Summary
Адипоциты существуют в дискретных складах и играют различные роли в своей уникальной микросреде. По мере выявления региональных различий в характере и функциях адипоцитов стандартизированная идентификация и изоляция складов имеет решающее значение для развития этой области. В этом виде мы представляем подробный протокол для иссечения различных складов мыши.
Abstract
Адипозные ткани являются сложными органами с широким спектром функций, включая хранение и мобилизацию энергии в ответ на местные и глобальные потребности, разъединение метаболизма для генерации тепла, и секреция адипокин для регулирования гомеостаза всего тела и иммунных реакций. Новые исследования выявляют важные региональные различия в развитии, молекулярном и функциональном профилях адипоцитов, расположенных в дискретных складах по всему телу. Различные свойства складов имеют отношение к медицине, так как метаболические заболевания часто демонстрируют депо-специфические эффекты. Этот протокол предоставит следователям подробный анатомический атлас и руководство по вскрытию для воспроизводимой и точной идентификации и иссечения различных тканей ужировающих мышей. Стандартизированное вскрытие дискретных жировые отложенные склады позволит детально составить сравнение их молекулярных и метаболических характеристик и вклада в местные и системные патологические состояния при различных питательных и экологических условиях.
Introduction
Адипологические ткани играют важную роль в гомеостазе всего тела, включая хранение и высвобождение энергии в ответ на местные и глобальные потребности, терморегуляцию и секрецию адипокин для регулирования энергетического баланса, метаболизма и иммунных реакций1 , 2. Адипоциты распространяются по всему телу в дискретных депо, ав некоторых случаях служат специализированные роли в их микросреде 3,4,5. Исторически, изучение жировой ткани была сосредоточена на белой жировой ткани (WAT), и его роль в поддержании энергии гомеостаза. Большинство адипоцитов распространяются по всему телу в подкожных и висцеральных складах WAT. Характеристики этих складов важны для дифференциальной восприимчивости к метаболическим заболеваниям. Подкожные адипоциты, расположенные под кожей, были связаны с защитными метаболическими эффектами5. Висцеральные адипоциты, которые окружают жизненно важные органы и содержатся в гонаде, перирубальной, ретроперитонеальной, оментальной и перикардной депо, обычно связаны с нарушениями обмена веществ, включая диабет 2 типа и сердечно-сосудистые заболевания2 . Коричневые жировые ткани (БАТ) также были изучены широко. Коричневые и коричневые адипоциты выражают разъединение белка 1 (UCP1) и играют важную роль в адаптивном термогенезе и гомеостазе глюкозы6,7. Классические коричневые адипоциты содержатся в межпромбазе BAT8. Кластеры коричневых адипоцитов также встречаются в других местах, в том числе супраклавикулярных, инфра/подскапкулярных, шейных, парапозвоночных и периаортных складов8,9.
В дополнение к их расположению в крупных штатах WAT и BAT, адипоциты существуют в дискретных нишах по всему телу4,где они могут выполнять специализированные функции в пределах их соответствующих микросред. Например, жировая ткань костного мозга (BMAT) служит липидным резервуаром, является основным источником циркулирующего адипонектина и тесно взаимодействует с остеобластами, остеокластастами и гематопоитическими клетками10,11. Дермальные адипоциты способствуют широко распространенным процессам, включая заживление ран, иммунный ответ, терморегуляцию и рост волосяного фолликула12,13. Кроме того, эпикардиальные адипоциты могут производить несколько адипокин и хемокины, которые оказывают местное и системное воздействие на развитие и прогрессирование ишемической болезни сердца14. Расширение меж/внутримышечного ВАТ положительно коррелирует с повышенной ожирению, системной резистентностью к инсулину и снижением мышечной силы и подвижности15. Кроме того, поплитые адипоциты служат липидным резервуаром для лимфатического расширения во время инфекции16. Хотя конкретные роли различных суставных депо, как правило, неизвестны, Хоффа депо (инфрапателлар) в колене в настоящее время считается способствовать патологии, в том числе передние боли в колене и остеоартрит17.
