Summary
Adipocytter findes i diskrete depoter og har forskellige roller inden for deres unikke mikromiljøer. Som regionale forskelle i fedtcellerne karakter og funktion er afdækket, standardiseret identifikation og isolering af depoter er afgørende for fremskridt i marken. Heri præsenterer vi en detaljeret protokol for excision af forskellige mus fedtvæv depoter.
Abstract
Fedtvæv er komplekse organer med en bred vifte af funktioner, herunder opbevaring og mobilisering af energi som reaktion på lokale og globale behov, frakobling af metabolisme til at generere varme, og sekretion af adipokines til at regulere hele kroppen homøostase og immunrespons. Ny forskning identificerer vigtige regionale forskelle i de udviklingsmæssige, molekylære og funktionelle profiler af adipocytter placeret i diskrete depoter i hele kroppen. Forskellige egenskaber ved depoterne er medicinsk relevante, da metaboliske sygdomme ofte udviser Depot specifikke virkninger. Denne protokol vil give investigatorerne en detaljeret anatomisk Atlas og dissektion guide til reproducerbar og præcis identifikation og excision af forskellige mus fedtvæv. Standardiseret dissektion af diskrete fedtvæv depoter vil give detaljerede sammenligninger af deres molekylære og metaboliske egenskaber og bidrag til lokale og systemiske patologiske tilstande under forskellige ernæringsmæssige og miljømæssige forhold.
Introduction
Fedtvæv spiller kritiske roller i hele kroppen homøostase, herunder opbevaring og frigivelse af energi som reaktion på lokale og globale behov, termoregulering, og sekretion af adipokines til at regulere energibalancen, metabolisme og immunrespons1 , 2. adipocytter distribueres i hele kroppen i diskrete depoter, og i nogle tilfælde tjene specialiserede roller inden for deres mikromiljøer3,4,5. Historisk set har studiet af fedtvæv centreret på hvidt fedtvæv (WAT), og dets rolle i at opretholde energi homøostase. De fleste adipocytter distribueres i hele kroppen i subkutane og visceral WAT depoter. Egenskaberne ved disse depoter er vigtige for differentialfølsomhed over for metaboliske sygdomme. Subkutane adipocytter, placeret under huden, har været forbundet med beskyttende metaboliske effekter5. Visceral adipocytter, som omgiver de vitale organer og er indeholdt i gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental og perikardiale depoter, er almindeligvis knyttet til metaboliske lidelser, herunder type 2 diabetes og hjerte-kar-sygdom2 . Brunt fedtvæv (BAT) er også blevet undersøgt udførligt. Brune og brune-lignende adipocytter udtrykker afkoblings protein 1 (UCP1) og spiller vigtige roller i adaptiv termogenese og glucosehomøostase6,7. Klassiske brune adipocytter er indeholdt i den interscapular BAT Depot8. Klynger af brune adipocytter findes også andre steder, herunder supraclavicular, infrarød/Subscapular, cervikal, paravertebrale og periaorta depoter8,9.
Ud over deres placering i større WAT og BAT depoter, adipocytter findes i diskrete nicher i hele kroppen4, hvor de kan udføre specialiserede funktioner inden for deres respektive mikromiljøer. For eksempel, knoglemarvs fedtvæv (BMAT) fungerer som en lipid reservoir, er en vigtig kilde til cirkulerende adiponectin, og tæt interagerer med osteoblaster, osteoklaster, og hæmatopoietiske celler10,11. Dermal adipocytter bidrage til udbredte processer, herunder sårheling, immunrespons, thermoregulation, og hårsækken vækst12,13. Yderligere, epicardial adipocytter kan producere flere adipokines og chemokiner, der udøver lokale og systemiske virkninger på udviklingen og progression af koronararteriesygdom14. Udvidelse af Inter/intramuskulær WAT er blevet positivt korreleret med øget adiposity, systemisk insulinresistens, og nedsat muskelstyrke og mobilitet15. Desuden, popliteale adipocytter tjene som en lipid reservoir for lymfe ekspansion under infektion16. Mens de specifikke roller af forskellige artikulære depoter er generelt ukendte, Hoffa depot (infrapatellar) i knæet menes nu at bidrage til patologier, herunder forreste knæsmerter og slidgigt17.
