Summary
Her presenterer vi en metode for ex vivo-kultur for lange murine bein på både Foster og nyfødte stadier, egnet for analyse av bein og brusk utvikling og homeostase i kontrollerte forhold mens recapitulating in vivo prosessen.
Abstract
Lange bein er komplekse og dynamiske strukturer, som oppstår fra endokondral forbening via en brusk mellomliggende. Den begrensede tilgangen til friske menneskelige bein gjør spesielt verdifullt bruk av pattedyr modeller, slik som mus og rotte, for å se på ulike aspekter av bein vekst og homeostase. I tillegg gir utviklingen av sofistikerte genetiske verktøy i mus mer komplekse studier av lange bein vekst og ber om en utvidelse av teknikker som brukes til å studere bein vekst. Her presenterer vi en detaljert protokoll for ex vivo murine bein kultur, som tillater studiet av bein og brusk på en strengt kontrollert måte mens recapitulating meste av in vivo prosessen. Metoden beskrevet gjør at kulturen i en rekke bein, inkludert Tibia, femur, og metatarsal bein, men vi har fokusert hovedsakelig på tibial kultur her. Videre kan den brukes i kombinasjon med andre teknikker, for eksempel time-lapse Live Imaging eller narkotikabehandling.
Introduction
Orgel vekst må være tett innstilt for å hindre utseendet av vekst forstyrrelser, og innebærer regulering av flere celletyper, molekylære trasé og crosstalk mellom ulike deler av kroppen. Imaging teknikker er avgjørende for å ta opp endringene som skjer over tid i et voksende embryo, både i normale forhold, så vel som etter en forstyrrelsene er indusert i systemet. Embryo med intrauterin utvikling, slik som mye brukt gnager modeller, presentere en ekstra utfordring for Live Imaging og narkotikabehandling, som kan delvis overvinnes ved hjelp av ex vivo kultur teknikker. For å kunne recapitulate in vivo prosesser og få meningsfulle resultater, blir det avgjørende å finne de rette dyrking forhold for hvert organ eller vev.
De fleste bein av pattedyr skjelettet vokse gjennom endokondral forbening, hvor den embryonale brusk (bestående av celler kalt chondrocytes) kjører langsgående vekst og er gradvis erstattet av bein. Denne prosessen skjer på vekst platene, som ligger på slutten av lange ben, der tre soner kan skilles: hvile, proliferativ, og hypertrofisk1,2. Først den runde stamfar chondrocytes i hvile sonen overgangen til sykling søyle chondrocytes i proliferativ sonen. Under neste fase av differensiering, disse chondrocytes bli hypertrofisk og starte sekresjon type X kollagen. Hypertrofisk chondrocytes arrangerer den påfølgende trinn av forbening: de skiller ut viktige signalering molekyler, som bindevevs vekstfaktor, bein Morfogenetiske proteiner og indiske pinnsvin, og direkte mineralisering av matrisen, rekruttere blodårene til den sentrale delen av benet, og på apoptose, tillate osteoblaster (bein-forming celler) å invadere matrisen for å danne den primære forbening Center3,4. Den mineralisert matrise forenkler inntrengning av blodkar gjennom hvilke osteoblaster migrere til å erstatte denne degradert brusk med et bein matrise5. De fleste osteoblaster invadere brusk matrise fra perichondrium, en fiber lag som brytes brusk6. Alternativt, en andel av hypertrofisk chondrocytes er kjøpedyktig overleve og transdifferentiate å osteoblaster7,8,9. Den endelige lengden av benet er på grunn av den akkumulerte veksten av transient brusk, som veksten i sin tur avhenger av antall og størrelsen på hypertrofisk chondrocytes, og deres matrise produksjon10. I tillegg ble det nylig vist at varigheten av den siste hypertrofi fase samsvarer med den endelige lengden av Ben11. Derfor er stram regulering av spredning og differensiering av disse cellene nødvendig for å sikre riktig bein størrelse.