В то время как региональные различия в характере и функции адипоцитов находятся в интенсивном изучении, в настоящее время эта область ограничена отсутствием стандартизированного протокола для идентификации и вскрытия различных складов мышей. Ранее опубликованные методы, как правило, описаны изоляции одного или двух конкретных складов и отсутствие уровня детализации, необходимого для равномерного иссечения18,19. Протокол, описанный в данной рукописи, содержит всеобъемлющее руководство по конкретным анатомическим местам и шагам изоляции различных складов мыши. Хотя склады WAT являются основным направлением этой рукописи, иссечение интерлопатулярного BAT также подробно описано. Адипогенные ткани, вырезанные с помощью этого протокола, могут быть использованы для широкого спектра экспериментальных конечных точек, включая экстраплантные исследования, гистологию и анализ экспрессии генов.
Цель этой рукописи заключается в предоставлении следователям подробный протокол, чтобы четко и точно определить и изолировать как видные и менее изучены мыши жировой складов (Рисунок 1). Этот ресурс будет способствовать более полному исследованию развития, молекулярных и функциональных характеристик адипоцитов в различных нишах.
Рисунок 1: Схематическое изображение складов мыши, расчлененных в этом протоколе. Этот образ был адаптирован из Bagchi и др., 20184. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных выполняются с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Мичиганского университета.
1. Эвтанизация
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей этого видеопротокола используются мыши от 4 до 6 месяцев.
- Поместите мышь в изофрураническую испарительную камеру и отрегулируйте скорость потока изофруран до 5% или больше. Продолжить воздействие изолюрандов до одной минуты после остановки дыхания. Затем удалите мышь из испарительной камеры и подтвердите эвтаназию с помощью утвержденной вторичной меры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Утвержденные вторичные меры будут варьироваться в зависимости от институционального и животного протокола и могут включать вывих шейки матки или обезглавливание. - Поместите эвтаназии мыши на вскрытие кастрюлю. Стерилизовать напорные и брюшные внешние поверхности мыши с помощью 70% этанола. Убедитесь, что внешняя поверхность мыши достаточно влажная, чтобы свести к минимуму загрязнение от меха во время вскрытия.
2. Идентификация и изоляция основных подкожных адизирующих ddepots (передний подкожный, Дорсолумбар, Ингуиналь, Глутиал) и Interscapular браун aadipose Ткани
- Выявление и изоляция передней подкожной ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Передняя подкожная ВАТ расположена между лопатками, спускающимися с затылка к акилле мыши7. Это депо альтернативно было описано как супраскаполярный8 или interscapular20 WAT и лежит непосредственно на вершине межпроспяшного депо BAT.- Чтобы изолировать переднее подкожное депо, положите мышь на живот в склонном положении. Закрепите верхние и нижние конечности до расекции кастрюлю с рассечением булавки.
- Используйте щипцы для подъема сонной кожи на затылке. Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать небольшой (1 мм) вырезать в коже.
- Вставьте одно лезвие ножниц радужной оболочки в начальный разрез и сделайте средний вертикальный разрез (2-3 см) через кожу, начиная с затылка и спускаясь вдоль позвоночника к середине спины.
- Сделайте два горизонтальных разреза (по 1 см каждый) с помощью ножниц радужной оболочки глаза, простираясь боково от средней линии, в верхней и нижней части первоначального вертикального разреза.
- Используйте щипки, чтобы тщательно очистить кожу и разоблачить передний подкожный депо.
- Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы удалить депо после естественных границ ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод изолирует как передний подкожный WAT, так и межлопатулярный BAT. - Поместите расчлененный депо на кастрюлю вскрытия и тщательно удалите загрязняющие BAT с помощью ножниц радужной оболочки глаза.
- Выявление и изоляция c лассический BAT
ПРИМЕЧАНИЕ: Классический BAT расположен под передней подкожной WAT депо.- Чтобы изолировать BAT, используйте ножницы радужной оболочки, чтобы сократить горизонтально вдоль нижнего края передней подкожной ткани, после естественной границы депо.
- Затем используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать два вертикальных разреза вдоль боковых краев депо, следуя естественным границам ткани.
- Используйте щипцы, чтобы тщательно перевернуть депо и выявить бабочка формы interscapular BAT встроенных в WAT. Тщательно вскрыть BAT из окружающих WAT.
- Выявление и изоляция задний подкожный ВАТ,
- Положите мышь на спину в положении на спине.
- После обеспечения верхней и нижней конечностей с рассечением булавки, используйте щипцы, чтобы поднять кожу у основания грудины и сделать небольшой (1 мм) вырезать в коже.