Der henviser til, at regionale forskelle i fedtcellerne karakter og funktion er under intens undersøgelse, feltet er i øjeblikket begrænset af manglen på en standardiseret protokol for identifikation og dissektion af forskellige muse depoter. Tidligere offentliggjorte metoder har typisk beskrevet isoleringen af en eller to specifikke depoter og mangler det detaljeringsniveau, der kræves for ensartet excision18,19. Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, giver en omfattende guide til de specifikke anatomiske steder og isolations trin af mange forskellige muse-fedtvæv depoter. Selvom Wat depoter er det primære fokus i dette manuskript, er excision af interscapular bat også beskrevet i detaljer. Fedtvæv, der er fjernet ved hjælp af denne protokol, kan anvendes til en lang række eksperimentelle endepunkter, herunder forklarende undersøgelser, histologi og analyse af genekspression.
Formålet med dette manuskript er at give investigatorerne en detaljeret protokol til klart og præcist at identificere og isolere både fremtrædende og mindre studerede mus fedtvæv depoter (figur 1). Denne ressource vil fremme en mere fuldstændig undersøgelse af de udviklingsmæssige, molekylære og funktionelle egenskaber af adipocytter inden for forskellige nicher.
Figur 1: skematisk skildring af musen fedtvæv depoter dissekeret i denne protokol. Dette billede er blevet tilpasset fra bagchi et al., 20184. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer udføres med godkendelse af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget (IACUC) af University of Michigan.
1. euthanization
Bemærk: I forbindelse med denne video protokol anvendes 4 til 6 måneder gamle C57BL/6J-mus.
- Placer musen i en isofluran vaporizer kammer og justere isofluran strømningshastigheden til 5% eller højere. Fortsæt isoflurans eksponering indtil et minut efter vejrtrækningsstop. Fjern derefter musen fra vaporizer kammeret og bekræft eutanasi ved hjælp af en godkendt sekundær foranstaltning.
Bemærk: Godkendte sekundære foranstaltninger vil variere efter institutions-og dyre protokol og kan omfatte livmoderhals hugning eller decapitation. - Placer den aflives mus på dissektion pan. Sterilisere de dorsale og ventrale udvendige overflader af musen ved hjælp af 70% ethanol. Sørg for, at den udvendige overflade af musen er tilstrækkelig våd til at minimere kontaminering fra pels under dissektion.
2. identifikation og isolering af store subkutane Adipose-Ddepoter (anterior subkutan, Dorsolumbar, Inginal, gluteal) og interscapular brunt Afedtvæv
- Identificering og isolering af forreste subkutane Wat
Bemærk: Anterior subkutan Wat er placeret mellem scapulae, faldende fra nakken af halsen til aksillerne af musen7. Dette depot er alternativt blevet beskrevet som suprascapular8 eller interscapular20 Wat og ligger direkte på toppen af interscapular bat depot.- For at isolere den forreste subkutane Depot, lægge musen på maven i en udsat position. Fastgør de øvre og nedre lemmer til dissektions panden med dissektions stifter.
- Brug pincet til at løfte rygskind på nakken. Brug iris saks til at lave en lille (1 mm) udskæring i huden.
- Indsæt en klinge af iris saks i det oprindelige snit og lav en midterlinje lodret indsnit (2 – 3 cm) gennem huden, begyndende ved nakken og faldende langs rygsøjlen til midten af ryggen.
- Lav to horisontale snit (1 cm hver) ved hjælp af iris saks, udvidelse sideværts fra midterlinjen, i toppen og bunden af den oprindelige lodrette incision.
- Brug pincet til forsigtigt at skrælle huden og udsætte den forreste subkutane depot.
- Brug iris saks til at fjerne depotet efter de naturlige grænser af vævet.
Bemærk: Denne metode isolerer både forreste subkutant Wat og interscapular bat. - Placer det dissekerede depot på dissektion pan og fjern forsigtigt det kontaminerende bat ved hjælp af iris saks.
- Identificering og isolering c lassical bat
Bemærk: Klassisk FLAGERMUS er placeret under den forreste subkutane WAT depot.- For at isolere BAT, brug iris saks til at skære vandret langs den nederste kant af det forreste subkutane væv, efter den naturlige grænse af depotet.
- Brug derefter iris saks til at lave to lodrette snit langs de laterale kanter af depotet, efter de naturlige grænser af vævet.
- Brug pincet til forsigtigt at vende depotet op og afsløre den Butterfly-formede interscapular BAT indlejret i WAT. Forsigtigt dissekere FLAGERMUS ud fra det omgivende WAT.
