Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Identifisering og Disseksjon av diverse mus fettlagre

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59499
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Michigan Medical School

Summary

Adipocytter finnes i diskrete lagre og har ulike roller innenfor deres unike microenvironments. Som regionale forskjeller i adipocyte karakter og funksjon er avdekket, standardisert identifisering og isolering av lagre er avgjørende for fremme av feltet. Heri, presenterer vi en detaljert protokoll for fjerning av ulike mus fett Depot.

Abstract

Fettvev er komplekse organer med et bredt spekter av funksjoner, inkludert lagring og mobilisering av energi som svar på lokale og globale behov, frakobling av metabolisme for å generere varme, og sekresjon av adipokines å regulere hele kroppen homeostase og immunresponser. Emerging forskning er å identifisere viktige regionale forskjeller i utviklingen, molekylær, og funksjonelle profiler av adipocytter ligger i diskrete lagre i hele kroppen. Ulike egenskaper av Depot er medisinsk relevant siden metabolske sykdommer ofte demonstrere Depot-spesifikke effekter. Denne protokollen vil gi etterforskere en detaljert anatomisk Atlas og disseksjon guide for reproduserbar og nøyaktig identifisering og fjerning av ulike mus fettvev. Standardisert Disseksjon av diskrete fettlagre vil tillate detaljerte sammenligninger av deres molekylære og metabolske egenskaper og bidrag til lokale og systemiske patologisk tilstander under ulike ernæringsmessige og miljømessige forhold.

Introduction

Fettvev spille kritiske roller i hele kroppen homeostase, inkludert lagring og frigjøring av energi som svar på lokale og globale behov, termoregulering, og sekresjon av adipokines å regulere energibalansen, metabolisme og immunresponser1 , 2. adipocytter er fordelt over hele kroppen i diskrete lagre, og i noen tilfeller tjene spesialiserte roller innenfor sine microenvironments3,4,5. Historisk har studiet av fettvev sentrert på hvitt fettvev (WAT), og dens rolle i å opprettholde energi homeostase. De fleste adipocytter er fordelt over hele kroppen i subkutan og visceral WAT lagre. Egenskapene til disse lagre er viktig for differensial mottakelighet for metabolske sykdommer. Subkutan adipocytter, som ligger under huden, har vært forbundet med beskyttende metabolske effekter5. Visceral adipocytter, som omgir vitale organer og finnes i gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental og perikard lagre, er vanligvis knyttet til metabolske forstyrrelser, inkludert type 2 diabetes og kardiovaskulær sykdom2 . Brunt fettvev (BAT) har også blitt studert grundig. Brun og brun-lignende adipocytter uttrykke frakobling protein 1 (UCP1) og spille viktige roller i adaptive termotilblivelsen og glukose homeostase6,7. Klassiske brune adipocytter finnes i interscapular BAT Depot8. Klynger av brune adipocytter er også funnet i andre steder, inkludert supraklavikulære, infra/subscapular, cervical, paravertebral og periaortic Depot8,9.

I tillegg til deres plassering i store WAT og BAT Depot, adipocytter finnes i diskrete nisjer i hele kroppen4, hvor de kan utføre spesialiserte funksjoner innenfor sine respektive microenvironments. For eksempel, benmarg fettvev (BMAT) fungerer som et lipid reservoar, er en viktig kilde til sirkulerende adiponectin, og tett samhandler med osteoblaster, osteoklaster, og blodkreft cellene10,11. Dermal adipocytter bidrar til omfattende prosesser, inkludert sår helbredelse, immunrespons, termoregulering og hårsekken vekst12,13. Videre kan epicardial adipocytter produsere flere adipokines og chemokiner som utøver lokale og systemiske effekter på utvikling og progresjon av koronar arteriesykdom14. Utvidelse av Inter/intramuskulær WAT har blitt positivt korrelert med økt adiposity, systemisk insulinresistens, og redusert muskelstyrke og mobilitet15. I tillegg popliteal adipocytter tjene som et lipid reservoar for lymfatisk ekspansjon under infeksjon16. Mens de spesifikke rollene til ulike ledd lagre er generelt ukjent, er Hoffa Depot (infrapatellar) i kneet nå antatt å bidra til patologi, inkludert fremre kne smerter og slitasjegikt17.

