Summary
هنا ، نقدم طريقه للثقافة المجرية السابقة للعظام طويلة murine في مرحلتي الجنين وحديثي الولادة ، ومناسبه لتحليل العظام والغضروف التنمية والتوازن في الظروف التي تسيطر عليها في حين تلخيص عمليه في الجسم المجري.
Abstract
العظام الطويلة هي هياكل معقده وديناميكية ، والتي تنشا من تعظم داخل التحجر عن طريق الغضروف المتوسط. الوصول المحدود إلى العظام البشرية السليمة يجعل استخدام نماذج الثدييات ، مثل الفار والفئران ، قيمه خاصه للنظر في جوانب مختلفه من نمو العظام والتوازن. بالاضافه إلى ذلك ، فان تطوير الاداات الوراثية المتطورة في الفئران يسمح باجراء دراسات أكثر تعقيدا لنمو العظام الطويل ويطلب التوسع في التقنيات المستخدمة لدراسة نمو العظام. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لثقافة العظام السابقة الجسم الفيفو ، والذي يسمح بدراسة العظام والغضروف بطريقه تسيطر عليها باحكام بينما يلخص معظم عمليه في الجسم المجري. الطريقة الموصوفة تسمح بثقافة مجموعه من العظام ، بما في ذلك عظم الساق ، عظم الفخذ ، وعظام المشط ، ولكننا نركز بشكل رئيسي علي الثقافة الظنبوبيه هنا. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدامه بالاقتران مع التقنيات الأخرى ، مثل التصوير الحي الفاصل الزمني أو العلاج بالعقاقير.
Introduction
نمو الجهاز يجب ان يتم ضبطها باحكام لمنع ظهور اضطرابات النمو, وينطوي علي تنظيم أنواع متعددة من الخلايا, المسارات الجزيئية والمتقاطعة بين أجزاء مختلفه من الجسم. تقنيات التصوير ضرورية لمعالجه التغيرات التي تحدث مع مرور الوقت في الاجنه المتنامية ، في الظروف العادية ، وكذلك بعد الاضطراب المستحث في النظام. الاجنه مع النمو في الرحم ، مثل نماذج القوارض المستخدمة علي نطاق واسع ، تشكل تحديا إضافيا للتصوير الحي والعلاج من المخدرات ، والتي يمكن التغلب عليها جزئيا عن طريق استخدام تقنيات الثقافة المجرية السابقة. لتلخيص بنجاح في العمليات المجرية والحصول علي نتائج ذات مغزى ، يصبح من الضروري العثور علي الظروف المناسبة لزراعه لكل عضو أو الانسجه.
تنمو معظم عظام الهيكل العظمي الثدييات من خلال تعظم داخل التحجر ، حيث الغضروف الجنيني (تتالف من خلايا تسمي غضروفي) محركات النمو الطولي ويتم استبدال تدريجيا بالعظم. تحدث هذه العملية في لوحات النمو ، وتقع في نهاية العظام الطويلة ، حيث يمكن تمييز ثلاث مناطق: يستريح ، التكاثري ، وفرط التغذية1،2. أولا ، غضروفي الطليعة المستديرة في الانتقال إلى منطقه الراحة في الغضروفي عمودي الدراجات في المنطقة التكاثرية. خلال المرحلة التالية من التمايز ، وهذه غضروفي تصبح فرط التغذية والبدء في إفراز نوع X الكولاجين. الغضروفي المفرطة تنسق الخطوات التالية من التحجر: انها تفرز جزيئات الإشارات الرئيسية ، مثل عامل نمو النسيج الضام ، والبروتينات العظمية والقنفذ الهندي ، وتوجيه المعادن من المصفوفة ، وتجنيد الاوعيه الدموية إلى الجزء الأوسط من العظم ، وعند موت الخلايا المبرمج ، والسماح عظم (العظام تشكيل الخلية) لغزو المصفوفة لتشكيل مركز التحجر الابتدائي3،4. المصفوفة المعدنية تسهل تغلغل الاوعيه الدموية التي من خلالها عظم تهاجر لتحل محل هذا الغضروف المتدهور مع مصفوفة العظام5. معظم عظم تغزو مصفوفة الغضروف من البيريتشوندريوم ، طبقه ليفية التي يلتف الغضروف6. بدلا من ذلك ، فان نسبه من فرط الغضروفي قادره علي البقاء علي قيد الحياة والتفريق إلى عظم7،8،9. ويرجع الطول النهائي للعظام إلى النمو المتراكم للغضروف العابر ، الذي يعتمد معدل نموه بدوره علي عدد وحجم الغضروفي التضخمية ، وإنتاج مصفوفة10. بالاضافه إلى ذلك, وقد تبين مؤخرا ان مده المرحلة الاخيره تضخم يرتبط مع الطول النهائي للعظام11. ولذلك ، فان التنظيم المحكم لانتشار وتمايز هذه الخلايا مطلوب لضمان الحجم السليم للعظام.
