Summary
यहां, हम दोनों भ्रूण और नवजात अवस्था में लंबी murine हड्डियों के पूर्व vivo संस्कृति के लिए एक विधि वर्तमान, नियंत्रित परिस्थितियों में हड्डी और उपास्थि विकास और homeostasis का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है, जबकि vivo में प्रक्रिया में recapitulating ।
Abstract
लंबी हड्डियों जटिल और गतिशील संरचनाओं, जो एक उपास्थि मध्यवर्ती के माध्यम से एंडोकोड्रैल अस्थिकरण से उत्पन्न होते हैं । स्वस्थ मानव हड्डियों के लिए सीमित उपयोग विशेष रूप से मूल्यवान है, जैसे माउस और चूहे के रूप में स्तनधारी मॉडल का उपयोग करने के लिए अस्थि विकास और homeostasis के विभिंन पहलुओं में देखो । इसके अतिरिक्त, चूहों में परिष्कृत आनुवंशिक उपकरणों के विकास लंबी हड्डी के विकास के अधिक जटिल अध्ययन की अनुमति देता है और हड्डियों के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल तकनीकों का एक विस्तार के लिए पूछता है. यहां, हम पूर्व वीवो murine अस्थि संस्कृति है, जो एक कसकर नियंत्रित तरीके से हड्डी और उपास्थि के अध्ययन की अनुमति देता है, जबकि vivo में प्रक्रिया में सबसे recapitulating के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं । विधि वर्णित हड्डियों की एक श्रृंखला की संस्कृति की अनुमति देता है, टिबिया, femur, और प्रपदिकीय हड्डियों सहित, लेकिन हम tibia संस्कृति पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया है यहां । इसके अलावा, यह इस तरह के समय चूक लाइव इमेजिंग या दवा उपचार के रूप में अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
अंग वृद्धि को कसकर विकास विकारों की उपस्थिति को रोकने के लिए tuned किया जाना है, और शरीर के विभिन्न भागों के बीच कई सेल प्रकार, आणविक रास्ते और दिश के नियमन शामिल है । एक बढ़ते भ्रूण में समय के साथ होने वाले परिवर्तनों का समाधान करने के लिए इमेजिंग तकनीकें आवश्यक हैं, सामान्य परिस्थितियों में, और साथ ही क्षोभ के बाद प्रणाली में प्रेरित होता है । इस तरह के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कृंतक मॉडल, लाइव इमेजिंग और दवा उपचार, जो आंशिक रूप से पूर्व vivo संस्कृति तकनीकों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है के लिए एक अतिरिक्त चुनौती वर्तमान के रूप में अंतर्गर्भाशयी विकास, के साथ भ्रूण । वीवो प्रक्रियाओं में सफलतापूर्वक पुनर्पूंजीकरण करने और सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अंग या ऊतक के लिए सही पुलिया की स्थिति को खोजना महत्वपूर्ण हो जाता है ।
स्तनधारियों के कंकाल की अधिकांश हड्डियां एंडोकोन्ड्रिल अस्थसीकरण के माध्यम से बढ़ती हैं, जहां भ्रूणीय उपास्थि (chondrocytes नामक कोशिकाओं से बना हुआ) अनुदैर्ध्य वृद्धि ड्राइव और धीरे से हड्डी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है । इस प्रक्रिया के विकास प्लेटों पर होता है, लंबी हड्डियों के अंत में स्थित है, जहां तीन क्षेत्रों में प्रतिष्ठित किया जा सकता है: आराम, proliferative, और hypertrophic1,2. सबसे पहले, दौर प्रजनक chondrocytes के आराम क्षेत्र में साइकिल चालन के स्तंभकार chondrocytes में प्रफलन क्षेत्र में संक्रमण । विभेदन के अगले चरण के दौरान, इन chondrocytes hypertrophic हो जाते है और प्रकार एक्स कोलेजन स्रावित करना शुरू करते हैं । Hypertrophic chondrocytes अस्थिकरण के बाद के चरणों का आर्केस्ट्रा: वे कुंजी संकेतन अणुओं, जैसे संयोजी ऊतक विकास कारक, अस्थि मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन और भारतीय हाथी, और मैट्रिक्स के खनिजीकरण प्रत्यक्ष छिपाना, भर्ती अस्थि के केंद्रीय भाग के लिए रक्त वाहिकाओं, और, apoptosis पर, अस्थिविस्फोटों की अनुमति (हड्डी बनाने कोशिकाओं) मैट्रिक्स पर आक्रमण करने के लिए प्राथमिक अस्थीभवन केंद्र के रूप में3,4। खनिज्ड मैट्रिक्स रक्त वाहिकाओं के प्रवेश को सुगम बनाता है जिसके माध्यम से अस्थिप्रसू इस अवक्रमित उपास्थि को अस्थि मैट्रिक्स केसाथ प्रतिस्थापित करने के लिए विस्थापित होते हैं । अधिकांश अस्थिविस्फोटों perichondrium, एक रेशेदार परत है कि6उपास्थि लपेटता से उपास्थि मैट्रिक्स पर आक्रमण । वैकल्पिक रूप से, hypertrophic chondrocytes के अनुपात में जीवित रहने के लिए और7,8,9अस्थिविस्फोटों को transविभेदित कर रहे हैं । हड्डी की अंतिम लंबाई क्षणिक उपास्थि की संचित वृद्धि के कारण है, जिसकी वृद्धि दर hypertrophic chondrocytes की संख्या और आकार पर निर्भर करता है, और उनके मैट्रिक्स उत्पादन10. इसके अतिरिक्त, यह हाल ही में दिखाया गया था कि पिछले अतिवृद्धि चरण की अवधि हड्डी11की अंतिम लंबाई के साथ संबद्ध । इसलिए, हड्डियों के उचित आकार को सुनिश्चित करने के लिए इन कोशिकाओं के प्रसार और विभेदन के टाइट नियमन की आवश्यकता होती है ।