Mens regionale forskjeller i adipocyte karakter og funksjon er under intens studie, er feltet for tiden begrenset av mangelen på en standardisert protokoll for identifisering og Disseksjon av ulike mus lagre. Tidligere publiserte metoder har vanligvis beskrevet isolering av ett eller to bestemte lagre og mangler det nivået av detaljer som kreves for ensartet forbrukeravgift18,19. Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet gir en omfattende guide for de spesifikke anatomiske steder og isolasjons trinn av mange forskjellige mus fettlagre. Selv om WAT Depot er Hovedfokuset i dette manuskriptet, er det fjerning av interscapular BAT også beskrevet i detalj. Fettvev excised bruker denne protokollen kan brukes til en rekke eksperimentelle endepunkter, inkludert explant studier, histologi, og genuttrykk analyser.

Målet med dette manuskriptet er å gi undersøkere en detaljert protokoll for å tydelig og presist identifisere og isolere både fremtredende og mindre studert mus fettlagre (figur 1). Denne ressursen vil lette en mer fullstendig undersøkelse av de utviklingsmessige, molekylære og funksjonelle egenskapene til adipocytter innen ulike nisjer.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av muse fettlagre dissekert i denne protokollen. Dette bildet er tilpasset fra bagchi et al., 20184. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer er utført med godkjennelse av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Michigan.

1. euthanization

Merk: For hensikten med denne video protokollen, er 4 til 6 måneder gamle C57BL/6J mus brukt.

  1. Plasser musen i en isoflurane fordamper kammer og justere isoflurane strømningshastighet til 5% eller høyere. Fortsett å isoflurane eksponeringen til ett minutt etter at pusten er stoppet. Deretter fjerner du musen fra fordamper kammeret og bekrefte dødshjelp bruker en godkjent sekundært mål.
    Merk: Godkjente sekundære tiltak vil variere etter institusjon og dyre protokoll og kan omfatte cervical forvridning eller halshogging.
  2. Plasser euthanized musen på disseksjon pannen. Sterilisere rygg og ventrale utvendige overflater på musen ved hjelp 70% etanol. Sørg for at den utvendige overflaten av musen er tilstrekkelig våt for å minimere forurensning fra pels under disseksjon.

2. identifisering og isolering av Major subkutan fett Ddepots (fremre subkutan, Dorsolumbar, lysken, gluteal) og interscapular Brown Aadipose tissue