علي الرغم من المعرفة الكبيرة التي اكتسبت علي مر السنتين علي تنظيم وتطوير لوحات النمو ، وتستند معظم هذه الاستنتاجات علي مراقبه الأقسام النسيجية الثابتة. يوفر المناديل الورقية معلومات قيمه حول هذه العملية ، ولكن يمكن ان تكون مليئه التحف الفنية ، لذلك لا يمكن ان تكون دائما تستخدم بشكل موثوق لتقدير التغيرات المورفولوجية أو حجم بين مراحل مختلفه. بالاضافه إلى ذلك ، مع نمو العظام هو عمليه ديناميكية ، والصور الثابتة ثنائيه الابعاد (2D) تقدم نظره محدوده في حركه الخلايا في لوحه النمو ، في حين ان التصوير الفاصل الزمني علي الانسجه الحية يمكن ان توفر معلومات قيمه عن سلوك غضروفي في لوحه النمو.
كل هذه القيود يمكن حلها باستخدام ثقافات العظام الجسم السابق. في حين تم تطوير بروتوكولات ثقافة العظام منذ بعض الوقت ، فقد تم تطبيقها بشكل محدود علي العظام الطويلة للمونين. معظم الدراسات استخدام العظام الفرخ بسبب المزايا التقنية التي تقدمها الفرخ نموذج12,13. طبقت ثقافات [ارغميك] (هواء/سائله واجهه) كان إلى فرخ [فيورس] جنينيه, اي كان حافظت في ثقافة ل 10 أيام14. الاداات الوراثية المتطورة المتاحة في الماوس جعل هذا النموذج جذابة جدا لاستخدامها في ثقافة العظام الجسم السابق. الدراسات التي استخدمت الفئران للنظر في نمو العظام عملت في الغالب مع عظام المشط15, ربما بسبب صغر حجمها والحصول علي اعداد أكبر لكل جنين16. علي الرغم من ان تعتبر تقليديا العظام الطويلة ، والمشط دخول الشيخوخة (تتميز بانخفاض الانتشار والتفاف من لوحه النمو17) في وقت سابق من العظام الطويلة الأخرى في الجسم الآخر ، التالي نموها المستمر السابق الفيفو لا تلخيص حقا في عمليه الجسم المجري. لأغراض هذه المادة ، وسوف نستخدم مصطلح عظام طويلة للعظام من مناطق الأطراف القريبة والمتوسطة. استخدمت العديد من الدراسات السابقة العظام murine طويلة ، مثل الساق ، في الثقافات السابقة المجرية ولاحظت نموا كبيرا في الغضروف ولكن التحجر قليلا18. كما استخدمنا الظنبوبي الثقافات مؤخرا ، أساسا لدراسة ديناميات غضروفي19. دراسات أخرى استخدمت رؤوس الفخذ من الفئران الصغيرة20 أو فقط الجزء البعيد من عظم الفخذ للثقافة21. بعض أكثر الاعمال الاخيره بنجاح الجمع بين الثقافة الحية السابقة من العظام الكامل مع التصوير الفاصل الزمني للحصول علي ثلاثه ابعاد (3d) الأفلام من غضروفي في انسجه الفار المعيشة22,23. وتمكن المؤلفون من مراقبه الاحداث التي لم يلاحظها أحد في السابق في أعاده ترتيب الغضروفي إلى المنطقة التكاثرية23 في مثال جيد للتطبيق المحتمل لثقافة العظام السابقة المجرية. والبديل ، اي تحليل الصور الثابتة ، يتطلب تقنيات غير مباشره ومعقده. وقد تجسد ذلك في دراسة أجريت مؤخرا لتقييم اهميه المستنسخات الموجهة عبر الطريق لنمو الغضروف ، حيث استخدمت التتبع الجيني مع سلالات الفئران متعددة ألوان المراسلة مع النمذجة الرياضية24. ولذلك ، فان ثقافة الجسم الحي السابق قد تساعد في اكتساب نظره ثاقبه علي العمليات الديناميكية بطريقه أسرع وأكثر وضوحا.