पिछले कुछ वर्षों में विकास प्लेटों के संगठन और विकास पर प्राप्त पर्याप्त ज्ञान के बावजूद, इनमें से अधिकांश निष्कर्ष स्थिर ऊतकीय वर्गों की टिप्पणियों पर आधारित हैं । ऊतक परिच्छेदन इस प्रक्रिया के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है, लेकिन तकनीकी कलाकृतियों के साथ ग्रस्त किया जा सकता है, तो यह हमेशा मज़बूती से विभिन्न चरणों के बीच रूपात्मक या आकार परिवर्तन का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. इसके अतिरिक्त, के रूप में अस्थि विकास एक गतिशील प्रक्रिया है, स्थिर दो आयामी (2 डी) छवियां विकास की थाली में कोशिकाओं के आंदोलन में एक सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जबकि समय-जीना ऊतक पर चूक इमेजिंग के व्यवहार पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकता है वृद्धि की थाली में chondrocytes ।
इन सभी सीमाएं संभावित पूर्व vivo में हड्डी संस्कृतियों का उपयोग कर हल किया जा सकता है । जबकि हड्डी संस्कृति प्रोटोकॉल कुछ समय पहले विकसित किया गया है, वे limitedly murine लंबी हड्डियों के लिए आवेदन किया गया । अध्ययन के अधिकांश चिकी हड्डियों के कारण तकनीकी चूजा लड़की मॉडल12,13द्वारा की पेशकश की लाभ के लिए । Organotypic संस्कृतियों (हवा/तरल अंतरफलक) लड़की भ्रूणीय femurs, जो संस्कृति में 10 दिनों के लिए बनाए रखा गया था14के लिए लागू किया गया । परिष्कृत आनुवंशिक माउस में उपलब्ध उपकरण इस मॉडल को बहुत आकर्षक बनाने के लिए पूर्व vivo में हड्डी संस्कृति में इस्तेमाल किया जाएगा । अध्ययन है कि चूहों की हड्डी विकास में देखने के लिए इस्तेमाल किया प्रपदिकीय15हड्डियों के साथ ज्यादातर काम किया, शायद उनके छोटे आकार और अधिक से अधिक संख्या16भ्रूण प्रति प्राप्त करने के लिए कारण. हालांकि परंपरागत रूप से लंबी हड्डियों माना जाता है, metatarsi जीर्णता दर्ज करें (कम प्रसार और विकास थाली के अंतर्वलन की विशेषता17) vivo में अन्य लंबी हड्डियों की तुलना में पहले, और इसलिए उनके सतत विकास ex vivo नहीं वास्तव में वीवो प्रक्रिया में पुनर्पूंजीकरण । इस लेख के प्रयोजनों के लिए, हम समीपस्थ और मध्यवर्ती अंग क्षेत्रों से हड्डियों के लिए लंबी हड्डियों शब्द का उपयोग करेगा । कई पिछले अध्ययनों से इस तरह के रूप में लंबी murine हड्डियों का इस्तेमाल किया, टिबिया, पूर्व में vivo में संस्कृतियों और उपास्थि लेकिन थोड़ा अस्थीभवन18की एक पर्याप्त वृद्धि देखी गई. हम भी हाल ही में टिबियल संस्कृतियों का इस्तेमाल किया, मुख्य रूप से chondrocyte गतिशीलता19अध्ययन करने के लिए । अंय अध्ययनों के युवा20 चूहों से ऊरु सिर इस्तेमाल किया या केवल21संस्कृति के लिए ऊरु के बाहर का हिस्सा । कुछ और हाल ही में काम करता है सफलतापूर्वक समय के साथ पूरी हड्डियों के ex vivo संस्कृति गठबंधन-चूक इमेजिंग को तीन आयामी (3 डी) chondrocytes की फिल्मों में रहने वाले माउस ऊतक22,23प्राप्त करते हैं । लेखकों हड्डी ex vivo संस्कृति के संभावित आवेदन का एक अच्छा उदाहरण में proliferdrocytes के पुनर्व्यवस्थापन में पहले किसी का ध्यान न देने की घटनाओं का पालन करने में कामयाब रहे23 । वैकल्पिक, अर्थात्, स्थिर छवियों का विश्लेषण, अप्रत्यक्ष और जटिल तकनीकों की आवश्यकता है । यह एक हाल ही में उपास्थि विकास के लिए transversally उंमुख क्लोन के महत्व का आकलन अध्ययन द्वारा उदाहरण दिया गया था, जहां गणितीय मॉडलिंग के साथ युग्मित बहुर रिपोर्टर माउस उपभेदों के साथ आनुवंशिक पता लगाने24इस्तेमाल किया गया । इसलिए, पूर्व vivo संस्कृति एक तेज और अधिक सरल तरीके से गतिशील प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में मदद कर सकता है ।
यहां, हम murine लंबी हड्डियों संस्कृति है, जो विभिंन आणविक उपचार और के साथ संयुक्त किया जा सकता है के लिए एक विधि वर्तमान/ यह प्रोटोकॉल पिछले रिपोर्ट15,18,25में उपयोग की गई विधियों का अनुकूलन करता है, लेकिन कुछ अतिरिक्त समस्याओं को हल कर देता है और लंबी हड्डियों जैसे टिबिया, प्रपदिकीय हड्डियों पर केंद्रित होता है । अंत में, यह अलग पदार्थों की उपस्थिति में अलग से बाएँ और दाएँ हड्डियों को संवर्धन द्वारा सांख्यिकीय शक्तिशाली युग्मित तुलना का उपयोग करने की क्षमता की पड़ताल.