  1. Identifisering og isolering av fremre subkutan Wat
    Merk: Fremre subkutan WAT ligger mellom scapulae, synkende fra nakken til axillae av musen7. Dette depotet har alternativt blitt beskrevet som suprascapularis8 eller interscapular20 Wat og Lies direkte på toppen av interscapular bat Depot.
    1. For å isolere den fremre subkutan Depot, legger musen på magen i en utsatt posisjon. Fest de øvre og nedre lemmer til disseksjon panne med disseksjon pinner.
    2. Bruk tang til å løfte rygg huden i nakken. Bruk Iris saks for å lage en liten (1 mm) skåret i huden.
    3. Sett inn ett blad av Iris saks i den første kutt og lage en midtlinjen vertikal snitt (2-3 cm) gjennom huden, begynner i nakken og synkende langs ryggraden til midt bak.
    4. Lag to horisontale snitt (1 cm hver) ved hjelp av Iris saks, som strekker seg sidelengs fra midtlinjen, øverst og nederst på den første vertikale snitt.
    5. Bruk tang for å forsiktig skrelle tilbake huden og utsett fremre subkutan Depot.
    6. Bruk Iris saks for å fjerne Depot etter naturlige grenser av vevet.
      Merk: Denne metoden isolerer både fremre subkutan WAT og interscapular BAT.
    7. Plasser dissekert Depot på disseksjon panorere og forsiktig fjerne forurensende BAT bruke Iris saks.
  2. Identifisering og isolering c LASSICAL bat
    Merk: Klassisk BAT ligger under den fremre subkutan WAT Depot.
    1. For å isolere BAT, bruk Iris saks til å kutte horisontalt langs den nederste kanten av fremre under Huds vev, etter den naturlige grensen av depotet.
    2. Deretter bruker Iris saks for å gjøre to vertikale snitt langs den laterale kantene av depotet, etter de naturlige grensene av vevet.
    3. Bruk tang for å nøye vende depotet opp og avslører Butterfly-formet interscapular BAT innebygd i WAT. Forsiktig analysere det BAT ut fra det omringer WAT.
  3. Identifisering og isolering bakre subkutan Wat,
    1. Legg musen på ryggen i en liggende posisjon.
    2. Etter sikring av øvre og nedre lemmer med disseksjon pinner, bruk tang for å løfte opp huden ved foten av brystbenet og lage en liten (1 mm) skåret i huden.
    3. Sett inn ett blad av Iris saks i den første kutt og lage en midtlinjen snitt (4-5 cm) gjennom huden, begynner ved foten av brystbenet og synkende til undersiden av halen. Vær forsiktig når du gjør dette snittet fordi ventrale huden er svært tynn og er nært knyttet til underliggende bukhulen veggen.
    4. Lag to horisontale snitt (1 cm hver) ved hjelp av Iris saks, som strekker seg sidelengs fra midtlinjen, på toppen av den første vertikale snitt.
    5. Bruk tang for å forsiktig skrelle tilbake huden fra bukhulen og beinet for å finne bakre subkutan WAT, som skal forbli forbundet med huden. Sikre utstrakt hud med disseksjon pinner for å lette fullstendig fjerning av WAT.
      Merk: Selv om den bakre subkutan WAT synes å være sammenhengende, er det faktisk består av tre diskrete lagre: dorsolumbar, lysken, og gluteal1. Dorsolumbar Depot strekker seg fra korsryggen til undersiden av hindlimb bentap. Den trekantede lysken Depot strekker seg fra bunnen av hindlimb bentap ventrally over lysken og inneholder en fremtredende lymfe node. Den gluteal Depot strekker forsiktig fra undersiden av lysken og brytes rundt beinet til undersiden av halen.

3. identifisering og isolering av visceral fettlagre (gonadal, Perirenal, retroperitoneal, Omental, perikard)