هنا ، نقدم طريقه للثقافة العظام الطويلة murine ، والتي يمكن الجمع بينها مع العلاجات الجزيئية المختلفة و/أو مع التصوير الحي الفاصل الزمني. يتكيف هذا البروتوكول مع الأساليب المستخدمة في التقارير السابقة15،18،25، ولكنه يعالج بعض القضايا الاضافيه ويركز علي عظام طويلة مثل عظم الساق ، بدلا من عظام المشط. وأخيرا ، فانه يستكشف إمكانات استخدام المقارنات المزدوجة القوية إحصائيا عن طريق ذبح العظام اليمني واليسرى بشكل منفصل في وجود مواد مختلفه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وينبغي تنفيذ جميع التجارب بعد المبادئ التوجيهية الحكومية والمؤسسية المحلية للتعامل الأخلاقي مع الماشية المختبرية.
1. التحضيرات قبل يوم ثقافة العظام
- اعداد تزاوج الماوس موقوتة للحصول علي الاجنه والجراء من اليوم الجنيني 14.5 (ه 14.5) فصاعدا.
ملاحظه: ثقافة العظام الطويلة يمكن تطبيقها بنجاح علي سلالات الماوس مختلفه. في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام الفئران البرية السويسرية ويبستر من النوع. - اعداد تشريح المتوسطة (مقتبسه من هيوستن وآخرون15): تمييع α الحد الأدنى الاساسيه (α-ميم) أو دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (dmem) 1/13 في الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) و 2 ملغ/مل الزلال مصل البقري (جيش الصرب البوسني) وتعقيم فلتر من خلال 0.22 μm ، 33 مم القطر حقنه فلتر. تخزين الارصفه عند-20 درجه مئوية.
- في اليوم السابق لاستخراج الاجنه ، واعداد المصل خاليه من العظام ثقافة المتوسطة تتالف من DMEM التي تحتوي علي 0.2 ٪ بوسنيا ، 0.5 mM L-الجلوتامين ، 40 U/mL البنسلين/ستربتوميسين ، 0.05 ملغ/مل حمض الاسكوربيك ، و 1 مم betaglycerophosphate. تصفيه تعقيم من خلال 0.22 μm ، 33 مم القطر حقنه فلتر وتخزين في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 1 شهر.
- في يوم الثقافة وقبل الإعدام الماوس ، واعداد لوحات 24 جيدا واطباق 60 مم مع تشريح المتوسطة والحفاظ عليها الجليد الباردة. يسخن الوسط ثقافة العظام في 37 درجه مئوية حمام المياه. رذاذ 80 ٪ (v/v) الايثانول علي الاداات (ملاقط ومقص صغير) لاستخدامها في التعامل مع الجنين. نقل نطاق المجهر إلى مجلس السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.
2. ثقافة الجنين والساق الوليد وعظم الفخذ
- Cull الماوس الحامل من خلال خلع عنق الرحم في مرحله الحمل المطلوب (تتراوح من E 14.5 إلى E 18.5). إذا تم استخدام الجراء الوليد ، وأزالها من الام واحدا تلو الآخر والإعدام عن طريق قطع الراس.
- ضع الماوس علي ظهرها وتعقيم منطقه البطن عن طريق رش 80 ٪ (v/v) الايثانول علي سطحه.
- قطع الجلد وعضله البطن مع مقص صغير للوصول إلى قرون الرحم.
- استخراج الرحم من تجويف البطن مع مساعده من ملاقط ومقص صغير ، وأزاله ميسوميريوم وقطع قاعده من القرون. ضع الرحم في طبق بيتري 60 ملم مع الجليد الباردة تشريح المتوسطة والحفاظ علي طبق الثقافة علي الجليد خلال العملية برمتها.
- نقل طبق بيتري مع الرحم إلى مجلس السلامة البيولوجية والعمل هناك من الآن فصاعدا.
- منفصلة الاجنه الفردية مع مقص عن طريق القطع بين الحويصلات.
- نقل الكيس الفردية تحت تشريح مجسمه في طبق 60 mm نظيفه مع تشريح المتوسطة وفتح لهم مع ملاقط لفصل الاجنه من مشيمة وتنظيفها من الاغشيه.