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Protocol
प्रयोगशाला पशुओं की नैतिक हैंडलिंग के स्थानीय सरकारी और संस्थागत दिशा-निर्देशों का पालन करते हुए सभी प्रयोग किए जाने चाहिए ।
1. अस्थि संस्कृति के दिन से पहले तैयारी
- भ्रूणीय दिवस १४.५ (ई 14.5) और आगे से भ्रूण और पिल्ले प्राप्त करने के लिए समय पर माउस सहचारिता सेट करें ।
नोट: लंबी हड्डियों की संस्कृति को सफलतापूर्वक अलग माउस उपभेदों के लिए लागू किया जा सकता है; वर्तमान प्रोटोकॉल में, outbred स्विस Webster जंगली प्रकार चूहे का उपयोग किया जाता है । - विच्छेदन माध्यम तैयार (ह्यूस्टन एट अल.15से अनुकूलित): तनु α-ंयूनतम आवश्यक मध्यम (α-mem) या dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (dmem) 1/13 फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) और 2 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) और फ़िल्टर एक ०.२२ μm के माध्यम से, ३३ मिमी व्यास सिरिंज फिल्टर । -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर ।
- इस भ्रूण की निकासी से पहले दिन, सीरम मुक्त अस्थि संस्कृति मध्यम ०.२% बीएसए, ०.५ मिमी एल-ग्लूटामीन, ४० U ०.०५/एमएल ascorbic एसिड, और 1 मिमी betaglycerophosphate युक्त dmem से बना के माध्यम से तैयार । एक ०.२२ μm, ३३ मिमी व्यास सिरिंज के माध्यम से जीवाणुरहित फ़िल्टर और 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- संस्कृति और माउस मुर्गियों को मारने से पहले के दिन, 24 अच्छी तरह से प्लेटें और ६० mm पकवान विच्छेदन माध्यम के साथ तैयार है और उंहें बर्फ ठंडा रखने के । एक ३७ ° c जल स्नान में अस्थि संस्कृति माध्यम prewarm । भ्रूण हैंडलिंग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले टूल्स (चिमटी और छोटी कैंची) पर एथेनॉल ८०% (v/v) स्प्रे करें । एक द्विनेत्री गुंजाइश एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण ।
2. भ्रूण और नवजात टिबिया और Femur की संस्कृति
- वांछित गर्भावधि चरण में ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से गर्भवती माउस चुनना (ई 14.5 से ई 18.5 को लेकर) । यदि नवजात पिल्ले का उपयोग किया जाता है, तो उन्हें एक-एक करके मां से निकाल दें और कुच्छेदन द्वारा कुल् ल कर लें ।
- उसकी पीठ पर माउस प्लेस और ८०% (v/v) इथेनॉल इसकी सतह पर छिड़काव द्वारा उदर क्षेत्र जीवाणुरहित ।
- गर्भाशय के सींगों तक पहुंचने के लिए त्वचा और पेट की मांसपेशी को छोटी कैंची से काटें ।
- गर्भाशय को चिमटी और छोटी कैंची की मदद से पेट की गुहा से निकालें, mesometrium को हटाने और सींग का आधार काटने । गर्भाशय को ६० एमएम पेट्री डिश में आइस-कोल्ड डिसेक्शन मीडियम के साथ रखें और पूरी प्रक्रिया के दौरान कल्चर डिश को बर्फ पर रख दें ।
- पेट्री डिश को गर्भाशय के साथ बायोसेफ्टी कैटेगिरी में ट्रांसफर कर वहां पर अभी से काम करें ।
- Sacs के बीच काटने के द्वारा कैंची के साथ अलग अलग fetuses.