  1. Identifisering og isolering VISCERAL Wat lagre
    Merk: WAT Depot, som i stor grad finnes i bryst og bukhulen, holde musen i en liggende posisjon. Fest de øvre og nedre lemmer til disseksjon panne med disseksjon pinner.
    1. Bruk tang for å løfte opp den tynne bukhulen veggen ved foten av brystbenet og lage et lite kutt (1 mm) ved hjelp av Iris saks.
    2. Sett inn ett blad av Iris saks i kuttet og lage en synkende vertikal snitt (4-5 cm) fra toppen av bukhulen (undersiden av brystbenet) til endetarmen.
    3. Lag to horisontale snitt (1 cm hver) med Iris saks, som strekker seg sidelengs fra midtlinjen, på toppen og bunnen av den vertikale snitt.
    4. Bruk tang til å skrelle tilbake peritoneum og utsett bukhulen innholdet. PIN den utstrakte peritoneum til disseksjon Pan.
  2. Identifisering og isolering g onadal Wat
    Merk: Gonadal WAT omgir livmoren og eggstokkene i kvinner (eggstokkene eller parametrial) og bitestikkel og testiklene hos menn (epididymale). Eggstokker WAT omgir eggstokkene, livmoren og blære. Inne obese dyrene, gonadal og perirenal WAT kanne komme å bli sammenhengende — i dette tilfellet, separat det lagre for det livmor horn og eggstokkene. Epididymale WAT er funnet bundet til bitestikkel, testiklene, og den prominente epididymale blod fartøy.
    1. Finn gonader (testiklene eller eggstokkene) og bruke tang for å løfte opp tilhørende gonadal WAT.
    2. Bruk Iris saks til forsiktig avgiftsdirektoratet WAT fra gonader.
  3. Identifisering og isolering p erirenal Wat
    Merk: Perirenal WAT omgir nyrene bilateralt. I overvektige dyr, kan dette Depot synes å forlenge forsiktig til toppen av livmor horn og eggstokkene. Selv om perirenal Wat har tradisjonelt blitt klassifisert som en visceral Depot21, flere grupper har identifisert det som en brun Depot basert på avstamning tracing og radiolabeled glukose opptak studier8,9, 20. histologisk det består av en blanding av hvite og brune adipocytter.
    1. Til avgiftsdirektoratet den perirenal Depot, finne nyrene og bruke tang for å løfte den opp og dra den midtlinjen å se en klar divisjon mellom perirenal og retroperitoneal lagre.
    2. Avgiftsdirektoratet den WAT direkte forbundet med nyrene. Sørg for at binyrene, som ligger over nyrene, er fjernet fra WAT.
  4. Identifisering og isolering r etroperitoneal Wat
    Merk: Retroperitoneal WAT ligger i en paravertebral posisjon, langs grensen mellom den bakre bukveggen og ryggmargen.
    1. Til avgiftsdirektoratet dette Depot, bruk tang for å løfte nyrene opp og mot midtlinjen å tydelig se grensen mellom perirenal og retroperitoneal Depot.
      Merk: I overvektige dyr, identifisere denne grensen kan være utfordrende.
    2. Deretter bruker Iris saks å nøye analysere retroperitoneal WAT fra bakre bukhulen veggen.
  5. Identifisere og isolere omental WAT
    Merk: Omental WAT ligger langs større krumning av magen. Selv om omental fett er et viktig Depot i mennesker, er det vanligvis til stede bare i sykelig overvektige mus.
    1. For å identifisere visceral omental WAT, bruk tang for å løfte magen opp. Bruk Iris saks for å fjerne tilhørende fettvev langs dårligere grensen av magen. Ikke forveksle omental WAT med bukspyttkjertelen.
  6. Identifisere og isolere chrezbryzheechno Wat
    Merk: Chrezbryzheechno WAT er en Web-lignende struktur rundt og forbundet med små og store tarmen.
    1. Til avgiftsdirektoratet dette Depot, fjerne tarmen fra resten av fordøyelseskanalen ved å kutte på undersiden av magen og endetarmen. Bruk tang for å løfte tarmen ut av visceral hulrom og løse dem.
    2. Bruk Iris saks å forsiktig analysere det chrezbryzheechno WAT fjerne fra det tarmen, begynnelse for tolvfingertarmen og fortsetter å utgangen av det kolon. Forsiktig fjerne lymfeknuter som er nært knyttet til chrezbryzheechno Depot.
  7. Identifisere og isolere perikard WAT
    Merk: Perikard WAT ligger utenfor visceral pericardium og på den ytre overflaten av parietal pericardium, ofte langs den underlegne aspektet av hjertet14.
    1. For å få tilgang til bryst hulen, Hold musen i en liggende posisjon. Fest de øvre og nedre lemmer til disseksjon panne med disseksjon pinner.
    2. Bruk tang for å løfte xyphoid prosessen (brusk ved bunnen av brystbenet) og lage en liten (1 mm) kutt i bryst hulrom veggen.
    3. Sett inn ett blad av Iris saks i kuttet og lage to horisontale snitt (1 cm hver) som strekker sidelengs fra bunnen av brystbenet. Dette vil utsette membranen og nedre kant av bryst hulrommet.
    4. Bruk dissekere saks for å lage to stigende vertikale snitt (3 – 4 cm) gjennom brystkasse, som strekker seg superiorly fra de laterale kantene av bryst hulrommet til krageben.
    5. Bruk tang for å løfte opp den ventrale halvdelen av brystkasse. Bruk dissekere saks for å lage et endelig snitt (2 cm) langs den underlegne lengden på krageben for å fjerne brystkasse og eksponere bryst hulrom innholdet.
    6. Hvis gave, forsiktig analysere det perikard fett fra det ytre overflate av det pericardium.