- Identificering og isolering posterior subkutan Wat,
- Læg musen på ryggen i en liggende position.
- Efter fastgørelse af de øvre og nedre lemmer med dissektion stifter, brug pincet til at løfte huden op i bunden af brystbenet og lav en lille (1 mm) skåret i huden.
- Indsæt en klinge af iris saks i det oprindelige snit og lav en midterlinje indsnit (4 – 5 cm) gennem huden, begyndende ved bunden af brystbenet og faldende til bunden af halen. Vær forsigtig, når du foretager denne indsnit, fordi den ventrale hud er meget tynd og er tæt forbundet med den underliggende peritoneale hulrum væg.
- Lav to horisontale snit (1 cm hver) ved hjælp af iris saks, strækker sig sideværts fra midterlinjen, øverst i den oprindelige lodrette incision.
- Brug pincet til forsigtigt at skrælle huden tilbage fra bughulen og benet for at finde posterior subkutant WAT, som bør forblive forbundet med huden. Fastgør den udstrakte hud med dissektion Pins for at lette fuldstændig excision af Wat.
Bemærk: Selv om den bageste subkutane Wat synes at være kontinuerlig, er det faktisk består af tre diskrete depoter: dorsolumbar, inguinal, og bagdelen1. Dorsolumbar Depot strækker sig fra lændehvirvelsøjlen til bunden af bagekstremiteten. Det trekantede inginal Depot strækker sig fra bunden af bagekstremiteten ventrally over Lyin og indeholder en fremtrædende lymfeknude. Den gluteale Depot udvider inferiorly fra bunden af lyske og wraps omkring benet til bunden af halen.
3. identifikation og isolering af visceral Adipose depoter (gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental, perikardiel)
- Identificering og isolering visceral Wat depoter
Bemærk: WAT depots, som i vid udstrækning er indeholdt i thorax og peritonealdialyse hulrum, holde musen i en liggende position. Fastgør de øvre og nedre lemmer til dissektions panden med dissektions stifter.- Brug pincet til at løfte den tynde peritoneale hulrum væg i bunden af brystbenet og lav en lille snit (1 mm) ved hjælp af iris saks.
- Indsæt en klinge af iris saks i snittet og lav en nedadgående lodret indsnit (4 – 5 cm) fra toppen af peritonealhulen (bunden af brystbenet) til endetarmen.
- Lav to horisontale snit (1 cm hver) med iris saks, som strækker sig sidelæns fra midterlinjen, øverst og nederst på det lodrette snit.
- Brug pincet til at skrælle bughinden og udsætte indholdet af bughulen. Fastgør det udstrakte bughinden til dissektion pan.
- Identificering og isolering g onadal Wat
Bemærk: Gonadal WAT omgiver livmoderen og æggestokkene hos kvinder (æggestokkene eller parametrial) og epididymis og testiklerne hos mænd (epididymal). Ovarie WAT omgiver æggestokkene, livmoderen og blæren. Hos overvægtige dyr, gonadale og perirenalt Wat kan synes at være kontinuerlig-i dette tilfælde, adskille depoter på livmoder horn og æggestokke. Epididymale Wat er fundet bundet til epididymis, testiklerne, og den fremtrædende epididymale blodkar.- Find gonaderne (testiklerne eller æggestokkene) og brug pincet til at løfte den associerede gonadale Wat.
- Brug iris saks til forsigtigt at punktafgifts den WAT fra gonader.
- Identificering og isolering p erirenal Wat
Bemærk: Perirenal WAT omgiver nyrerne bilateralt. I overvægtige dyr, kan dette Depot synes at forlænge inferiorly til toppen af livmoder horn og æggestokke. Selv om perirenalt Wat traditionelt er blevet klassificeret som et visceral Depot21, har flere grupper identificeret det som en brun Depot baseret på Lineage Tracing og radioaktivt mærkede glukose optagelsesstudier8,9, 20. histologisk det består af en blanding af hvide og brune adipocytter.- At punktafgiftspligtige Depot, lokalisere nyrerne og bruge pincet til at løfte det op og trække det midt på linjen for at se en klar opdeling mellem perirenalt og retroperitoneal depoter.
- Punktafgiftspligtige WAT direkte forbundet med nyrerne. Sørg for, at binyrerne, placeret over nyrerne, er fjernet fra WAT.