- Вставьте одно лезвие ножниц радужной оболочки в начальный разрез и сделайте разрез средней линии (4-5 см) через кожу, начиная с основания грудины и спускаясь к основанию хвоста. Упражнение осторожность при принятии этого разреза, потому что брюшной кожи очень тонкий и тесно связан с основной стенки полости.
- Сделайте два горизонтальных разреза (по 1 см каждый) с помощью ножниц радужной оболочки глаза, простираясь боково от средней линии, в верхней части первоначального вертикального разреза.
- Используйте щипцвы, чтобы тщательно очистить кожу от перитонеальной полости и ноги, чтобы найти заднюю подкожную ВАТ, которая должна оставаться связанной с кожей. Защищайте протянутую кожу с помощью раскряжевки, чтобы облегчить полное иссечение WAT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя задний подкожный WAT, как представляется, непрерывный, на самом деле состоит из трех дискретных депо: дорсолумбар, ингалин, и ягодичный1. Дорсолумбар депо простирается от поясничного отдела позвоночника до основания задней конечности. Треугольное паховой депо простирается от основания задних вентилируемых вентало через пах и содержит видные лимфатические узлы. Ягодичный склад простирается неполноценно от основания паха и обертывает сядр вокруг ноги к основанию хвоста.
3. Идентификация и изоляция висцеральных адипосных складов (Гонадаль, Периренал, Ретроперитонеал, Оменталь, Перикард)
- Выявление и изоляция висцеральные склады WAT
ПРИМЕЧАНИЕ: WAT депо, которые в значительной степени содержатся в грудной и перитонеальной полости, держать мышь в положении на спине. Закрепите верхние и нижние конечности до расекции кастрюлю с рассечением булавки.- Используйте щипцы, чтобы поднять тонкую стенку полости полости у основания грудины и сделать небольшой разрез (1 мм) с помощью ножниц радужной оболочки глаза.
- Вставьте одно лезвие ножниц радужной оболочки в разрез и сделайте нисходящий вертикальный разрез (4-5 см) от верхней части полости перитонеальной (основание грудины) в прямую кишку.
- Сделайте два горизонтальных разреза (по 1 см каждый) ножницами радужной оболочки глаза, простираясь боково от средней линии, в верхней и нижней части вертикального разреза.
- Используйте щипки, чтобы очистить брюненность и разоблачить содержимое брюшной полости. Прикрепите протянутую перитонеум к кастрюле вскрытия.
- Выявление и изоляция г onadal ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Гонадный WAT окружает матку и яичники у самок (яичников или параметрик) и эпидидимис и яички у мужчин (эпидидимальный). ВАТ яичников окружает яичники, матку и мочевой пузырь. У животных, страдающих ожирением, гонадальный и периренальный WAT может показаться непрерывным - в этом случае, отдельные депо на рога матки и яичников. Эпидидимальный WAT находится связанный с эпидидимисом, яичком и видным эпидидимальным кровеносным сосудом.- Найдите гонады (яички или яичники) и используйте щипцы, чтобы поднять связанные гонадаль НЫЙ ВАТ.
- Используйте ножницы радужной оболочки глаза тщательно акцизВАТЫй WAT от гонад.
- Выявление и изоляция р эриренальный ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Периренальная WAT окружает почки на двусторонней основе. В тучных животных, это депо может показаться, что удлиняет inferiorly к верхней части утробного рожочка и завязей. Хотя периренальный WAT традиционно классифицируется как висцеральный депо21, несколько групп определили его как коричневый депо на основе отслеживания линии и радиомаркировки исследования поглощения глюкозы8,9, 20. Гистологически состоит из смеси белых и коричневых адипоцитов.- Чтобы вырезать периренального депо, найти почки и использовать щипцы, чтобы поднять его и потяните его средней линии, чтобы увидеть четкое разделение между периренальных и ретроперитонеальных складов.
- Акциз WAT непосредственно связанс с почками. Убедитесь, что надпочечники, расположенные над почками, удаляются из WAT.
- Выявление и изоляция г этроперитонеальный ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Ретроперитонеальный WAT расположен в парапозвоночном положении, вдоль границы между задней брюшной стенкой и спинным мозгом.- Чтобы подрезать это депо, используйте щипцы, чтобы поднять почку вверх и к средней линии, чтобы четко видеть границу между периреналью и ретроперитонеальными складами.