ملاحظه: العمل مع جنين واحد في كل مره ، مع الحفاظ علي بقية علي الجليد. - قطع الاجنه ونقل الجسم إلى طبق جديد نظيف 60 ملم مع 1 مل من الماصة المعقمة.
- أزاله الجلد من الاجنه أو الجراء مع ملاقط بدءا من الظهر وتقشير بها حتى أصابع القدم.
- فصل الأطراف السفلية من الجسم عن طريق قطع مع ملاقط قريبه من العمود الفقري ونقلها إلى طبق نظيف مع الجليد الباردة تشريح المتوسطة.
- فصل الساق من عظم الفخذ مع ملاقط بإدخالها بعناية بين الغضروف السطحي من عظم الفخذ البعيدة والقصبة القريبة.
- أزاله عظام الورك من عظم الفخذ القريب والعظام عقبي والشظية من الساق.
- بعناية أزاله الانسجه الرخوة من عظم الفخذ والساق عن طريق واد وسحب قباله.
ملاحظه: من المهم أزاله أكبر قدر ممكن من الانسجه الرخوة ، مع إيلاء عناية خاصه في أزاله الانسجه التي تربط قطبي الغضروف ، ولكن تجنب اتلاف الغضروف ، والبيريتشوندريوم ، والعظام. - ضع العظام الاربعه (الانحياز الأيمن والأيمن والانوثه) في البئر الأول من الصفيحة التي تحتوي علي 24 بئر مع ماصه معقمه 1 مل من البلاستيك. بدلا من ذلك ، لمقارنه تاثير العلاجات المختلفة علي الأطراف اليسرى واليمني ، ضع أطراف المقابل في الآبار المختلفة.
ملاحظه: وينبغي إيلاء عناية اضافيه عندما يتم نقل العظام إلى الآبار ، لأنها يمكن ان تلتصق بسهوله إلى الماصة. - المضي قدما بنفس الطريقة مع العديد من الاجنه حسب الضرورة.
ملاحظه: تغيير الطبق مع المتوسطة تشريح بمجرد ان يحصل بظلالها جدا ، كما انه من المهم ان نري بوضوح العظام تشريحها. -
عندما يتم نقل جميع العظام المطلوبة إلى الآبار ، وأزاله المتوسطة تشريح مع ماصه 1 مل من البلاستيك المعقمة واتخاذ المزيد من الرعاية لا يستنشق العظام.
- اعتمادا علي الغرض من التجربة ، يمكن ان تؤخذ الصور من العظام قبل أزاله المتوسطة تشريح ، كما النقطة الزمنيه صفر من التجربة. التقط الصور باستخدام المجهر المرفق بكاميرا رقميه والتعليق علي التعرض والمقياس المستخدم. لضمان القياسات سهله وموثوق بها ، والتقاط الصور مع تباين جيد للتمييز بين الجزء المعدني.
- أضف 1 مل من الثقافة المتوسطة إلى كل بئر. إذا كان المقصود اي علاج علي العظام (الدوكسيسيكلين ، تاموكسيفين ، وعوامل النمو ، وما إلى ذلك) ، ينبغي ان تضاف الآن.
- لمراقبه تاثير تثبيط النمو في ظروف الثقافة ، وعلاج الانحياز اليسار مع حمض الريتينويك (RA ، 500 nM) ، في حين احتضان الانحياز الحق مع حجم مكافئ من المركبات (ثنائي ميثيل سولفوكسيد [DMSO] ، التركيز النهائي 0.1 ٪) كعنصر تحكم.
- ترك العظام تنمو لمده يومين أو أكثر في حاضنه ثقافة الخلية تحت ظروف ثقافة الخلية القياسية (عند 37 درجه مئوية في 5% CO2 حاضنه).
- لتقييم الانتشار ، أضافه 5-ethynyl-2 '-ديوكسيريدين (ايدو) أو 5-برومو-2 '-ديوكسيريدين (BrdU) إلى الوسط في تركيز نهائي من 10 μM 1 − 2 h قبل التثبيت.
ملاحظه: تركيز المخزون من ايدو هو 20 ملم.
تحذير: EdU و brdu هي نظائرها ثيميدين ويمكن ان تكون سامه والطفرات. - ذوبان 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) وإصلاح العظام عن طريق الغمر في PFA في أنابيب الفردية 2 مل.