- विच्छेदन माध्यम के साथ एक साफ ६० मिमी पकवान में एक विच्छेदन stereomसूक्ष्मदर्शी के तहत व्यक्तिगत थैली स्थानांतरण और उंहें खुला चिमटी से placentas से fetuses अलग और उंहें झिल्ली से साफ ।
नोट: एक समय में एक भ्रूण के साथ काम करते हैं, जबकि बाकी बर्फ पर रखते हुए । - Fetuses decapitate और एक 1 मिलीलीटर कटौती pipette के साथ एक स्वच्छ नए ६० मिमी पकवान के लिए शरीर हस्तांतरण ।
- Fetuses की त्वचा या पीठ से शुरू चिमटी के साथ पिल्ले निकालें और यह पैर की उंगलियों तक छीलने ।
- रीढ़ की हड्डी के पास चिमटी के साथ काटने और उन्हें बर्फ के साथ एक साफ पकवान करने के लिए स्थानांतरण-ठंड विच्छेदन माध्यम से शरीर से हिलांगों अलग ।
- टिबिया से दूर फीर और समीपस्थ टिबिया की सतह उपास्थि के बीच ध्यान से उन्हें शुरू करने के द्वारा चिमटी के साथ फीर से अलग ।
- कूल्हे की हड्डियों को समीपस्थ ऊरु तथा कैल्केनियस अस्थि तथा टिबिया से फिबुला से निकाल लें ।
- सावधानी से कोमल ऊतक फीउर और टिबिया से निपिंग और इसे खींच कर दूर ।
नोट: यह संभव के रूप में अधिक नरम ऊतक को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, दो उपास्थि डंडे को जोड़ता है कि ऊतक को दूर करने में विशेष ध्यान रखते हुए, लेकिन उपास्थि, perichondrium, और हड्डियों को नुकसान पहुंचाने से परहेज. - एक प्लास्टिक 1 मिलीलीटर बाँझ पिपेट के साथ 24-कूप प्लेट के पहले कुएं में चार हड्डियां (बाएं और दाएं टिबियस और फेम्मर) रखें । वैकल्पिक रूप से, बाएँ और दाएँ अंगों पर विभिन्न उपचार के प्रभाव की तुलना करने के लिए, विभिन्न कुओं में contralateral अंगों जगह.
नोट: हड्डियों को कुओं में स्थानांतरित करने पर अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए, क्योंकि ये आसानी से पिपेट पर चिपक सकते हैं । - आवश्यक के रूप में कई fetuses के साथ उसी तरह आगे बढ़ें ।
नोट: इस डिश को विच्छेदन माध्यम से बदल कर जैसे ही यह भी धूमिल हो जाता है, के रूप में यह स्पष्ट रूप से विच्छेदित हड्डियों को देखने के लिए महत्वपूर्ण है । -
जब सभी वांछित हड्डियों कुओं को स्थानांतरित कर रहे हैं, एक प्लास्टिक के साथ विच्छेदन माध्यम निकालें 1 मिलीलीटर बाँझ पिपेट और अतिरिक्त ध्यान रखना हड्डियों को महाप्राण नहीं है ।
- प्रयोग के प्रयोजन के आधार पर, विच्छेदन माध्यम को हटाने से पहले, प्रयोग के टाइमपॉइंट शूंय के रूप में, हड्डियों का चित्र लिया जा सकता है । एक डिजिटल कैमरा से जुड़े सूक्ष्मदर्शी के साथ तस्वीरें ले लो और प्रदर्शन और पैमाने पर इस्तेमाल एनोटेट । आसान और विश्वसनीय माप सुनिश्चित करने के लिए, mineralized हिस्सा भेद करने के लिए अच्छे विपरीत के साथ तस्वीरें ले लो ।
- प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । यदि किसी भी उपचार की हड्डियों (doxycycline, tamoxifen, विकास कारकों, आदि) पर इरादा है, यह अब जोड़ा जाना चाहिए ।
- संस्कृति की स्थिति में वृद्धि निषेध के प्रभाव का पालन करने के लिए, रेटिनोइक एसिड (आरए, ५०० एनएम) के साथ बाईं tibias का इलाज, जबकि वाहन के एक समकक्ष मात्रा (dimethyl सल्फॉक्साइड [DMSO], अंतिम एकाग्रता ०.१%) एक नियंत्रण के रूप में ।
- हड्डियों को दो दिन या अधिक के लिए बढ़ने के लिए एक सेल संस्कृति इंक्यूबेटर में मानक सेल संस्कृति शर्तों के तहत (एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर) छोड़ दें ।
- प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए, 5-एथिल-2'-deoxyuridine (EdU) या 5-ब्रोमो-2'-deoxyuridine (BrdU) के माध्यम से 10 μM 1 − 2 एच के अंतिम एकाग्रता पर एक मध्यम करने के लिए निर्धारण से पहले जोड़ें ।
नोट: एडू का स्टॉक एकाग्रता 20 एमएम है ।
चेतावनी: EdU और BrdU थाइमिडीन analogues है और विषाक्त और mutagenic हो सकता है । - 4% पैराफार्मलेडिहाइड (पीएफए) और व्यक्तिगत 2 मिलीलीटर ट्यूबों में पीएफए में विसर्जन द्वारा हड्डियों को ठीक करें ।
चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और एक संभावित मानव कैंसरजन के रूप में नामित । पैराफॉर्मलेडिहाइड पाउडर और vapors सांस लेने से बचें । EdU और BrdU थाइमिडीन analogues है और विषाक्त और mutagenic हो सकता है । - एक संक्षिप्त 10 मिनट के बाद पीएफए में कमरे के तापमान पर, अंतिम timepoint पर चित्र के अधिग्रहण के लिए PBS के लिए हड्डियों के हस्तांतरण । फिर हड्डियों को पीएफए में वापस 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात फिक्सिंग के लिए रखें ।
- निर्धारण हड्डियों के बाद वांछित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए संसाधित किया जा सकता है ।
3. माप और हड्डी की पूरी लंबाई और Mineralized क्षेत्र के विश्लेषण
- एक छवि संपादन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें हड्डियों की लंबाई को मापने के लिए, खाते में छवि के पैमाने पर ले जा । हड्डी और खनिज्ड क्षेत्र दोनों की कुल लंबाई मापें । एक छोर पर पहले अंधेरे कोशिकाओं से दूसरे छोर पर अंतिम लोगों तक माप शुरू करते हैं ।
नोट: Mineralized क्षेत्र गहरे रंग की विशेषता है और आसानी से उपास्थि से प्रतिष्ठित है । - वृद्धि दर की गणना करने के लिए, प्रति दिन की लंबाई में औसत वृद्धि के रूप में परिभाषित, हड्डी की अंतिम लंबाई और संस्कृति में दिनों की संख्या से प्रारंभिक एक के बीच के अंतर को विभाजित ।
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Representative Results
अस्थि संस्कृति विभिन्न चरणों से शुरू किया जा सकता है । चित्र 1a-Dमें, समतुल्य चरणों में सुसंस्कृत टिबिया और हौसले से निकाले गए लोगों के बीच तुलना दिखाई जाती है । पहली अवलोकन यह है कि संस्कृति के दो दिनों तक का आकार प्राप्त दोनों उपास्थि और mineralized हड्डी के लिए vivo में हड्डियों के विकास के लिए तुलनीय है (चित्र 1a, बी, डी). अब संस्कृति समय संवर्धित हड्डियों और हौसले से निकाले के बीच बड़ा अंतर करने के लिए सीसा (चित्रा 1 सी) । इसके अतिरिक्त, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, यह कोमल हड्डियों के दोनों सिरों को जोड़ने के ऊतकों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में अंयथा हड्डियों झुकना होगा । चित्र 1E कोमल ऊतक के बिना एक टिबिया बनाम नरम ऊतक के अधूरा हटाने के साथ उगाया एक टिबिया का एक उदाहरण से पता चलता है ।
इसके बाद टिबियस को 2 दिन के लिए संस्कारी किया गया और उनकी लंबाई को मापा गया । के रूप में चित्रा 2a, बीमें देखा जा सकता है, कुल लंबाई और mineralized भाग की माप एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है । जैसा कि De Luca एट अल26द्वारा दिखाया गया है, आरए के साथ उपचार पहले से ही उपचार के 2 दिनों के बाद tibias के विकास पर एक मजबूत प्रभाव है और इसी तरह के परिणाम हमारी संस्कृतियों में मनाया गया (चित्रा 2b-डी) । महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रयोग युग्मित अस्थियों का उपयोग करते हुए दाईं अस्थि के साथ नियंत्रण के रूप में और बाईं ओर आरए के साथ उपचारित किया गया (चित्र 2a, B, E), जो विभिन्न नमूनों के बीच अस्थि के आकार में प्राकृतिक परिवर्तनशीलता को दूर करने में मदद करता है । इस प्रकार, वर्णित पुच्छक विधि हड्डी के विकास पर विभिंन यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयुक्त है ।
इसके बाद, संस्कृति के बाद हड्डियों की वृद्धि दर का आकलन किया गया । हड्डियों को निकाला, मापा और ई 15.5, १६.५ या P1 पर सुसंस्कृत, और तय और दो दिन बाद फिर से मापा गया । दोनों की लम्बाई में कुल वृद्धि तथा खनिकृत भाग की लम्बाई मापी गई (चित्र 3C) । संस्कृति से पहले ई 15.5 टिबिया और फीर का उदाहरण (चित्र 3 क) तथा प्रयोग के अंतिम बिंदु पर (चित्र 3बी) दर्शाया गया है । जैसा कि ग्राफ और सारणी से देखा जा सकता है (चित्र 3C, घ), टिबिया की कुल लंबाई में सुसंगत वृद्धि होती है, जो आरंभिक लंबाई से 9 − 29 प्रतिशत की अनुमानित वृद्धि के अनुरूप होती है । यह वीवो में देखे गए एक से कम वृद्धि है; मुख्य अंतर की संभावना समीपस्थ उपास्थि के स्तर के कारण, बाहर की तुलना में बड़ा और कम