ПРИМЕЧАНИЕ: У животных, страдающих ожирением, определение этой границы может быть сложной задачей. - Затем используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы тщательно вскрыть ретроперитонеальный WAT от задней перитонеальной стены.
- Чтобы подрезать это депо, используйте щипцы, чтобы поднять почку вверх и к средней линии, чтобы четко видеть границу между периреналью и ретроперитонеальными складами.
- Выявление и изоляция оментального ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Оментальный WAT расположен вдоль большей кривизны желудка. Хотя оментальный жировой является важным депо у людей, как правило, присутствует только в болезненно ожирением мышей.- Для выявления висцерального озномонного WAT, используйте щипцдляет, чтобы поднять желудок вверх. Используйте ножницы радужной оболочки, чтобы удалить связанные жировой ткани вдоль нижней границы желудка. Не путайте оментальный WAT с поджелудочной железой.
- Выявление и изоляция мезентерии ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Mesenteric WAT представляет собой веб-подобную структуру, окружающую и связанную с тонким и толстым кишечником.- Чтобы вырезать этот депо, удалить кишечник из остальной части пищеварительного тракта путем разрезания в основании желудка и прямой кишки. Используйте щипцы, чтобы поднять кишечник из висцеральной полости и разгадать их.
- Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы тщательно вскрыть мезентерические WAT от кишечника, начиная с двенадцатиперстной кишки и продолжается до конца толстой кишки. Тщательно удалите лимфатические узлы, которые тесно связаны с мезентерическим депо.
- Выявление и изоляция перикардиальной WAT
ПРИМЕЧАНИЕ: Перикардный WAT расположен за пределами висцерального перикарда и на внешней поверхности теменной перикарда, часто вдоль нижнего аспекта сердца14.- Чтобы получить доступ к грудной полости, держите мышь в положении на спине. Закрепите верхние и нижние конечности до расекции кастрюлю с рассечением булавки.
- Используйте щипцов, чтобы поднять процесс ксифоидного (хряща у основания грудины) и сделать небольшой (1 мм) разрез в грудной полости стенки.
- Вставьте одно лезвие ножниц радужной оболочки в разрез и сделайте два горизонтальных разреза (по 1 см каждый), простирающихся позже от основания грудины. Это позволит разоблачить диафрагму и нижнюю границу грудной полости.
- Используйте расчленяющие ножницы, чтобы сделать два восходящих вертикальных разреза (3-4 см) через грудную клетку, простираясь превосходно от боковых границ грудной полости до ключицы.
- Используйте щипки, чтобы поднять брюшной половины грудной клетки. Используйте рассекающие ножницы, чтобы сделать окончательный разрез (2 см) вдоль нижней длины ключицы, чтобы удалить грудную клетку и разоблачить содержимое грудной полости.
- При наличии, тщательно вскрыть перикардиальный жировой от внешней поверхности перикарда.
4. Идентификация и изоляция других жировые склады
- Выявление и изоляция эпикардиального ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпикардиальный WAT содержится в висцеральном перикарде и напрямую связан с поверхностью миокарда.- При наличии эпикардиальных адипоцитов можно наблюдать гистологически после изоляции и фиксации пронизанного сердца в 10% нейтральный буферизированный формалин на 24 ч.
- Выявление и изоляция р оплитал ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Popliteal WAT расположен в поплийской ямке в задней колене и содержит большой лимфатический узло. Это депо обычно не видно у молодых животных.- Чтобы изолировать popliteal WAT, используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы тщательно удалить кожу от основания задней конечности к ноге.
- Поместите коленку против вскрытия кастрюлю и обеспечить протянутую ногу с булавкой в ноге. Убедитесь, что popliteal ямки в задней части колена сталкивается вверх.
- Используйте ножницы радужной оболочки, чтобы сделать разрез на нижней границе медиальных и боковых головок гастрокнемии мышцы. Используйте щипцы, чтобы поднять мышцы и выявить треугольной popliteal депо.
- Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы подрезать депо вдоль естественных границ ткани.