تحذير: PFA هو السامة والمحددة كمسرطن الإنسان المحتمل. تجنب التنفس مسحوق بارافورمالدهيد والابخره. EdU و brdu هي نظائرها ثيميدين ويمكن ان تكون سامه والطفرات. - بعد فتره وجيزة 10 دقيقه التثبيت في PFA في درجه حرارة الغرفة ، نقل العظام إلى الخدمات التلفزيونية للحصول علي صوره في الوقت النهائي. ثم وضع العظام مره أخرى في PFA لتثبيت بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
- بعد تثبيت العظام يمكن معالجتها للتطبيقات المتلقية للمعلومات المطلوبة.
3. قياس وتحليل الطول الكامل للعظام والمنطقة المعدنية
- استخدام برنامج تحرير الصور لقياس طول العظام ، مع الأخذ بعين الاعتبار حجم الصورة. قياس الطول الكلي للعظام والمنطقة المعدنية. بدء القياسات من الخلايا المظلمة الاولي في نهاية واحده حتى تلك الاخيره في الطرف الآخر.
ملاحظه: تتميز المنطقة المعدنية بلون أغمق وتتميز بسهوله من الغضروف. - لحساب معدل النمو ، الذي يعرف بأنه متوسط الزيادة في الطول في اليوم الواحد ، يقسم الفرق بين الطول النهائي للعظام والمدة الاوليه بعدد الأيام في الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن اجراء ثقافة العظام بدءا من مراحل مختلفه. في الشكل 1A-D، يتم عرض مقارنه بين الساق مثقف والمستخرجة حديثا في مراحل مماثله. الملاحظة الاولي هي ان ما يصل إلى يومين من الثقافة الحجم الذي حققه هو مماثل لنمو العظام في الجسم المادي لكل من الغضروف والعظام المعدنية (الشكل 1A، B ، D). وتؤدي فترات الثقافة الأطول إلى اختلافات أكبر بين العظام المستزرعة والمستخرجة حديثا (الشكل 1 ج). بالاضافه إلى ذلك ، كما ذكر في البروتوكول ، فمن المهم لأزاله الانسجه الرخوة التي تربط كلا طرفي العظام ، والا فان العظام ينحني. الشكل 1E يظهر مثالا علي الساق نمت مع أزاله غير مكتملة من الانسجه الرخوة مقابل الساق دون الانسجه الرخوة.
بعد ذلك ، تم استزراع الانحياز لمده يومين وتم قياس طولها. كما يمكن ان يري في الشكل 2 ا، ب، يمكن اجراء قياس الطول الكلي والجزء المعدني مع برنامج تحليل الصور. كما هو مبين في De Luca et al.26, العلاج مع RA له تاثير قوي علي نمو التحيز بالفعل بعد 2 أيام من العلاج ولوحظت نتيجة مماثله في ثقافاتنا (الشكل 2B-D). الأهم من ذلك ، تم اجراء التجربة باستخدام العظام المزدوجة ، مع العظام الحق كعنصر تحكم واليسار التعامل مع RA (الشكل 2A، B ، E) ، مما يساعد علي التغلب علي التغير الطبيعي في حجم العظام بين العينات المختلفة. التالي ، فان طريقه الخياطة الموصوفة مناسبه لتقييم تاثير المركبات المختلفة علي نمو العظام.