Til tross for den betydelige kunnskapen ervervet gjennom årene på organisering og utvikling av vekst platene, er de fleste av disse konklusjonene basert på observasjon av faste histologiske seksjoner. Vev snitting gir verdifull informasjon om denne prosessen, men kan bli ridd med tekniske gjenstander, så det kan ikke alltid pålitelig brukes til å anslå morfologiske eller størrelses endringer mellom ulike stadier. I tillegg, som bein vekst er en dynamisk prosess, de statiske to-dimensjonale (2D) bilder gir et begrenset innblikk i bevegelsen av cellene i vekst platen, mens time-lapse Imaging på levende vev kan tilby verdifull informasjon om atferden til chondrocytes i vekst platen.
Alle disse begrensningene kan potensielt løses ved hjelp av ex vivo bein kulturer. Stund Ben kulturen protokoller ha blitt bebygget for noen tid siden, de var limitedly henvendte seg til murine lang ben. De fleste av studiene bruker Chick Bones på grunn av de tekniske fordelene som tilbys av Chick-modellen12,13. Organotypic kulturer (luft/væske-grensesnitt) ble brukt til Chick embryonale femurs, som ble opprettholdt i kultur i 10 dager14. Den sofistikerte genetiske verktøy tilgjengelig i musen gjør denne modellen svært attraktivt å bli brukt i ex vivo bein kultur. Studiene som brukte mus til å se inn bein vekst jobbet hovedsakelig med metatarsal bein15, sannsynligvis på grunn av deres lille størrelse og større tall innhentet per embryo16. Selv om det tradisjonelt betraktet som lange bein, metatarsi inn senescence (karakterisert ved redusert spredning og involution av vekst platen17) tidligere enn andre lange bein in vivo, og derfor deres kontinuerlige vekst ex vivo ikke virkelig recapitulate in vivo-prosessen. Ved anvendelsen av denne artikkelen, vil vi bruke begrepet lange bein for bein fra proksimale og mellomliggende lem regioner. Flere tidligere studier brukte lange murine bein, slik som Tibia, i ex vivo kulturer og observerte en betydelig vekst av brusk, men lite forbening18. Vi brukte også tibial kulturer nylig, hovedsakelig for å studere chondrocyte dynamikk19. Andre studier brukte lår Bens hodene fra unge mus20 eller bare den delen av femur for kultur21. Noe flere nylig arbeider med hell forbinde det ex vivo kulturen av i sin helhet Ben med tid-lapse tenkelig å erverve tre-dimensjonale (3D) film av chondrocytes inne lever musen tissue22,23. Forfatterne klarte å observere tidligere ubemerket hendelser i omorganisering av chondrocytes til proliferativ sone23 i et godt eksempel på den potensielle anvendelsen av bein ex vivo kultur. Alternativet, det vil si å analysere statiske bilder, krever indirekte og komplekse teknikker. Dette ble et eksempel på en studie hvor han vurderte viktigheten av bunnene kloner for brusk vekst, der genetisk sporing med flerfarget reporter mus stammer kombinert med matematiske modellering ble brukt24. Derfor kan ex vivo-kultur bidra til å få innsikt i dynamiske prosesser på en raskere og mer direkte måte.
Her presenterer vi en metode for murine lange bein kultur, som kan kombineres med ulike molekylære behandlinger og/eller med tidsforløp Live Imaging. Denne protokollen tilpasser metodene som brukes i tidligere rapporter15,18,25, men løser noen flere problemer og fokuserer på lange bein som Tibia, snarere enn metatarsal Bones. Til slutt, det Utforsker potensialet for å bruke statistisk kraftig sammenkoblet sammenligninger av dyrking venstre og høyre bein separat i nærvær av ulike stoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene skal utføres etter lokale statlige og institusjonelle retningslinjer for etisk håndtering av forsøksdyr.