- Выявление и изоляция кожного WAT
ПРИМЕЧАНИЕ: Дермальный WAT представляет собой тонкий слой адипоцитов, расположенных между ретикулярной дермы и panniculus карносмышечного мышечного слоя.- Чтобы определить дермальные адипоциты гистологическими методами, поместите мышь на живот в лежачем положении. После обеспечения верхней и нижней конечностей с рассечением булавки, спрей внешней поверхности мыши с 70% этанола для мокрой кожи.
- Используйте скальпель, чтобы удалить смаченный мех из квадратной части кожи на задней части мыши.
- Используйте ножницы радужной оболочки глаза тщательно акцизной бритой части кожи, которая будет включать ретикулярной дермы, кожные WAT, panniculus карнос, и некоторые подкожные WAT.
- Используйте скальпель, чтобы разрезать вырезанную кожу на тонкие вертикальные полоски.
- Расположите тонкие вертикальные полоски липким подкожным слоем WAT лицом вниз.
- Начиная с одного конца, свернуть полосу на себя, чтобы сформировать спираль. Липкий подкожный слой WAT на внешней стороне спирали позволит рулону поддерживать свою форму во время фиксации.
- Поместите спираль в колодец 24 хорошо пластины, содержащие 10% нейтральный буферный формалин в течение 24 ч до гистологической обработки22.
- Выявление и изоляция межмышечного ВАТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Межмышечный WAT широко определяется как адипоциты, расположенные под глубокой фасцией мышц. Этот термин включает в себя адипоциты перемежаются между мышечными волокнами скелетных мышц, также известный как внутримышечный WAT, и адипоциты, расположенные в мышечных пучков себя. Дикие мыши, как правило, не имеют большого количества межмышечных адипоцитов. Тем не менее, это возможно при определенных условиях для выявления межмышечного ВАТ гистологическими методами. В некоторых условиях, межмышечные адипоциты также могут быть найдены в гладких мышц, таких как диафрагма.- Чтобы изолировать переднюю (TA) мышцу tibialis (TA), поместите мышь на спину в положении на спине и закрепите нижние конечности в кастрюлю рассечения с помощью расекционных штырей. Влажная кожа с 70% этанола, чтобы свести к минимуму загрязнение мехом.
- Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы тщательно удалить кожу из ноги и подвергать четырехглавой мышечной группы, расположенной выше колена на вал бедренной кости, и TA расположен ниже колена на брюшной поверхности голени.
ПРИМЕЧАНИЕ: TA толщиной вблизи проксимального конца голени и более тенденционные вблизи дистального конца. - Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы акциз кусок мышцы и исправить в 10% нейтральный буферный формалин в течение 24 ч до гистологической обработки22.
- Выявление и изоляция внутрисуставных складов WAT
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрисуставные склады WAT расположены в синовиальных суставах.- Для выявления инфрапалларА WAT, например, гистологическими методами, собираем кости ног, описанные в разделе BMAT.
- После удаления бедренной кости-tibial комплекса, использовать ножницы радужной оболочки глаза и марлевые прокладки, чтобы удалить как можно больше мышц и соединительной ткани, как это возможно. Не ломайте тибиофморальный сустав.
- Исправить бедренно-тосомного комплекса в 10% нейтральный буферный формалин в течение 24 ч до декальцинации и гистологической обработки (описано ниже, шаг 4.6.8).
- Выявление и изоляция жировой ткани костного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань жирового костного мозга (BMAT) содержится в костях, перемежается с гематоподитическими клетками. Анатомически, BMAT можно классифицировать как составные (дистальный глений и каудаальных позвонков) или регулируется (средний до проксимальной голени, бедренной кости и поясничных позвонков)10,11. Чистая изоляция адипоцитов костного мозга для РНК и белковых анализов является сложной задачей у мышей. Тем не менее, кости мыши могут быть легко собраны, фиксированные, декальцинированные и парафин-встроенные для гистологического анализа.- Для сбора костей ног, например, сначала снимите ноги с мыши. Используйте вскрытие ножницы, чтобы сократить ацетабулофеморальный сустав, сохраняя бедренную голову нетронутыми.
- Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы тщательно удалить кожу с ноги, выявление мышц ног.
- Тщательно вскрыть основные мышцы от бедренной кости и голени с помощью ножниц радужной оболочки глаза и марлевые подушечки.