4. identifisering og isolering av andre fettlagre

  1. Identifisere og isolere epicardial WAT
    Merk: Epicardial WAT er inneholdt i visceral pericardium og er direkte forbundet med overflaten av myokard.
    1. Hvis den finnes, kan epicardial adipocytter observeres histologisk etter isolering og fiksering av det perfusert hjertet i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer.
  2. Identifisering og isolering p opliteal Wat
    Merk: Popliteal WAT ligger i popliteal Fossa i bakre kneet og inneholder en stor lymfe node. Dette Depot er vanligvis ikke synlig hos unge dyr.
    1. Å isolere popliteal WAT, bruk Iris saks for å forsiktig fjerne huden fra undersiden av bakben lem lemmer til foten.
    2. Plasser patella mot disseksjon pannen og fest det utstrakte benet med en nål i foten. Kontroller at popliteal Fossa på baksiden av kneet vender oppover.
    3. Bruk Iris saks for å gjøre et kutt på den underlegne grensen av midtre og laterale hodene av gastrocnemius muskelen. Bruk tang for å løfte opp muskelen og avslører den trekantede popliteal Depot.
    4. Bruk Iris saks til avgiftsdirektoratet depotet langs naturlige vev grenser.
  3. Identifisering og isolering av dermal WAT
    Merk: Dermal WAT er et tynt lag av adipocytter som ligger mellom retikulære dermis og Panniculus carnosus muskel lag.
    1. For å identifisere dermal adipocytter ved histologiske metoder, Plasser musen på magen i en utsatt posisjon. Etter sikring av øvre og nedre lemmer med disseksjon pinner, spray den eksterne overflaten av musen med 70% etanol for å fukte huden.
    2. Bruk en skalpell til å fjerne den våte pelsen fra en firkantet del av huden på baksiden av musen.
    3. Bruk Iris saks til nøye avgiftsdirektoratet den barberte delen av huden, som vil omfatte retikulære dermis, dermal WAT, Panniculus carnosus, og noen subkutan WAT.
    4. Bruk en skalpell til å skjære den excised huden i tynne, vertikale striper.
    5. Plasser tynne vertikale striper med klebrig subkutan WAT lag vendt ned.
    6. Starter i den ene enden, rull stripen på seg selv for å danne en spiral. Prioritert subkutan WAT lag på utsiden av spiral vil tillate rullen å opprettholde sin form under fiksering.
    7. Plasser spiral i en brønn av en 24 brønn plate som inneholder 10% nøytral bufret formalin for 24 h før histologiske behandling22.
  4. Identifisere og isolere intermuscular WAT
    Merk: Intermuscular WAT er bredt definert som adipocytter ligger under dype konseptkjedene av muskler. Dette begrepet inkluderer adipocytter ispedd mellom muskelfibre av skjelettmuskulatur, også kjent som intramuskulær WAT, og adipocytter ligger innenfor muskelbunter selv. Wildtype mus generelt ikke har et stort antall intermuscular adipocytter. Imidlertid, det er en mulig under bestemt vilkårene å identifisere intermuscular WAT av histologiske metoder. Under noen forhold kan intermuscular adipocytter også finnes i glatte muskler, som for eksempel membranen.
    1. For å isolere tibialispuls fremre (TA) muskelen, for eksempel, Plasser musen på ryggen i en liggende posisjon og fest de nedre lemmer til disseksjon panorere ved hjelp av disseksjon pinner. Fukt huden med 70% etanol for å minimere forurensning med pels.
    2. Bruk Iris saks til å forsiktig fjerne huden fra benet og utsett quadriceps muskel gruppe, som ligger over kneet på femur akselen, og TA ligger under kneet på ventrale overflaten av Tibia.
      Merk: TA er tykk i nærheten av den proksimale enden av Tibia og mer tendinøse i nærheten av den kan avsluttes.
    3. Bruk Iris saks til avgiftsdirektoratet et stykke av muskelen og fastsette i 10% nøytral bufret formalin for 24 h før histologiske prosessering22.
  5. Identifisere og isolere WAT-lagre med intra-ledd
    Merk: WAT-synovial er lokalisert innenfor ledd.