1. forberedelser før dagen for Bone kultur
- Sette opp tidsbestemt musen siamesere å få fostre og pups fra embryonale dag 14,5 (E 14.5) og videre.
Merk: Kulturen i lange bein kan med hell brukes på forskjellige mus stammer; i dagens protokoll, outbred Swiss Webster Wild-type mus brukes. - Forbered disseksjon medium (tilpasset fra Houston et al.15): fortynne α-minimum essensielle medium (α-mem) eller Dulbecco ' s medium (DMEM) 1/13 i fosfat-bufret saltvann (PBS) og 2 mg/ml storfe serum ALBUMIN (BSA) og filter sterilisering gjennom en 0,22 μm, 33 mm diameter sprøyte filter. Oppbevar alikvoter ved-20 ° c.
- Dagen før ekstraksjon av fostre, forberede serum-fri bein kultur medium sammensatt av DMEM inneholder 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutamin, 40 U/mL penicillin/Streptomycin, 0,05 mg/mL askorbinsyre, og 1 mM betaglycerophosphate. Filteret steriliseres gjennom en 0,22 μm, 33 mm diameter sprøyte filter og oppbevares ved 4 ° c i opptil 1 måned.
- På dagen for kulturen og før musen culling, lage 24-brønn plater og 60 mm retter med disseksjon medium og holde dem iskald. Prewarm bein kultur mediet i et vannbad på 37 ° c. Spray 80% (v/v) etanol på verktøy (pinsett og liten saks) som skal brukes til fosteret håndtering. Overfør et kikkert omfang til et klasse II biosafety kabinett.
2. kultur av fosteret og nyfødte Tibia og femur
- Cull den gravide musen gjennom cervical forvridning på ønsket svangerskaps trinn (alt fra E 14.5 til E 18.5). Hvis nyfødte pups er anvendt, fjerne seg fra moren ettall av ettall og cull av halshogging.
- Plasser musen på ryggen og sterilisere abdominal regionen ved sprøyting 80% (v/v) etanol på overflaten.
- Skjær huden og abdominal muskelen med liten saks for å få tilgang til livmor hornene.
- Pakk livmor fra bukhulen ved hjelp av pinsett og små saks, fjerne mesometrium og kutte bunnen av hornene. Plasser livmoren i en 60 mm Petri parabolen med iskald disseksjon medium og holde kulturen parabolen på isen under hele prosedyren.
- Overfør Petri parabolen med livmoren til biosafety kabinett og jobbe der fra nå av.
- Skill individuelle fostre med saks ved å skjære mellom SACs.
- Overfør individuelle SAC under en disseksjon stereomikroskopet i en ren 60 mm rett med disseksjon medium og åpne dem opp med pinsett for å skille fostre fra placentas og rengjør dem fra membraner.
Merk: Arbeid med ett embryo om gangen, mens du holder resten på isen. - Halshugge fostre og Overfør kroppen til en ren ny 60 mm rett med en 1 mL kuttet steril pipette.
- Fjerne huden av fostre eller pups med pinsett igangsetting fra baksiden og peeling den ut kassaskuff det tær.
- Skill hindlimbs fra kroppen ved å skjære med pinsett nær ryggraden og overføre dem til en ren tallerken med iskald disseksjon medium.
- Skill Tibia fra femur med pinsett ved å nøye introdusere dem mellom overflaten brusk av flate femur og proksimale Tibia.
- Fjern hoftebenet fra proksimale femur og calcaneus benet og fibula fra Tibia.
- Forsiktig fjerne bløtvevet fra femur og Tibia ved nipping og trekke den av.
Merk: Det er viktig å fjerne så mye bløtvev som mulig, ta spesiell forsiktighet i å fjerne vevet som forbinder de to brusk polene, men unngå å skade brusk, perichondrium, og bein. - Plasser de fire beina (venstre og høyre tibias og femurs) i den første brønnen på 24-brønn plate med en plast 1 mL steril pipette. Alternativt, for å sammenligne effekten av ulike behandlinger på venstre og høyre lemmer, plassere kontralateral lemmer i forskjellige brønner.