- Identificering og isolering r etroperitoneal Wat
Bemærk: Retroperitoneal WAT ligger i en paravertebrale position langs grænsen mellem den bageste abdominalvæg og rygmarven.- Til punktafgifter dette Depot, bruge pincet til at løfte nyrerne op og mod midterlinjen at tydeligt se grænsen mellem perirenalt og retroperitoneal depoter.
Bemærk: I overvægtige dyr, identificere denne grænse kan være udfordrende. - Brug derefter iris saks til omhyggeligt at dissekere retroperitoneal WAT fra den posterior peritoneale væg.
- Til punktafgifter dette Depot, bruge pincet til at løfte nyrerne op og mod midterlinjen at tydeligt se grænsen mellem perirenalt og retroperitoneal depoter.
- Identificering og isolering af omental WAT
Bemærk: Omental WAT er placeret langs den større krumning af maven. Selvom omental fedtvæv er et vigtigt Depot hos mennesker, er det generelt kun til stede i sygeligt fede mus.- For at identificere visceral omental WAT, brug pincet til at løfte maven op. Brug iris saks til at fjerne den tilhørende fedtvæv langs den nedre grænse af maven. Må ikke forveksle omental WAT med bugspytkirtlen.
- Identificering og isolering af mesenteriske Wat
Bemærk: Mesenteric WAT er en web-lignende struktur omkring og forbundet med de små og store tarme.- Til punktafgifter dette Depot, fjerne tarmene fra resten af fordøjelseskanalen ved at skære i bunden af maven og endetarmen. Brug pincet til at løfte tarmene ud af det viscerale hulrum, og Opløs dem.
- Brug iris saks til omhyggeligt at dissekere den mesenteriske WAT væk fra tarmene, begyndende ved duodenum og fortsætter til slutningen af tyktarmen. Fjern forsigtigt lymfeknuder, der er tæt forbundet med mesenteriallymfeknuderne depot.
- Identifikation og isolering af perikardial WAT
Bemærk: Perikardialwat er placeret uden for visceral perikardiet og på den udvendige overflade af parietal perikardiet, ofte langs den ringere aspekt af hjertet14.- For at få adgang til brysthulen, holde musen i en liggende position. Fastgør de øvre og nedre lemmer til dissektions panden med dissektions stifter.
- Brug pincet til at løfte xyphoid-processen (brusk ved bunden af brystbenet) og lav en lille (1 mm) udskæring i brysthulens væg.
- Indsæt en klinge af iris saks i snittet og lav to horisontale snit (1 cm hver) strækker sig sideværts fra bunden af brystbenet. Dette vil udsætte diafragmaet og ringere grænse af brysthulen.
- Brug dissekere saks til at gøre to stigende lodrette snit (3 – 4 cm) gennem ribburet, udvide overlegent fra de laterale grænser af brysthulen til clavicle.
- Brug pincet til at løfte den ventrale halvdel af ribburet. Brug dissekere saks til at lave en endelig snit (2 cm) langs den ringere længde af kravebenet for at fjerne ribburet og udsætte thorax kavitets indhold.
- Hvis det er til stede, dissekere omhyggeligt perikardiumfedtvæv fra den ydre overflade af perikardiet.
4. identifikation og isolering af andre Adipose depoter
- Identifikation og isolering af epicardial WAT
Bemærk: Epicardial WAT er indeholdt i visceral periicardium og er direkte forbundet med overfladen af myokardiet.- Hvis det er til stede, kan epicardial adipocytter observeres histologisk efter isolering og fiksering af det perfierede hjerte i 10% neutral Buffered formalin for 24 h.
- Identificering og isolering p opliteal Wat
Bemærk: Popliteale Wat er placeret i popliteale fossa i det bageste knæ og indeholder en stor lymfeknude. Dette depot er ikke typisk synligt i unge dyr.- At isolere popliteale Wat, bruge iris saks til forsigtigt at fjerne huden fra bunden af bagben til foden.
- Placer patella mod dissektion pan og Fastgør det udstrakte ben med en nål i foden. Sørg for, at popliteale fossa på bagsiden af knæet vender opad.
- Brug iris saks til at lave en nedskæring ved den nedre grænse af de mediale og laterale hoveder af gastrocnemius musklen. Brug pincet til at opløfte musklen og afsløre det trekantede popliteale depot.
- Brug iris saks til at punktafgifts depotet langs de naturlige vævs grænser.