- Когда бедренная кость подвергается, следуйте краю кости к артикуляции таза и бедренной кости и тщательно освободить бедренную голову от ацетабулофеморального сустава. Используйте марлю для очистки любых оставшихся тканей от бедренной кости.
- Следуйте по границе голени к голеностопного сустава. Тщательно отпустите медианный моллеол, расположенный на кончике голени, из голеностопного сустава.
- После того, как бедренно-тибиальный комплекс был изолирован, удалите как можно больше мышечной и соединительной ткани с помощью ножниц радужной оболочки глаза и/или марли.
- Отделите голени от бедренной кости, вставив одно лезвие ножниц радужной оболочки в желоба и аккуратно прорежьте медиальные и боковые коллатеральные связки и передние и задние крестообразные связки. Не удаляйте капсулу коленного сустава, чтобы гарантировать, что голени остается нетронутым. Используйте марлю для очистки любых оставшихся тканей из голени.
- Исправить кости в 10% нейтральный буферный формалин для 24 ч при комнатной температуре, а затем мыть и хранить в соответствии с будущими потребностями.
- Для анализа параметров костей с помощью микрокомпьютерной томографии (ККТ) храните кости в фосфатном буфере Соренсена, рН 7.423.
- Для количественного анализа BMAT и гистологического анализа, декальцифифицировать кости в 14% EDTA, рН 7.4, в течение 10-14 дней.
- После декальцинации, используйте осмий тетрокода окрашивания и анализа ЗКТ для количественной оценки BMAT24. В противном случае, процесс и парафин-вставлять кости для гистологии23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешная идентификация и изоляция различных складов мыши может быть достигнута с помощью протокола, описанного выше. Грубые анатомические расположения подкожных (A, E-F), коричневых (B), висцеральных (C, D, G-J) и поплитальных (K) складов показаны на рисунке 2.
Рисунок 2: Валовые анатомические расположения складов мышь-жиров. Валовая анатомия (A) передняя подкожная, (B)коричневая, (C) эпидидимальная (b, мочевой пузырь), (D) яичников (u, маточные рога), (E) задняя подкожная (dorsolumbar (d), inguinal (i), ягодичный (g)), (F) паховой, (G) мезентерии, (H) периренал (к, почки), (I) ретроперитонеальный (к, почки), (J) перикардиал (h, сердце), и (K) popliteal жировые склады в C57BL/6J взрослых мышей. Стрелки указывают на конкретные склады, если изображено несколько складов. Соответствующие органы определяются соответствующими буквами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Гистологические характеристики подкожного (A-D), коричневого (E), висцерального (F-K), поплитеального (L), составного (M) и регулируемого жирового мозга (N), внутримышечного (O) и инфрапателяра (P) жировые склады были оценены Гематоксином и Эозином (H и E) окрашивание22 и показаны на рисунке 3.
Рисунок 3: Гистологическая оценка дискретных складов мыши. Гистология (A) передней подкожной, (B) dorsolumbar, (C) ингационные, (D) ягодичный, (E) коричневый, (F) гонадаль, (G) перирубальный, (H) ретроперитонеальный, (I) осценительный, ( J) мезентерия, (K) перикардиальный, (L) popliteal, (M) constitutive и (N ) регулируется жировой костного мозга, (O) межмышечные, и (( P) infrapatellar складов в C57BL/6J взрослых мышей. Ткани были изолированы в соответствии с данным протоколом, зафиксированы на ночь в 10% нейтральных буферизированных формалин, обработаны, и встроенные в парафин. 5 мкм разделы были окрашены Н И Е. Большинство изображений были сделаны при 100-м увеличении; Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поскольку все шире признается важность разнообразных молекулярных и функциональных характеристик дискретных адипоцитных кластеров, крайне важно, чтобы исследователи в поле единообразно выявляли и высечивали склады жиров для дальнейшего анализа. На сегодняшний день существует несколько протоколов для стандартизированной локализации и изоляции широкого спектра складов мыши. Ранее опубликованные методы ориентированы в первую очередь на один или два склада и отсутствие деталей, необходимых для единой идентификации и иссечения различными следователями18,19. Данная рукопись является новым и важным вкладом в область жировой биологии, поскольку она обеспечивает углубленное руководство по анатомическому местоположению и точному вскрытию широко изученных и менее известных складов по всей мыши. Для демонстрации разнообразия ниш адипоцитов предоставляются грубая анатомическая локация и гистологический анализ.