Merk: Ekstra forsiktighet bør utvises når beina er overført til brønnene, da de lett kan holde seg til pipette. - Fortsett på samme måte med så mange fostre som nødvendig.
Merk: Endre parabolen med disseksjon medium så snart det blir for tåkete, da det er viktig å se klart dissekert bein. -
Når alle de ønskede bein er overført til brønnene, fjerne disseksjon medium med en plast 1 mL steril pipette og ta ekstra forsiktighet for ikke å aspirer bein.
- Avhengig av formålet med eksperimentet, kan bildene bli tatt av bein før du fjerner disseksjon medium, som timepoint null av eksperimentet. Ta bilder med et mikroskop festet til et digitalt kamera og Kommenter eksponeringen og skalaen som brukes. For å sikre enkle og pålitelige målinger, ta bilder med god kontrast for å skille den mineralisert delen.
- Tilsett 1 mL kultur medium til hver brønn. Hvis noen behandling er ment på bein (Doxycycline, Tamoxifen, vekstfaktorer, etc.), bør det legges nå.
- For å observere effekten av veksthemming i kultur forholdene, behandle venstre tibias med retinoic syre (RA, 500 nM), mens incubating høyre tibias med et tilsvarende volum av kjøretøy (dimethyl sulfoxide [DMSO], endelig konsentrasjon 0,1%) som en kontroll.
- La beina til å vokse i to dager eller mer i en cellekultur inkubator under standard cellekultur forhold (ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator).
- For å vurdere spredning, tilsett 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) eller 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) til mediet ved en endelig konsentrasjon på 10 μM 1 − 2 h før fiksering.
Merk: Lager konsentrasjonen av EdU er 20 mM.
Forsiktig: EdU og BrdU er tymidin analoger og kan være giftig og mutagent. - Tin 4% paraformaldehyde (PFA) og fest beina ved nedsenkning i PFA i individuelle 2 mL rør.
Forsiktig: PFA er giftig og utpekt som et sannsynlig kreftfremkallende for mennesker. Unngå å puste inn paraformaldehyde pulver og damper. EdU og BrdU er tymidin analoger og kan være giftig og mutagent. - Etter en kort 10 min fiksering i PFA ved romtemperatur, overføre bein til PBS for bildeoppkjøp ved endelig timepoint. Deretter plasserer bein tilbake i PFA for overnatting festing ved 4 ° c.
- Etter fiksering bein kan behandles for ønsket nedstrøms applikasjoner.
3. måling og analyse av full lengde på benet og Mineralisert region
- Bruk et bilderedigering programvare for å måle lengden på beina, tar hensyn til omfanget av bildet. Mål både den totale lengden på benet og mineralisert regionen. Start målingene fra de første mørke cellene i den ene enden til de siste i den andre enden.
Merk: Den mineralisert regionen er preget av mørkere farge og er lett skilles fra brusk. - For å beregne vekstraten, definert som gjennomsnittlig økning i lengde per dag, dividere differansen mellom den endelige lengden på benet og den innledende en etter antall dager i kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bone kultur kan utføres fra ulike stadier. I figur 1a-D, en sammenligning mellom kultivert Tibia og ferske Hentet seg på tilsvarende stadier vises. Den første observasjonen er at opp til to dager med kultur størrelsen oppnås kan sammenlignes med in vivo bein vekst for både brusk og mineralisert bein (figur 1a, B, D). Lengre kultur perioder føre til større forskjeller mellom de kultivert bein og den nylig utpakkede (figur 1C). I tillegg, som nevnt i protokollen, er det avgjørende å fjerne bløtvev forbinder begge endene av bein, som ellers beina vil bøye. Figur 1e viser et eksempel på en Tibia vokst med ufullstendig fjerning av bløtvev versus en Tibia uten bløtvev.