بعد ذلك ، تم تقييم معدل نمو العظام بعد الثقافة. تم استخراج العظام وقياسها واستزراعها عند 15.5 أو 16.5 أو P1 ، وتم إصلاحها وقياسها مره أخرى بعد يومين. وتم قياس كل من الزيادة الاجماليه في الطول وطول الجزء المعدني (الشكل 3 ج). مثال علي E 15.5 الساق وعظم الفخذ قبل الثقافة (الشكل 3A) وعند نقطه نهاية التجربة (الشكل3a) تظهر. كما يمكن ملاحظته من الرسم البياني والجدول (الشكل 3C، D) ، هناك زيادة ثابته في الطول الكلي للظمد ، المقابلة للزيادة التقريبية من 9 − 29 ٪ من الطول الاولي. هذا هو اقل زيادة من واحد لوحظ في الجسم المجري; الفرق الرئيسي هو علي الأرجح بسبب مستوي الغضروف القريب ، أكبر من البعيدة واقل وصولا إلى المواد الغذائية. في الواقع ، أظهرت العلامات EdU اقل الخلايا الايجابيه في هذه المنطقة بعد الثقافة مقارنه بالعظام المستخرجة حديثا من مرحله مماثله (الشكل 4A، C). وكان تاسيس ايدو في الساق البعيدة مماثله في العظام المزروعة والطازجة المستخرجة (الشكل 4 ب، د) الغضروف البعيد يساهم ما يقرب من ثلث إلى النمو الكلي للظمد في الجسم الخارجي في هذه المرحلة27، مقارنه بمعدل النمو الملاحظ في الثقافة ، لذا نقترح ان يركز التحليل علي هذا الجزء من العظم. الاضافه إلى ذلك ، أجرينا تقييما لتعدين العظام المستزرعة ، ولم نلاحظ اي زيادة تقريبا في طول هذه المنطقة. قد يكون الفرق بسبب عدم وجود السفينة وغزو عظم في الثقافة المجرية السابقة. وهذا يوحي بان دراسات نمو الغضروف يمكن ان تمتد لعده أيام ، بينما إذا كانت منطقه الاهتمام هي الجزء المتحجر من العظم ، فان فتره الثقافة ينبغي ان تكون أقصر. وقد تاكدت هذه الملاحظة من خلال الحفاظ علي الساق في الثقافة لفتره أطول (تصل إلى 6 أيام). وكما يمكن ملاحظته في الشكل 5، فان الطول الإجمالي للعنصر الهيكلي يزداد زيادة كبيره ، في حين انه لا يلاحظ اي زيادة تقريبا في المنطقة المعدنية (الشكل 5ج).
عموما ، تشير هذه النتائج إلى ان ثقافة العظام الطويلة يمكن استخدامها لتحليل تاثير العوامل المختلفة علي نمو العظام الكلي وخاصه لتقييم ديناميات الغضروف. وفي حين يمكن أيضا استخدام ثقافات المشط الراسخة مع هذه الأغراض ، فاننا نقدم ان كلا النوعين من الثقافات يكمل كل منهما الآخر ، نظرا للاختلافات الجوهرية بين الأمشاط وبقية العظام الطويلة.
الشكل 1: مثال علي الساق المستزرعة لفترات زمنيه مختلفه. (الف-دال) المقارنة بين الساق المستخرجة حديثا (الأعلى) والساق المستخرجة من E 14.5 (أسفل) ومثقف لمده 2 أيام (ا) ، المستخرجة من البريد 15.5 ومثقف لمده 2 أيام (ب) ، المستخرجة في البريد 16.5 ومثقف لمده 4 أيام (C) والمستخرجة حديثا في اليوم الثاني بعد الولادة (P2) والمستخرج في اليوم التالي للولادة 1 (P1) والمستزرع لمده يوم واحد (د). لاحظ انه في حين يبقي نمو الغضروف الفسيولوجية تماما بعد فترات الخياطة المختلفة ، يظهر الجزء المتحجر تاخير النمو بعد وقت الثقافة لفتره أطول من 2 أيام بالمقارنة مع العظام المستخرجة حديثا في المرحلة المقابلة. شريط مقياس = 1 مم. (ه) القصبة المزروعة لمده يومين ابتداء من 15.5 ه ؛ نلاحظ ان أزاله غير مكتملة من الانسجه الرخوة بين طرفي العظام يؤدي إلى الانحناء من العظم. شريط مقياس = 600 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياس طول العظام عند معالجه حمض الريتينويك (RA). (الف-باء) الانحياز المستخرجة في البريد 15.5 ونميت لمده 2 أيام مع 0.1 ٪ DMSO (ا) و RA (ب). لاحظ الفرق في كل من الطول الكلي والجزء المعدني. شريط مقياس = 1 مم. (ج-د) التغيرات في الطول الكلي (ج) أو الجزء المعدني (د) من الساق علي مدي 6 أيام في حاله السيطرة وفي وجود RA. تظهر النتائج علي انها تعني ± الانحراف المعياري (SD); يتم اجراء المقارنة بتحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) مع نوع المعالجة كمتغير (يتم عرض قيمp في الرسم البياني). (ه) المقارنة بين طول العظام المقترنة المستزرعة لمده يومين مع اما dmso (الساق اليمني) أو RA (الساق اليسرى) ؛ كل نقطه تمثل واحده من 3 نسخ متماثلة البيولوجية لكل حاله. تم استخدام اختبار tللطالب ثنائي الذيل المقترن. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنه بين النمو الكلي وتعدين الساق بعد 48 ساعة من الثقافة المجرية السابقة. (ا) الانحراف الكتروني 15.5 والإناث من الأطراف اليسرى (العلوية) واليمني (السفلية) قبل الخياطة. (ب) يتبع نفس التحيز والانوثه بعد الثقافة التي تستغرق يومين. شريط مقياس = 600 μm. (ج) رسم بياني يمثل معدل نمو الانحياز المستزرع في مراحل انمائيه مختلفه. وتم تقييم كل من النمو الكلي ونمو الجزء المعدني. (د) الجدول الذي يبين الطول الاولي والنهائي للعظام بأكملها والجزء المعدني قبل الزراعة عند 15.5 جنيه وبعد يومين في الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: لوحات النمو الضخمة لا تظهر الكثير من الانتشار في الثقافة. (الف-باء) التلوين EdU للوحات النمو القريبة (ا) والبعيدة (B) الظنبوبي المزروعة من 15.5 ه لمده يومين. (جيم-دال) تلوين ايدو للوحات النمو القريبة (C) والبعيدة (D) الظنبوبي المستخرجة حديثا في البريد 17.5. لاحظ الفرق في عدد خلايا EdU (+) في القصبة القريبة. وتشمل البيانات 6 أزواج مثقف من الأطراف و 3 المستخرجة حديثا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: فترات أطول من ثقافة الساق تظهر نمو الغضروف كبيره ولكن المعادن قليلا. الساق المستخرجة حديثا في E 15.5 (t = 0) (ا) وبعد 6 أيام في الثقافة (ب). لاحظ الاختلافات بين نمو الغضروف ونمو الجزء المعدني. شريط مقياس = 1 مم (ج) رسم بياني يبين التغيرات في الطول الكلي والمنطقة المعدنية علي مدي فتره 6 أيام. ن = 5 الانحياز مثقف; SD في كل نقطه زمنيه كما يلي: t = 0, طول كامل = 0.0777, المعادن = 0.0213; t = 3 د ، الطول الكامل = 0.1495 ، المعادن = 0.056 ؛ t = 6 د ، طول كامل = 0.1193 ، المعادن = 0.0521. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت العظام السابقين الجسم الحيوي أساليب الثقافة لبعض الوقت لتقييم بيولوجيا نمو العظام28, ولكن نادرا ما طبقت علي العظام الطويلة murine. مع تطوير تقنيات التصوير ، تقدم ثقافة العظام السابقة الفيفو طريقه جذابة لدراسة نمو العظام في الوقت الحقيقي في وضع يشبه بشكل وثيق في ظروف الجسم الخارجي. في هذا السيناريو ، من المهم تحديد الظروف التي يكون فيها نمو العظام الطويلة مماثله لنموها في الجسم الفيفو.
في هذه الدراسة ، ونحن وصف بروتوكول بسيط وباسعار معقولة للثقافة العظام الطويلة ، ومعالجه القيود والتطبيقات الممكنة. الخطوة الأكثر اهميه في هذا الأسلوب هو عزل العظام ، والتي يجب ان تبقي سليمه ومع اقل الانسجه الرخوة بين نهايات العظام قدر الإمكان. سيؤدي ترك الانسجه الرخوة بين نهايات العظام إلى منع النمو الطبيعي للعظام والحث علي الانحناء ، كما هو المثال في الشكل 1E. الانسجه الرخوة في نهايات العظام يمكن ان تترك ، كما انها سوف تختفي في نهاية المطاف. خطوه أخرى تتطلب رعاية اضافيه هي نقل العظام إلى لوحه الخياطة ، لأنها يمكن ان تلتصق بسهوله بالماصة البلاستيكية. أحد الحلول الممكنة هو القيام بالتغليف المتوسط لاعلي وأسفل التشريح الذي يحتوي علي قطع الدم والانسجه ، حيث انه يخلق طلاء يساعد علي منع العظام من التصاق بالماصة.
