pós-translacionais. Adipócitos e células vasculares estromais dentro de depósitos individuais podem ser isolados por digestão de colagenases e centrifugação diferencial. Estas frações podem então ser usadas para estudos moleculars, metabólicos, e da cultura da pilha. Os explantes do depósito também podem ser usados para ensaios metabólicos e enzimáticos ex vivo .
Vários desafios e limitações surgem durante o isolamento e a excisão dos tecidos adiposos do camundongo. Em primeiro lugar, alguns depósitos que são fisiologicamente importantes em seres humanos não estão comumente presentes em ratos magros e adultos. Por exemplo, omental WAT, que é o principal depósito visceral em seres humanos, só pode ser visto em ratos obesos geneticamente ou induzida pela dieta. A expansão de alguns depósitos pode, no entanto, ser induzida por desafios nutricionais ou tratamentos medicamentoso. Por exemplo, a alimentação gorda da dieta elevada pode causar a expansão do Wat omental e pericárdico. O Wat intermuscular pode ser induzido por lesão muscular esquelética25,26 ou dieta gorda alta27. O bmat regulado se expande em resposta a vários desafios, incluindo dieta de alta gordura, restrição calórica e tratamento com Tiazolidinediona11,28. Em segundo lugar, devido ao pequeno tamanho dos camundongos, a obtenção de amostra suficiente para análises moleculares ou metabólicas pode ser difícil. Por exemplo, o isolamento de adipócitos de medula óssea puros suficientes para análises subsequentes é desafiador, mesmo depois de reunir ossos de vários camundongos. Terceiro, definir com precisão as fronteiras de certos depósitos pode ser difícil. Por exemplo, o Wat subcutaneous do posterior parece ser um depósito contínuo mas é compreendido realmente de depósitos dorsolumbar, inguinal, e glútea discretos. Adicionalmente, o perirrenal pode parecer ser fundido aos depósitos gonadal e retroperitoneal em animais muito obesos. A falta de bordas distintas entre os depósitos adjacentes pode tornar o isolamento limpo desses tecidos desafiadores. Entretanto, este protocolo da dissecção fornece investigadores um Atlas detalhado e uma orientação passo a passo para a dissecção exata e reprodutível de uma escala larga de depósitos adiposos do rato. A padronização em todo o campo da identificação e isolamento de depósitos discretos de adiposo de camundongo descritos acima, sem dúvida, ajudará a elucidar as diferenças no desenvolvimento, expressão gênica e funções locais e sistêmicas de anteriormente niches sob-estudado de adipócitos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O.A.M. é apoiado por concessões de NIH DK062876 e DK092759; D.P.B. é apoiado pelo programa de treinamento de cientista médico da Universidade de Michigan (T32GM007863), programa de treinamento da Universidade de Michigan em organogênese (T32HD007605), Universidade de Michigan Rackham mérito Fellowship, e Tylenol futuro cuidados Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
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