Neste, tibias var kultivert for 2 dager og deres lengde ble målt. Som kan sees i figur 2a, B, kan målingen av den totale lengden og av den mineralisert delen utføres med en bildeanalyse programvare. Som vist av de Luca et al.26, har behandling med ra en sterk effekt på veksten av tibias allerede etter 2 dagers behandling og et lignende resultat ble observert i våre kulturer (figur 2b-D). Det var viktigere at eksperimentet ble utført ved hjelp av sammenkoblede bein, med høyre bein som kontroll og venstre behandlet med RA (figur 2a, B, E), som bidrar til å overvinne den naturlige variasjonen i Ben størrelse mellom ulike eksemplarer. Således er den dyrking metoden beskrevet er egnet for å vurdere effekten av ulike forbindelser på bein vekst.
Deretter ble vekstraten av bein etter kultur vurdert. Bones ble ekstrahert, målt og kultivert på E 15.5, 16,5 eller P1, og fast og målt igjen to dager senere. Både den totale økningen i lengde og lengden på den mineralisert delen ble målt (figur 3c). Et eksempel på E 15.5 Tibia og femur før kultur (figur 3a) og på slutten punktet av eksperimentet (figur 3b) vises. Som kan observeres fra grafen og tabellen (figur 3c, D), det er en konsistent økning i den totale lengden på Tibia, tilsvarende en omtrentlig økning på 9 − 29% fra den opprinnelige lengden. Dette er mindre økning enn den som er observert i vivo; den største forskjellen er sannsynligvis på grunn av nivået av proksimale brusk, større enn den flate og mindre tilgjengelig for næringsstoffer. EdU-merking viste faktisk færre positive celler i denne regionen etter kultur sammenlignet med nylig utpakkede bein av tilsvarende fase (figur 4a, C). Den EdU innlemmelse i den eksterne Tibia var lik i den kultivert og fersk utvunnet bein (figur 4b, D) den oppvoksende brusk bidrar omtrent en tredjedel til den totale veksten av Tibia in vivo på dette stadiet27, sammenlignes med veksten observert i kultur, så vi foreslår at analysen skal være fokusert på denne delen av benet. I tillegg vurderte vi mineralisering av den kultivert bein, og observere nesten ingen økning i lengden av denne regionen. Forskjellen kan skyldes fravær av fartøy og osteoblaster invasjon i ex vivo-kulturen. Dette tyder på at studier av brusk vekst kan forlenge i flere dager, mens hvis regionen av interesse er den ossified delen av benet, bør kultur perioden være kortere. Denne observasjonen ble bekreftet ved å holde Tibia i kultur for en lengre periode (opp til 6 dager). Som kan sees i figur 5, øker den totale lengden på skjelett elementet betraktelig, mens nesten ingen økning i mineralisert regionen er observert (figur 5c).
Samlet sett disse resultatene tyder på at kulturen i lange bein kan brukes til å analysere effekten av ulike faktorer på samlet bein vekst og spesielt for å vurdere brusk dynamikk. Mens godt etablerte metatarsal kulturer kan også brukes med disse formålene, sender vi at begge typer kulturer utfyller hverandre, gitt den iboende forskjellene mellom metatarsals og resten av lange bein.