Успешная изоляция дискретных жировые склады с использованием этого протокола зависит от нескольких критических шагов. Поддержание чистой среды вскрытия имеет решающее значение; 70% этанола может быть использован по мере необходимости для удаления загрязняющих волос или крови из вскрытия лоток и инструментов. При изоляции задней подкожной WAT, крайне важно, чтобы первоначальный разрез в коже не проникает тесно связанных перитонеальной полости, так что два слоя могут быть эффективно разделены подвергать WAT. Аналогичным образом, при прорезке через брюшную стенку, чтобы разоблачить содержимое брюшной полости, разрезы не должны перфорировать основной кишечник, чтобы предотвратить загрязнение пищеварительными элементами. Interscapular BAT должны быть тщательно вырезаны из окружающих тканей, чтобы предотвратить загрязнение WAT, которое будет исказить будущие анализы. Последовательная идентификация задних подкожных дорсолумбарных, ингинальных и ягодичных складов зависит от использования точных анатомических ориентиров, описанных в протоколе. Различие между этими складами имеет особенно важное значение; хотя склады могут казаться непрерывными, расположенные в центре паховые адипоциты приобретают коричневые характеристики более легко, чем окружающие их аналоги.
Жировые ткани, изолированные с помощью этого протокола, могут быть проанализированы с помощью различных методов. В дополнение к гистологической оценке (например, окрашивание Н и Е, иммуногистохимия), жировые ткани могут быть использованы для широкого спектра молекулярных анализов, от регулирования транскрипции до постпереводных изменений белка. Адипоциты и стромальные сосудистые клетки в отдельных депо могут быть изолированы путем коллагенеза пищеварения и дифференциальной центрифугации. Эти фракции могут быть использованы для молекулярных, метаболических и клеточных исследований культуры. Депо explants также могут быть использованы для ex vivo метаболических и ферментативных анализов.
Несколько проблем и ограничений возникают во время изоляции и иссечения тканей жировой ткани мыши. Во-первых, некоторые склады, которые физиологически важны в организме человека, обычно не присутствуют в худой, взрослых мышей. Например, оментальный WAT, который является основным висцеральным складом у людей, можно увидеть только у генетически или диетических тучных мышей. Расширение некоторых складов, однако, может быть вызвано проблемами питания или медикаментозного лечения. Например, кормление с высоким содержанием жира может привести к расширению оментального и перикардиального ВАТ. Межмышечный WAT может быть вызвано травмой скелетных мышц25,26 или диета с высоким содержанием жира27. Регулируемый BMAT расширяется в ответ на различные проблемы, в том числе с высоким содержанием жира, ограничение калорий и тиазолидинедион лечение11,28. Во-вторых, из-за небольшого размера мышей, получение достаточного количества образцов для молекулярного или метаболического анализа может быть затруднено. Например, изоляция достаточно чистых адипоцитов костного мозга для последующего анализа является сложной задачей, даже после объединения костей от нескольких мышей. В-третьих, точно определить границы определенных складов может быть трудно. Например, задний подкожный WAT, как представляется, один непрерывный депо, но на самом деле состоит из дискретных дорсолумбара, ингалинальных и ягодичных складов. Кроме того, периренал может быть слит как гонадный и ретроперитонеальных складов в очень ожирением животных. Отсутствие четких границ между смежными складами может сделать чистую изоляцию этих тканей сложной задачей. Тем не менее, этот протокол вскрытия предоставляет следователям подробный атлас и пошаговое руководство для точного и воспроизводимого вскрытия широкого спектра складов мыши жиров. Полевой стандартизации идентификации и изоляции дискретных складов мыши, описанных выше, несомненно, поможет дальнейшему выяснению различий в развитии, экспрессии генов и локальных и системных функциях ранее недостаточно изученные ниши адипоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
O.A.M. поддерживается грантами NIH DK062876 и DK092759; D.P.B. поддерживается Университетом Мичигана Медицинская программа подготовки ученых (T32GM0007863), Мичиганский университет Учебная программа в органогенезе (T32HD0007605), Мичиганский университет Rackham заслуги стипендий, и Tylenol будущего ухода стипендий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
- Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
- Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
- Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
- Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
- Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
- Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
- Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
- Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
- Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
- Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
- Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Cinti, S.
- Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
- Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
- Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
- Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
- Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
- Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).