- Identificering og isolering af dermal WAT
Bemærk: Dermal WAT er et tyndt lag af adipocytter placeret mellem retikulære dermis og Panniculus carnosus muskellag.- At identificere dermal adipocytter ved histologiske metoder, placere musen på maven i en udsat position. Efter sikring af de øvre og nedre lemmer med dissektion stifter, spray den udvendige overflade af musen med 70% ethanol til våd huden.
- Brug en skalpel til at fjerne den befugtede pels fra en firkantet del af huden på bagsiden af musen.
- Brug iris saks til omhyggeligt at punktafgifts den barberede del af huden, som vil omfatte retikulær dermis, dermal WAT, Panniculus carnosus, og nogle subkutane WAT.
- Brug en skalpel til at skære den fjernede hud i tynde lodrette strimler.
- Placer de tynde lodrette strimler med det klæbrig subkutane WAT-lag vendt nedad.
- Start i den ene ende, rul strimlen på sig selv til at danne en spiral. Den klæbrig subkutane WAT lag på yderside af spiralen vil gøre det muligt for rullen at opretholde sin form under fiksering.
- Spiralen placeres i en brønd af en 24-brønd plade, der indeholder 10% neutral Buffered formalin i 24 timer før histologisk behandling22.
- Identificering og isolering af intermuskuløs WAT
Bemærk: Intermuskuløs WAT er bredt defineret som adipocytter placeret under den dybe fascia af muskler. Dette udtryk omfatter adipocytter spækket mellem muskelfibre af skeletmuskulatur, også kendt som intramuskulær Wat, og adipocytter placeret inden muskel bundter selv. Wildtype mus generelt ikke har et stort antal af intermuskuløse adipocytter. Det er dog muligt under visse betingelser at identificere intermuskuløs WAT ved histologiske metoder. Under nogle betingelser, intermuskuløse adipocytter kan også findes i glatte muskler, såsom membranen.- For at isolere tibias forreste (Ta) muskel, for eksempel, placere musen på ryggen i en liggende position og fastgør underekstremiteterne til dissektion pan ved hjælp dissektion stifter. Våd huden med 70% ethanol for at minimere kontaminering med pels.
- Brug iris saks til forsigtigt at fjerne huden fra benet og udsætte quadriceps muskel gruppe, placeret over knæet på femur akslen, og TA placeret under knæet på den ventrale overflade af skinneben.
Bemærk: TA er tyk nær den proksimale ende af skinneben og mere sener nær den distale ende. - Brug iris Sakse til at sætte et stykke af musklen på, og fastgør den i 10% neutral Buffered formalin i 24 timer før histologisk behandling22.
- Identificering og isolering af intra-artikulære WAT depoter
Bemærk: Intra-artikulære WAT depoter er placeret i synovialleddene.- For at identificere infrapatellar WAT, for eksempel ved histologiske metoder, høst ben knogler som beskrevet i BMAT afsnit.
- Efter fjernelse af femur-tibial kompleks, bruge iris saks og gaze puder til at fjerne så meget muskel og bindevæv som muligt. Du må ikke bryde tibiofemoral leddet.
- Fastsætte femur-tibial kompleks i 10% neutral Buffered formalin for 24 h før afkalkning og histologisk behandling (beskrevet nedenfor, trin 4.6.8).
- Identificering og isolering af knoglemarvs fedtvæv
Bemærk: Knoglemarvs fedtvæv (bmat) er indeholdt i knogler, spækket med hæmatopoietiske celler. Anatomisk kan BMAT klassificeres som konstitutiv (distale skinneben og halehvirvler) eller reguleret (mellem-til-proksimale skinneben, femur og Lændehvirvler)10,11. Ren isolering af knoglemarvs adipocytter til RNA og proteinanalyser er udfordrende i mus. Dog kan mus knogler let høstes, fast, afkalcificeret og paraffin-indlejret til histologiske analyser.- For at høste ben knogler, for eksempel, først fjerne benene fra musen. Brug dissektion saks til at skære acetabulofemoral leddet, holde femoral hovedet intakt.
- Brug iris saks til forsigtigt at fjerne huden fra benet, afslørende benmusklerne.
- Forsigtigt dissekere væk de vigtigste muskler fra femur og skinneben ved hjælp af iris saks og gaze puder.
- Når femur er eksponeret, Følg kanten af knoglen til artikulation af bækkenet og femur og forsigtigt frigive femoral hovedet fra acetabulofemoral leddet. Brug gaze til at rense det resterende væv fra femur.