    1. For å identifisere infrapatellar WAT, for eksempel ved histologiske metoder, høste Ben bein som beskrevet i BMAT delen.
    2. Etter fjerning av femur-tibial kompleks, bruk Iris saks og gasbind pads å fjerne så mye muskler og bindevev som mulig. Ikke Bryt tibiofemoral leddet.
    3. Fest femur-tibial kompleks i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer før Avkalking og histologiske behandling (beskrevet nedenfor, trinn 4.6.8).
  6. Identifisering og isolering av benmarg fettvev
    Merk: Benmarg fettvev (BMAT) finnes i bein, ispedd blodkreft celler. Anatomisk, BMAT kan klassifiseres som konstituerende (tilpasset Tibia og caudal ryggrad) eller regulert (Mid-til-proksimale Tibia, femur, og korsrygg ryggrad)10,11. Ren isolering av benmarg adipocytter for RNA-og protein analyser er utfordrende hos mus. Men, mus bein kan lett høstes, fast, decalcified og parafin-Embedded for histologiske analyser.
    1. For å høste Ben bein, for eksempel, først fjerne bena fra musa. Bruk disseksjon sakser til å skjære acetabulofemoral leddet og holde lårbenshodet intakt.
    2. Bruk Iris saks for å forsiktig fjerne huden fra benet, avslører beinet musklene.
    3. Forsiktig analysere bort de viktigste musklene fra femur og Tibia bruke Iris saks og gasbind pads.
    4. Når femur er eksponert, følg kanten av benet til ledd av bekkenet og femur og løsne forsiktig lårbenshodet fra acetabulofemoral leddet. Bruk gasbind til å rense eventuelle gjenværende vev fra femur.
    5. Følg grensen av Tibia til ankelen felles. Forsiktig løsne midtre Malleolus, som ligger på tuppen av Tibia, fra ankelen felles.
    6. Når femur-tibial komplekset har blitt isolert, fjerne så mye muskler og bindevev som mulig ved hjelp av Iris saks og/eller gasbind.
    7. Skill Tibia fra femur ved å sette inn ett blad av Iris saks i tibiofemoral felles og forsiktig skjære gjennom midtre og lateral sikkerhet leddbånd og de fremre og bakre cruciate leddbånd. Ikke Fjern kapselen på kneleddet for å sikre at Tibia forblir intakt. Bruk gasbind til å rense eventuelle gjenværende vev fra Tibia.
    8. Fix bein i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer ved romtemperatur og deretter vaske og lagre i henhold til fremtidige behov.
      1. For å analysere Ben parametre ved hjelp av microcomputed tomografi (Benvolum), Oppbevar bein i Sorensen ' s fosfat buffer, pH 7,423.
      2. For BMAT kvantifisering og histologiske analyser, avkalke bein i 14% EDTA, pH 7,4, for 10-14 dager.
      3. Etter Avkalking, bruk Osmium tetroxide farging og Benvolum analyse for å kvantifisere BMAT24. Ellers, prosess og parafin-embed bein for histologi23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket identifisering og isolering av ulike mus fettlagre kan oppnås ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor. Den grove anatomiske plasseringen av subkutan (A, E-F), brunt (B), visceral (C, D, G-J), og popliteal (K) lagre er vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2: brutto anatomiske steder av mus fettlagre. Brutto anatomi av (A) fremre subkutan, (b) Brown, (C) epididymale (b, blære), (D) eggstokkene (u, livmor horn), (E) bakre subkutan (dorsolumbar (D), lysken (i), gluteal (g)), (F) lysken, (G) chrezbryzheechno, (h) perirenal (k, nyre), (I) retroperitoneal (k, nyre), (J) perikard (H, hjerte), og (k) popliteal fettlagre i C57BL/6J voksen mus. Piler peker på spesifikke lagre hvis flere lagre er avbildet. Relevante organer er utpekt av passende bokstaver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Histologiske karakteristikker av subkutan (A-D), brun (E), visceral (F-K), popliteal (L), konstituerende (M) og regulert marg fett (N), intramuskulær (O), og infrapatellar (P) fettlagre ble evaluert av Hematoksylin og Eosin (H & E) farging22 og er vist i Figur 3.