مره واحده المستخرجة ، والعظام تصل إلى حجم قابل للمقارنة إلى المقابلة في المرحلة المجرية عندما مثقف لمده تصل إلى 48 h. وبصرف المقارنة مع قياس طول العظم ، يمكن تقدير معدل النمو (متوسط الزيادة في الطول في اليوم) بسهوله في هذه الظروف. ومع ذلك ، فان هذا النهج لحساب معدل النمو غير صالحه علي فترات طويلة من العمليات الجراحية ، حيث ينبغي استخدام أساليب أخرى ، مثل التسمية الكلسية29،. العلاج مع حمض الريتينويك ، الذي يعزز التمايز الغضروفي المبكر ، يؤدي إلى انخفاض كبير في نمو العظام ، مما يوحي بان هذه المرة لزراعه يكفي لمراقبه تاثير المواد المختلفة قد يكون علي العظام النمو. الأهم من ذلك ، تم المقارنة أيضا علي العظام المزدوجة من نفس العينة ، بحيث تلقي الساق اليسرى العلاج RA وكان الحق في السيطرة. هذا هو ميزه من نموذج ثقافة العظام ، كما انه يسمح باجراء مقارنات الاقتران ، والتي هي إحصائيا أكثر قوه.
الخياطة لفتره أطول يظهر نموا كبيرا من الجزء الغضروف ، ولكن تاخير في نمو واحد المعدنية ، ومن المهم ان تنظر في هذه النتيجة عند اختيار تطبيق هذه التقنية. ولوحظت نتائج مماثله في الفرخ فخذ مثقف لمده تصل إلى 10 أيام والتي تظهر المنطقة الموسعة ابيهيسيل وانخفاض طوق العظام العنق14، وكذلك في الماوس الساق مثقف لمده 6 أيام18. بالاضافه إلى ذلك ، من المهم ان نذكر انه في منطقه الغضروف النمو أيضا ليست متجانسة: المنطقة البعيدة الضخمة من عظم الفخذ والمنطقة القريبة من الساق لا تتلقي المواد الغذائية بكفاءة عن طريق الانتشار البسيط ولا يمكن ان تنمو بشكل صحيح. وفي هذا السياق ، ينبغي ان تركز الدراسات علي اللوحات المتنامية المعاكسة ، التي يقدر انها تسهم في ثلث إجمالي النمو27، علي غرار النمو الملحوظ في الثقافة. كما وصف التاخير في نمو العظام المستزرعة بالنسبة للثقافات المشطة15.
ومن الاعتبارات الهامه لهذا النوع من الثقافة عدم وجود نمو في الجزء المتحجر من العظم. ومن الثابت ان العظم تغزو مصفوفة الغضروف من العظم المفصلي جنبا إلى جنب مع الاوعيه الدموية3,4 ومن الواضح ان هذه العملية تتعطل عندما تكون العظام معزولة. وهذا قد يفسر غياب التحجر في ظل ظروف الثقافة. كما أظهرت فرط التمايز غضروفي باعتبارها مصدرا هاما لعظم7,8,9, ولكن ما إذا كانت هذه العملية تتطلب أيضا في جزء من وجود الاوعيه الدموية, كما يبدو ان تفعل خلال كسر الشفاء30، أو بعض الانسجه الأخرى غير موجودة في الثقافات المجرية السابقة ، يحتاج إلى مزيد من التحقيق. بالاضافه إلى ذلك ، يوصف جيدا اهميه الحمولة الميكانيكية في تشكيل نمو العظام31،32، الذي يؤثر علي العظام الطويلة وعظام مشط القدم بشكل مختلف ، ولكن غائبه في السابق الجسم الفيفو الاعداد. ومع ذلك ، فان طريقه الخياطة الموصوفة مناسبه لقياس ديناميات غضروفي والتغيرات في النمو الطولي ، التالي يمكن استخدامها في تطبيقات معينه.
عموما ، يوفر البروتوكول الموصوف طريقه بسيطه ورخيصه للثقافة العظام الطويلة بدءا من مراحل مختلفه ، والتي يمكن ان تقترن بتقنيات اضافيه لمعالجه أليات الخلوية والجزيئية الرئيسية ، مثل التصوير الحي الزمني الفاصل13 , 23 أو العلاج بالمخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونود ان نشكر الكسندرا جوينر علي دعمها عندما تم إنشاء هذا البروتوكول ، Edwina McGlinn ويي تشنغ تشانغ لتقاسم حمض الريتينويك. ويدعم المعهد الأسترالي للطب التجديدي بمنح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الاستراليه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K.
- Kronenberg, H. M.
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