- Følg grænsen af skinneben til ankelleddet. Slip forsigtigt mediale malleolus, placeret på spidsen af skinneben, fra ankelleddet.
- Når femur-tibial kompleks er blevet isoleret, fjerne så meget muskler og bindevæv som muligt ved hjælp af iris saks og/eller gaze.
- Adskil skinneben fra femur ved at indsætte en klinge af iris saks i tibiofemoral leddet og forsigtigt skære gennem de mediale og laterale sikkerhed ledbånd og de forreste og posterior korsbånd ledbånd. Du må ikke fjerne knæleddens kapsel for at sikre, at skinneben forbliver intakt. Brug gaze til at rense eventuelle resterende væv fra skinneben.
- Fix knogler i 10% neutral Buffered formalin for 24 h ved stuetemperatur og derefter vaske og opbevare i henhold til fremtidige behov.
- At analysere knogle parametre ved hjælp af mikrocomputer tomografi (μCT), Opbevar knogler i Sorensens fosfatbuffer, pH 7,423.
- For bmat kvantificering og histologiske analyser, Afkalk knogler i 14% EDTA, pH 7,4, for 10-14 dage.
- Efter afkalkning anvendes osmium-tetroxid-farvning og μCT-analyse til at kvantificere BMAT24. Ellers, proces og paraffin-indlejre knogler til histologi23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket identifikation og isolering af forskellige mus fedtvæv depoter kan opnås ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor. De grove anatomiske placeringer af subkutane (A, E-F), brun (B), visceral (C, D, G-J) og popliteale (K) depoter er vist i figur 2.
Figur 2: grove anatomiske placeringer af mus fedtvæv depoter. Grov anatomi af (A) forreste subkutan, (b) brun, (C) epididymale (b, blære), (D) æggestokkene (u, uterin horn), (E) posterior subkutan (dorsolumbar (D), lyske (i), bagdelen (g)), (F) (G) mesenterisk, (h) perirenalt (k, nyre), (I) retroperitoneal (k, nyre), (J) perikardielle (h, hjerte) og (k) popliteale fedtvæv depoter i C57BL/6j voksne mus. Pile peger på bestemte depoter, hvis der afbildes flere depoter. Relevante organer udpeges ved passende bogstaver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Histologiske karakteristika ved subkutan (A-D), brun (E), visceral (F-K), popliteale (L), konstitutiv (M) og reguleret marv fedtvæv (N), intramuskulær (O), og infrapatellar (P) fedtvæv depoter blev evalueret af hematoxylin og eosin (H & E) farvning22 og er vist i figur 3.
Figur 3: histologisk vurdering af diskrete muse-fedtvæv depoter. Histologi af (A) forreste subkutan, (B) dorsolumbar, (C) inginal, (D) gluteal, (E) brun, (F) gonadal, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) mesenterisk, (K) perikardiel, (L) popliteal, (M) konstitutiv og (N) reguleret knoglemarvs fedtsyre, (O) intermuskuløs, og (P) infrapatellar depoter i C57BL/6j voksne mus. Væv blev isoleret i henhold til den givne protokol, fast natten i 10% neutral Buffered formalin, forarbejdet, og indlejret i paraffin. 5 μm sektioner blev plettet med H & E. De fleste billeder blev taget ved 100x forstørrelse; Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Da betydningen af de forskellige molekylære og funktionelle karakteristika af diskrete fedtcellerne klynger i stigende grad anerkendes, er det afgørende, at undersøgere inden for området ensartet identificerer og punktafgiftspligtige depoter til yderligere analyser. Til dato findes der kun få protokoller for standardiseret lokalisering og isolering af den brede vifte af mus fedtvæv depoter. Tidligere offentliggjorte metoder er primært fokuseret på en eller to depoter og mangler de nødvendige detaljer for ensartet identifikation og excision af forskellige undersøgere18,19. Dette manuskript er et nyt og vigtigt bidrag til området for fedtbiologi, da det giver en dybtgående guide til den anatomiske placering og præcise dissektion af almindeligt undersøgt og mindre kendte depoter i hele musen. Der gives en grov anatomisk placering og histologiske analyser til påvisning af mangfoldigheden af fedtcellerne nicher.