पोषक तत्वों के लिए सुलभ है । वास्तव में, EdU लेबलिंग के समकक्ष स्तर की हौसले से निकाली गई हड्डियों की तुलना में संस्कृति के बाद इस क्षेत्र में कम सकारात्मक कोशिकाओं से पता चला (चित्र 4a, सी) । बाहर की टिबिया में EdU निगमन सुसंस्कृत और हौसले से निकाली गई हड्डियों में इसी तरह की थी (चित्रा 4B, घ) बाहर का उपास्थि योगदान लगभग एक तीसरे इस स्तर पर vivo में टिबिया के कुल विकास के लिए27, संस्कृति में देखी गई वृद्धि दर के बराबर है, तो हम प्रस्ताव है कि विश्लेषण हड्डी के इस भाग पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, हम सुसंस्कृत हड्डियों के खनिजीकरण का मूल्यांकन, और इस क्षेत्र की लंबाई में लगभग कोई वृद्धि का निरीक्षण । अंतर पूर्व vivo संस्कृति में पोत और अस्थिविस्फोटों के आक्रमण के अभाव के कारण हो सकता है । यह पता चलता है कि उपास्थि वृद्धि के अध्ययन के कई दिनों के लिए विस्तार कर सकते हैं, जबकि अगर ब्याज के क्षेत्र हड्डी का ossified हिस्सा है, संस्कृति की अवधि कम होना चाहिए. संस्कृति में टिबिया को लंबे समय तक (6 दिन तक) रखने से इस प्रेक्षण की पुष्टि हुई । जैसा कि चित्र 5में देखा जा सकता है, कंकाल तत्व की कुल लंबाई काफी बढ़ जाती है, जबकि खनिज्ड क्षेत्र में लगभग कोई वृद्धि नहीं देखी जाती (चित्र 5c) ।
कुल मिलाकर, इन परिणामों का सुझाव है कि लंबी हड्डियों की संस्कृति समग्र अस्थि विकास पर विभिन्न कारकों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए और विशेष रूप से उपास्थि गतिशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि अच्छी तरह से स्थापित प्रपदिकीय संस्कृतियों भी इन प्रयोजनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, हम निवेदन है कि दोनों प्रकार की संस्कृतियों के एक दूसरे के पूरक हैं, प्रपदिकीय बीच आंतरिक मतभेदों को देखते हुए और लंबी हड्डियों के बाकी ।
चित्र 1: विभिंन समयावधियों के लिए सुसंस्कृत टिबिया का उदाहरण । (ए-डी) हौसले से निकाली गई टिबिया (शीर्ष) और टिबिया के बीच तुलना ई 14.5 (नीचे) और 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत में निकाले (एक), ई 15.5 पर निकाले और 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत (ख), ई 16.5 पर निकाले और 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत (ग) और हौसले से निकाला प्रसवोत्तर दिवस 2 (P2) और प्रसवोत्तर दिवस 1 (P1) में निकाले और 1 दिन के लिए सुसंस्कृत (घ) । ध्यान दें कि, जबकि उपास्थि विकास अलग संवर्धन अवधि के बाद काफी शारीरिक रहता है, ossified हिस्सा संस्कृति समय के बाद एक वृद्धि देरी से पता चलता है 2 दिन से अधिक की तुलना में हौसले से निकाली गई हड्डी इसी स्तर पर । स्केल पट्टी = 1 मिमी । (ङ) 2 दिनों के लिए टीबिया सुसंस्कृत, ई 15.5 से प्रारंभ; ध्यान रहे कि हड्डियों के दोनों सिरों के बीच के कोमल ऊतक को अधूरा हटाने से हड्डी झुकने लगती है । स्केल पट्टी = ६०० μm इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: रेटिनोइक एसिड (आरए) उपचार पर हड्डियों की लंबाई की माप। (क-ख) Tibias ई 15.5 पर निकाले और ०.१% DMSO (ए) और आरए (ख) के साथ 2 दिनों के लिए हो । दोनों कुल लंबाई और mineralized हिस्सा में अंतर को ध्यान दें । स्केल पट्टी = 1 मिमी । (ग-घ) नियंत्रण स्थिति में 6 दिनों की अवधि में और आरए की उपस्थिति में टिबिया के कुल लंबाई (ग) अथवा खनिज्ड भाग (घ) में परिवर्तन । परिणाम के रूप में दिखाया जाता है ± मानक विचलन (SD); तुलना के दो तरह के विश्लेषण के द्वारा किया जाता है प्रसरण (ANOVA) के प्रकार के साथ उपचार चर (p मान ग्राफ़ में दिखाए जाते हैं) । (ङ) युग्मित हड्डियों की लंबाई की तुलना या तो डीएमएसओ (दायां टिबिया) या आरए (लेफ्ट टिबिया) के साथ 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत होती है; प्रत्येक डॉट 3 में से एक का प्रतिनिधित्व करता है जैविक हालत प्रति प्रतिकृति । युग्मित द्वि-पुच्छ छात्र का टी-परीक्षण किया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: कुल विकास और पूर्व vivo संस्कृति के ४८ घंटे के बाद टिबिया के खनिजीकरण की तुलना । (क) मुर्गियों को मारने से पूर्व बाएं (ऊपर) और दाहिने (नीचे) के अंगों से ई 155 टिबायस और फीमर (ख) 2-दिन की संस्कृति के बाद इसी तितरबीनों और फीरों का अनुसरण किया गया । स्केल पट्टी = ६०० μm. (ग) ग्राफ विभिन्न विकासात्मक चरणों में सुसंस्कृत की वृद्धि दर का प्रतिनिधित्व करता है । कुल वृद्धि और खनिकृत भाग का विकास दोनों का आकलन किया गया । (घ) सारणी में पूरी अस्थि की आरंभिक और अंतिम लंबाई और खनिज्ड भाग को ई-155 पर पुलिया से पहले और संस्कृति में 2 दिनों के बाद दर्शाया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: स्थूल विकास प्लेटें संस्कृति में ज्यादा प्रसार नहीं दिखाती । (क-ख) समीपस्थ (क) और बाहर के लिए (ख) टिबियल विकास प्लेटें 2 दिनों के लिए e 15.5 से सुसंस्कृत । (सी-डी) समीपस्थ (ग) और डिकल (डी) टिबियल विकास प्लेटों के लिए अभिरंजक ई 17.5 पर ताजा निकाला । समीपस्थ टिबिया में EdU (+) कक्षों की संख्या में अंतर को नोट करें । आंकड़ों में अंगों के 6 सुसंस्कृत जोड़े और 3 हौसले निकाले गए हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: टिबिया संस्कृति के लंबे समय तक पर्याप्त उपास्थि वृद्धि लेकिन थोड़ा खनिजीकरण दिखा. हौसले से निकाली गई टिबिया ई 15.5 (टी = 0) (क) और संस्कृति में 6 दिनों के बाद (ख) । उपास्थि वृद्धि और mineralized भाग के विकास के बीच अंतर को ध्यान दें । स्केल पट्टी = 1 मिमी (ग) 6 दिनों की अवधि में कुल लंबाई और खनिज्ड क्षेत्र में परिवर्तनों को दर्शाने वाला ग्राफ । द = 5 सुसंस्कृत तितरस; हर समय बिंदु पर एसडी निंनानुसार है: t = 0, पूर्ण लंबाई = ०.०७७७, mineralized = ०.०२१३; टी = 3 डी, पूर्ण लंबाई = ०.१४९५, mineralized = ०.०५६; टी = 6 डी, पूर्ण लंबाई = ०.११९३, mineralized = ०.०५२१ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हड्डी ex vivo संस्कृति तरीकों के लिए कुछ समय के लिए इस्तेमाल किया गया है अस्थि विकास के जीवविज्ञान का आकलन28, लेकिन शायद ही कभी murine लंबी हड्डियों के लिए लागू किया गया है. इमेजिंग तकनीकों के विकास के साथ, पूर्व vivo की अस्थि संस्कृति एक आकर्षक तरीका है एक की स्थापना में वास्तविक समय में हड्डी विकास का अध्ययन बारीकी से जैसा कि vivo में स्थितियों । इस परिदृश्य में, यह उन स्थितियों को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है जिसमें लंबी हड्डियों की वृद्धि उनके विकास के बराबर है vivo में ।
वर्तमान अध्ययन में, हम लंबी अस्थि संस्कृति के लिए एक सरल और किफायती प्रोटोकॉल का वर्णन, सीमाओं और संभव अनुप्रयोगों को संबोधित. इस विधि का सबसे महत्वपूर्ण कदम हड्डियों के अलगाव है, जो बरकरार है और के साथ कम कोमल ऊतक के रूप में संभव के रूप में हड्डी के सिरों के बीच रहना है । हड्डियों के सिरों के बीच कोमल ऊतक छोड़ना हड्डी के सामान्य विकास को रोकेगा और झुकने को प्रेरित करेगा, जैसा कि चित्र 1Eमें उदाहरण दिया गया है । हड्डियों के सिरों पर कोमल ऊतक छोड़ दिया जा सकता है, के रूप में यह अंततः गायब हो जाएगा । एक और कदम है कि अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता है, संवर्धन थाली के लिए हड्डियों के हस्तांतरण है, क्योंकि वे आसानी से प्लास्टिक पिपेट के लिए छड़ी कर सकते हैं । एक संभव समाधान ऊपर और नीचे विच्छेदन रक्त और ऊतक टुकड़े युक्त माध्यम pipetting है, के रूप में यह एक कोटिंग है कि pipetting को चिपके से हड्डियों को रोकने में मदद करता है बनाता है ।