Figure 3
Figur 3: histologiske evaluering av diskret mus fettlagre. Histologi av (A) fremre subkutan, (B) dorsolumbar, (C) lysken, (D) gluteal, (E) brun, (F) gonadal, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) chrezbryzheechno, (K) perikard, (L) popliteal, (M) konstituerende og (N) regulert benmarg fett, (O) Intermuscular, og (P) infrapatellar lagre i C57BL/6J voksen mus. Vev ble isolert i henhold til den gitte protokollen, faste overnatter i 10% nøytral bufret formalin, behandlet, og innebygd i parafin. 5 μm seksjoner ble farget med H & E. De fleste bildene ble tatt med 100% forstørrelse. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ettersom viktigheten av de mangfoldige molekylære og funksjonelle egenskapene til diskrete adipocyte klynger blir stadig mer anerkjent, er det avgjørende at undersøkere i felten kan identifisere og toll lagre for videre analyser. Til dags dato finnes det få protokoller for standardisert lokalisering og isolering av det brede spekteret av mus fettlagre. Tidligere publiserte metoder er fokusert primært på en eller to depot og mangler de nødvendige detaljene for ensartet identifisering og fjerning av ulike etterforskere18,19. Dette manuskriptet er en roman og viktig bidrag til feltet av fett biologi siden det gir en grundig guide til den anatomiske plasseringen og presis Disseksjon av ofte studert og mindre kjente lagre gjennom musen. Brutto anatomiske plassering og histologiske analyser er gitt for å demonstrere mangfoldet av adipocyte nisjer.

Vellykket isolering av diskrete fettlagre ved hjelp av denne protokollen er avhengig av flere kritiske trinn. Vedlikehold av et rent disseksjon miljø er avgjørende; 70% etanol kan brukes som nødvendig for å fjerne forurensende hår eller blod fra disseksjon skuffen og verktøy. Når isolere bakre subkutan WAT, er det viktig at den innledende snitt i huden ikke trenge inn i nært knyttet bukhulen slik at de to lagene kan effektivt skilles å avdekke WAT. På samme måte, når du skjærer gjennom bukveggen for å avdekke innholdet i bukhulen, må snittene ikke perforere det underliggende tarmen for å hindre forurensning med fordøyelses elementer. Interscapular BAT må nøye excised fra det omgivende vevet for å hindre at WAT-forurensning, som vil skew fremtidige analyser. Konsistent identifisering av bakre subkutan dorsolumbar, lysken, og gluteal Depot avhenger av utnyttelsen av presise anatomiske landemerker beskrevet i protokollen. Skillet mellom disse lagre er spesielt viktig; Selv om lagre kan synes å være kontinuerlig, sentralt plassert lysken adipocytter tilegne brune-lignende egenskaper lettere enn sine omkringliggende kolleger.

Fettvevet isolert ved hjelp av denne protokollen kan analyseres ved hjelp av en rekke teknikker. I tillegg til histologiske evaluering (f. eks H & E farging, immunhistokjemi), kan fettvev brukes til et bredt spekter av molekylære analyser, fra regulering av transkripsjon gjennom å posttranslational protein modifikasjoner. Adipocytter og stromal vaskulære celler innenfor individuelle lagre kan isoleres ved kollagenase fordøyelse og differensial sentrifugering. Disse fraksjoner kan deretter brukes til molekylær, metabolske, og cellekultur studier. Depot explants kan også brukes til ex vivo metabolske-og enzymatisk analyser.