Vellykket isolering af diskrete fedtvæv depoter ved hjælp af denne protokol er afhængig af flere kritiske trin. Vedligeholdelse af et rent dissektions miljø er afgørende; 70% ethanol kan anvendes som nødvendigt for at fjerne kontaminerende hår eller blod fra dissektions bakken og værktøjerne. Ved isolering posterior subkutant Wat, er det bydende nødvendigt, at den oprindelige indsnit i huden ikke trænge ind i tæt forbundet bughulen, således at de to lag kan effektivt adskilles for at udsætte Wat. Tilsvarende, når skære gennem peritonealdialyse væggen for at afsløre bughulen indhold, indsnit må ikke perforere de underliggende tarme for at forhindre kontaminering med fordøjelsessystemet elementer. Interscapular BAT skal omhyggeligt exciseres fra det omgivende væv for at forhindre WAT-kontaminering, som vil skævvride fremtidige analyser. Konsekvent identifikation af den bageste subkutane dorsolumbar, inguinal, og bagdelen depoter afhænger af udnyttelsen af præcise anatomiske vartegn, der er beskrevet i protokollen. Sondringen mellem disse depoter er særlig vigtig; selv om depoterne kan synes at være kontinuerlig, centralt beliggende lyske adipocytter erhverve brune-lignende egenskaber mere let end deres omgivende modparter.
Fedtvæv isoleret ved hjælp af denne protokol kan analyseres ved hjælp af en række forskellige teknikker. Foruden histologisk evaluering (f. eks. H & E farvning, immun histokemi) kan fedtvæv anvendes til en bred vifte af molekylære analyser, fra regulering af transskription til posttranslationelle protein modifikationer. Adipocytter og stromale vaskulære celler i individuelle depoter kan isoleres ved kollagenasefordøjelse og differentialcentrifuge ring. Disse fraktioner kan derefter anvendes til molekylære, metaboliske og cellekultur studier. Depot bruskeksplantater kan også anvendes til ex vivo metaboliske og enzymatiske assays.
Flere udfordringer og begrænsninger opstår under isolation og excision af mus fedtvæv. For det første er nogle depoter, der er fysiologisk vigtige for mennesker, ikke almindeligt forekommende i Lean, voksne mus. For eksempel, omental WAT, som er den største visceral depot i mennesker, kan kun ses i genetisk eller diæt-induceret fede mus. Udvidelsen af nogle depoter kan dog være forårsaget af ernæringsmæssige udfordringer eller narkotika behandlinger. For eksempel, høj fedt diæt fodring kan forårsage ekspansion af omental og perikardialwat. Intermuskuløs Wat kan være induceret af skeletmuskulatur skade25,26 eller højt fedtindhold kost27. Reguleret bmat udvider som reaktion på forskellige udfordringer, herunder højt fedtindhold kost, kalorie begrænsning og thiazolidindion behandling11,28. For det andet, på grund af den lille størrelse af mus, at opnå nok prøve til molekylære eller metaboliske analyser kan være vanskeligt. For eksempel er isolering af nok rene knoglemarvs adipocytter til efterfølgende analyser udfordrende, selv efter sammenlægning af knogler fra flere mus. For det tredje kan det være vanskeligt præcist at definere grænserne for visse depoter. For eksempel, posterior subkutant Wat synes at være en kontinuerlig Depot, men er faktisk består af diskrete dorsolumbar, inguinal, og bagdelen depoter. Desuden, perirenalt kan synes at være smeltet til både gonadale og retroperitoneal depoter i meget fede dyr. Manglen på særskilte grænser mellem tilstødende depoter kan gøre ren isolering af disse væv udfordrende. Men denne dissektion protokol giver undersøgere med en detaljeret Atlas og trin-for-trin vejledning for nøjagtig og reproducerbar dissektion af en bred vifte af mus fedtvæv depoter. Standardisering på hele området af identificering og isolering af diskrete muse fedtdepoter, der er beskrevet ovenfor, vil utvivlsomt bidrage til yderligere at belyse forskellene i udvikling, genekspression og lokale og systemiske funktioner i tidligere under-studerede fedtcellerne niches.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
O.A.M. støttes af NIH Grants DK062876 og DK092759; D.P.B. understøttes af University of Michigan Medical Scientist træningsprogram (T32GM007863), University of Michigan træningsprogram i Organogengenesis (T32HD007605), University of Michigan Rackham Merit Fellowship, og Tylenol Future Care Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
- Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
- Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
- Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
- Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
- Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
- Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
- Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
- Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
- Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
- Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
- Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Cinti, S.
- Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
- Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
- Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
- Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
- Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
- Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).