Figur 1: eksempel på kultivert Tibia for ulike tidsperioder. (A-D) Sammenligning mellom nylig utpakkede Tibia (øverst) og Tibia utvinnes på E 14.5 (nederst) og kultivert for 2 dager (A), hentet på e 15.5 og kultivert for 2 dager (B), hentet på e 16.5 og kultivert for 4 dager (C) og fersk ekstrahert på Postnatal dag 2 (P2) og utvinnes på postnatal dag 1 (P1) og kultivert for 1 dag (D). Merk at mens brusk veksten fortsatt ganske fysiologisk etter ulike dyrking perioder, den ossified delen viser en vekst forsinkelse etter kultur tid lenger enn 2 dager i forhold til den ferske utvunnet benet på tilsvarende stadium. Scale bar = 1 mm. (E) Tibia kultivert for 2 dager fra e 15.5; oppmerksom på at ufullstendig fjerning av bløtvevet mellom de to endene av bein fører til bøying av benet. Scale bar = 600 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: måling av lengden på beina ved retinoic syre (ra) behandling. (A-B) Tibias utvinnes på E 15.5 og vokst for 2 dager med 0,1% DMSO (A) og ra (B). Legg merke til forskjellen i både total lengde og av den mineralisert delen. Scale bar = 1 mm. (c-D) endringer i total lengde (c) eller mineralisert del (D) av Tibia over en periode på 6 dager i kontroll situasjon og i nærvær av ra. Resultatene vises som gjennomsnittet ± standardavvik (SD); sammenligningen gjøres ved toveis analyse av varians (ANOVA) med den type behandling som variabel (p verdier er vist i grafen). (E) sammenligning av lengden av sammenkoblede bein kultivert for 2 dager med enten DMSO (høyre Tibia) eller ra (venstre Tibia); hver prikk representerer en av de 3 biologiske replikerer per tilstand. Det ble brukt to ensidige student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sammenligning av total vekst og mineralisering av Tibia etter 48 timer med ex vivo-kultur. (A) e 15.5 tibias og femurs fra venstre (øverst) og høyre (nederst) lemmer før dyrking. (B) den samme tibias og femurs fulgte opp etter 2-dagers kultur. Scale bar = 600 μm. (C) graf som representerer vekstraten av tibias kultivert på ulike utviklingstrinn. Både den totale veksten og veksten av den mineralisert delen ble vurdert. (D) tabell som viser den første og siste lengden på hele benet og den mineralisert delen før dyrking på e 15.5 og etter 2 dager i kulturen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Klumpete vekst platene viser ikke mye spredning i kulturen. (A-B) EdU farging for proksimale (A) og tibial (B) vekst plater kultivert fra e 15.5 for 2 dager. (C-D) EdU farging for proksimale (C) og tibial (D) vekst plater fersk utvunnet på e 17.5. Merk forskjellen i antall EdU (+) celler i proksimale Tibia. Data inkluderer 6 kultivert par lemmer og 3 ferske utvunnet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: lengre perioder med Tibia kultur viser betydelige brusk vekst, men lite mineralisering. Fersk ut Tibia på E 15.5 (t = 0) (A) og etter 6 dager i kultur (B). Legg merke til forskjellene mellom brusk vekst og vekst av den mineralisert delen. Skala bar = 1 mm (C) graf som viser endringene i den totale lengden og det mineralisert området over en periode på 6 dager. n = 5 kultivert tibias; SD på hvert tidspunkt er som følger: t = 0, full lengde = 0,0777, mineralisert = 0,0213; t = 3 d, full lengde = 0,1495, mineralisert = 0,056; t = 6 d, full lengde = 0,1193, mineralisert = 0,0521. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bone ex vivo kultur metoder har blitt brukt i noen tid til å vurdere biologi av bein vekst28, men har vært sjelden brukt på murine lange bein. Med det utviklingen av tenkelig teknikker, ex vivo Ben kulturen tilbyder en attraktiv vei å studere Ben oppblomstringen inne virkelig tid inne en innfatning undersøke saken grundig ligner det inne vivo vilkårene. I dette scenariet er det viktig å definere forholdene der veksten av lange bein kan sammenlignes med deres vekst i vivo.
I denne studien beskriver vi en enkel og rimelig protokoll for lang bein kultur, adressering av begrensninger og mulige bruksområder. Det mest kritiske trinnet i denne metoden er isolering av bein, som må være intakt og med som mindre bløtvev mellom endene av benet som mulig. Leaving bløtvev mellom endene av beina vil hindre normal vekst av benet og indusere bøying, som er et eksempel på figur 1e. Bløtvev i endene av beina kan stå, som det vil til slutt forsvinne. Et annet skritt som krever ekstra omsorg er overføring av bein til dyrking plate, som de lett kan holde seg til plast pipette. En mulig løsning er pipettering opp og ned disseksjon medium som inneholder blod og vev stykker, som det skaper et belegg som bidrar til å utelukke bein fra stikker til pipette.
Når ekstrahert, bein nå sammenlignbare størrelse til tilsvarende in vivo stadiet når kultivert for opptil 48 h. bortsett fra å måle lengden på benet, kan vekstraten (gjennomsnittlig økning i lengde per dag) anslås lett i disse forholdene. Imidlertid, denne adgang for oppblomstringen rate beregning er ikke lovlig over lengere dyrking perioder, der hvor annet metoder, som calcein merking29, burde bli brukt. Behandling med retinoic syre, som fremmer prematur chondrocyte differensiering, fører til en betydelig reduksjon i veksten av bein, noe som tyder på at denne tiden for dyrking er nok til å observere effekten at ulike stoffer kan ha på bein Vekst. Viktigere, sammenligningen ble også gjort på sammenkoblede bein fra samme prøven, slik at venstre Tibia fikk RA behandling og høyre var kontroll. Dette er en fordel av bein kultur modellen, som gjør det mulig å utføre sammenkoblede sammenligninger, som er statistisk kraftigere.
Dyrking for lengre tid viser betydelig vekst av brusk delen, men en forsinkelse i veksten av mineralisert en, og det er viktig å vurdere dette resultatet når du velger anvendelse av teknikken. Lignende resultater ble observert i Chick femurs kultivert for opp til 10 dager som viser en forstørret epifysal region og en redusert diaphyseal bein krage14, samt i musen Tibia kultivert for 6 dager18. I tillegg er det viktig å nevne at i brusk regionen veksten er heller ikke homogen: den store, klare regionen i femur og proksimale regionen av Tibia ikke får næringsstoffer effektivt ved enkel diffusjon og kan ikke vokse skikkelig. I denne sammenheng bør studiene fokusere på den motsatte voksende platene, som ble anslått å bidra til en tredjedel av total vekst27, i likhet med den observerte veksten i kulturen. Forsinkelsen i veksten av kulturperler bein ble også beskrevet for metatarsal kulturer15.
En viktig faktor for denne type kultur er fraværet av veksten av den ossified delen av benet. Det er godt etablert at osteoblaster invadere brusk Matrix fra periosteum sammen med blodkar3,4 og denne prosessen er åpenbart forstyrret når benet er isolert. Dette kan forklare fraværet av forbening under kultur forhold. Hypertrofisk chondrocyte transdifferentiation ble også vist som en viktig kilde til osteoblaster7,8,9, men om denne prosessen også krever delvis tilstedeværelsen av blodkar, som det ser ut til å gjøre under brudd helbredelse30, eller noe annet vev som ikke finnes i ex vivo kulturer, trenger videre etterforskning. I tillegg er det godt beskrevet viktigheten av mekanisk belastning i forming bein vekst31,32, som påvirker lange bein og metatarsal bein annerledes, men er fraværende i en ex vivo dyrking oppsett. Likevel, den beskrevne dyrking metoden er egnet for å måle chondrocyte dynamikk og endringer i langsgående vekst, og dermed kan brukes for visse applikasjoner.
Total, det beskrevet protokollen skaffer en enkel og billig metoden å kulturen lang Ben igangsetting fra annerledes scener, hvilke kan forente med i tillegg teknikker å henvende seg nøkkel Cellular og molekylær mekanismer, som botid-lapse tenkelig13 , 23 eller behandling av narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Alexandra Joyner for hennes støtte når denne protokollen ble etablert, Edwina McGlinn og Yi-Cheng Chang for deling retinoic acid. The Australian regenererende Medicine Institute er støttet av tilskudd fra staten regjeringen i Victoria og den australske regjeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K.
- Kronenberg, H. M.
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