एक बार निकाले जाते हैं, हड्डियों की तुलना आकार तक पहुंचने के लिए विवो अवस्था में जब तक के लिए सुसंस्कृत ४८ h । हड्डी की लंबाई मापने के अलावा, वृद्धि दर (प्रति दिन लंबाई में औसत वृद्धि) इन स्थितियों में आसानी से अनुमान लगाया जा सकता है । हालांकि, वृद्धि दर परिकलन के लिए यह प्रकिया अधिक लंबी संवर्धन अवधियों में मांय नहीं है, जहां अंय विधियां, जैसे कि29लेबलिंग calcein, का उपयोग किया जाना चाहिए । रेटिनोइक एसिड है, जो समय से पहले chondrocyte विभेदन को बढ़ावा देता है के साथ उपचार, हड्डियों के विकास में एक पर्याप्त कमी की ओर जाता है, सुझाव है कि इस समय के लिए संवर्धन प्रभाव है कि विभिंन पदार्थों की हड्डी पर हो सकता है निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त है विकास. महत्वपूर्ण बात यह है कि तुलना एक ही नमूने से युग्मित हड्डियों पर भी की गई थी, जिससे कि बाईं टिबिया में आरए उपचार प्राप्त किया गया और सही नियंत्रण था । यह हड्डी संस्कृति मॉडल का एक लाभ है, के रूप में यह बनती तुलना, जो सांख्यिकीय अधिक शक्तिशाली है प्रदर्शन की अनुमति देता है ।
लंबे समय के लिए culturing उपास्थि भाग की उल्लेखनीय वृद्धि से पता चलता है, लेकिन mineralized एक के विकास में देरी, और यह इस परिणाम पर विचार जब तकनीक के आवेदन को चुनने के लिए महत्वपूर्ण है । इसी तरह के परिणाम लड़की femurs में 10 दिन तक के लिए सुसंस्कृत मनाया जो एक बढ़े एपिफाइसील क्षेत्र और एक कम diaphyseal अस्थि कॉलर14, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 6 दिन18के लिए माउस टिबिया सुसंस्कृत दिखा रहे थे । इसके अतिरिक्त, यह उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है कि उपास्थि क्षेत्र में विकास भी समरूप नहीं है: टिबिया के फीउर और समीपस्थ क्षेत्र के भारी-भरकम बाहर का क्षेत्र पोषक तत्वों को कुशलतापूर्वक सरल प्रसार द्वारा प्राप्त नहीं करता है और ठीक से विकसित नहीं हो सकता । इस संदर्भ में, अध्ययनों को विपरीत बढ़ती प्लेटों पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए, जो संस्कृति में देखी गई वृद्धि के समान, कुल वृद्धिके एक तिहाई में योगदान करने का अनुमान था । सुसंस्कृत हड्डियों के विकास में देरी भी प्रपदिकीय संस्कृतियों के लिए वर्णित किया गया था15.
इस प्रकार की संस्कृति का महत्त्वपूर्ण विचार अस्थि के अस्थिमय भाग के विकास का अभाव है । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि अस्थिविस्फोट periosteum से उपास्थि मैट्रिक्स पर आक्रमण के साथ रक्त वाहिकाओं3,4 और इस प्रक्रिया को स्पष्ट रूप से बाधित है जब हड्डी अलग है । इससे संस्कृति की परिस्थितियों में अस्थिकरण के अभाव की व्याख्या हो सकती है । Hypertrophic कोंड्रोसाइट transdifferentiation भी अस्थिविस्फोटों के एक महत्वपूर्ण स्रोत के रूप में दिखाया गया था7,8,9, लेकिन क्या यह प्रक्रिया भी भाग में रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति की आवश्यकता है, के रूप में ऐसा लगता है के दौरान फ्रैक्चर30, या कुछ अन्य ऊतकों पूर्व vivo संस्कृतियों में मौजूद नहीं है, और जांच की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, यह अच्छी तरह से हड्डी विकास को आकार देने में यांत्रिक लोड के महत्व का वर्णन किया गया है31,३२, जो लंबे समय तक हड्डियों और प्रपदिकीय हड्डियों को अलग करता है, लेकिन एक पूर्व vivo में सेटअप में अनुपस्थित है. फिर भी, वर्णित संवर्धन विधि chondrocyte गतिशीलता और अनुदैर्ध्य विकास में परिवर्तन को मापने के लिए उपयुक्त है और, इस प्रकार, कुछ अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कुल मिलाकर, वर्णित प्रोटोकॉल संस्कृति लंबी हड्डियों के लिए एक सरल और सस्ते विधि प्रदान करता है विभिंन चरणों से शुरू, जो अतिरिक्त तकनीकों के साथ युग्मित किया जा सकता है कुंजी सेलुलर और आणविक तंत्र, इस तरह के रूप में जीना समय चूक इमेजिंग13 पता , 23 या ड्रग ट्रीटमेंट ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम उसके समर्थन के लिए एलेक्जेंड्रा joyner शुक्रिया अदा करना चाहूंगा जब इस प्रोटोकॉल की स्थापना की जा रही थी, edwina mcglinn और Yi-चेंग चांग रेटिनॉइक एसिड बांटने के लिए । ऑस्ट्रेलियाई पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान विक्टोरिया राज्य सरकार और ऑस्ट्रेलियाई सरकार से अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
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