Flere utfordringer og begrensninger oppstår under isolasjon og fjerning av mus fettvev. Først, noen lagre som er fysiologisk viktig i mennesker er ikke vanligvis til stede i mager, voksen mus. For eksempel, omental WAT, som er den store visceral Depot i mennesker, kan bare sees i genetisk eller diett-indusert overvektige mus. Utvidelsen av noen lagre kan imidlertid bli indusert av ernæringsmessige utfordringer eller narkotika behandlinger. For eksempel, høyt fett kosthold fôring kan føre til utvidelse av omental og perikard WAT. Intermuscular Wat kan være indusert av skjelettlidelser muskel skade25,26 eller høy fett diett27. Regulert BMAT utvides som svar på ulike utfordringer, inkludert høy fett diett, kalori begrensning og tiazolidindion behandling11,28. For det andre, på grunn av den lille størrelsen på mus, kan det være vanskelig å få nok prøve for molekylær eller metabolske analyser. For eksempel er isolering av nok ren benmarg adipocytter for etterfølgende analyser utfordrende, selv etter pooling bein fra flere mus. For det tredje kan det være vanskelig å definere grensene for visse lagre på en nøyaktig måte. For eksempel, bakre subkutan WAT synes å være en kontinuerlig Depot, men er faktisk består av diskret dorsolumbar, lysken, og gluteal lagre. I tillegg kan perirenal synes å være smeltet til både gonadal og retroperitoneal lagre i svært overvektige dyr. Mangelen på distinkte grenser mellom tilstøtende lagre kan gjøre rent isolering av disse vev utfordrende. Imidlertid gir denne disseksjon protokollen etterforskere med en detaljert Atlas og trinnvis veiledning for nøyaktig og reproduserbar Disseksjon av et bredt spekter av mus fettlagre. Felt-Wide standardisering av identifisering og isolering av diskrete mus fettlagre beskrevet ovenfor vil utvilsomt hjelpe ytterligere belyse forskjeller i utvikling, genuttrykk, og lokale og systemiske funksjoner av tidligere under-studert adipocyte nisjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

O.A.M. er støttet av NIH tilskudd DK062876 og DK092759; D.P.B. er støttet av University of Michigan medisinsk forsker opplæringsprogram (T32GM007863), University of Michigan Training program i organogenesen (T32HD007605), University of Michigan Rackham Merit Fellowship, og Tylenol Future Care Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Fisher Scientific 22-110-869
24-well plates, untreated Sigma-Aldrich CLS3738
70% ethanol (dilute from 95%) Fisher Scientific 04-355-226
Dissecting forceps with curved tips VWR 89259-946
Dissecting pan Carolina Biological Supply Company 629004
Dissecting scissors (sharp/blunt tip) VWR 82027-588
Gauze sponges Vitality Medical 2634 Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply
Handi-Pins for dissection Carolina Biological Supply Company 629132
Iris scissors (straight) VWR 470018-890
Isoflurane VetOne 501017
Scalpel VWR 100499-578 Feather scalpel handle with blade, disposable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
  4. Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
  5. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  6. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  7. Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
  8. Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
  9. Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
  10. Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
  11. Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
  12. Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
  13. Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
  14. Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
  15. Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
  16. Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
  17. Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
  18. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
  19. Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
  20. de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
  21. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
  22. Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
  23. Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
  24. Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
  25. Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
  26. Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
  27. Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
  28. Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).

Tags

Biologi Adipocyte disseksjon subkutan fettvev visceral fettvev hvit fettvev (WAT) brunt fettvev (BAT) benmarg fettvev (BMAT)
Identifisering og Disseksjon av diverse mus fettlagre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bagchi, D. P., MacDougald, O. A.… More

Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. J. Vis. Exp. (149), e59499, doi:10.3791/59499 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter