Summary
هنا، نقدم بروتوكول للحث محليا ً على وجود فُبر الأوبيفي في الفئران. نعرض كيفية حفر ثقب في سن الماوس وفضح اللب، من أجل التسبب في التهاب محلي. كما يتم عرض طرق التحليل للتحقيق في طبيعة هذا الالتهاب، مثل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وعلم الأنسجة.
Abstract
يمكن دراسة الآليات التي تنطوي عليها الالتهاب المستحث المحلي باستخدام العديد من النماذج الحيوانية المتاحة. واحدة من هذه هي تحريض من أمراض اللثة apical (AP). التهاب اللثة Apical هو مرض شائع من طبيعة التهابية في أنسجة اللثة المحيطة جذر الأسنان. من أجل فهم أفضل لطبيعة وآلية هذا المرض فمن المفيد لتنفيذ الإجراء في الفئران. يتم تحقيق الحث على هذا الالتهاب odontogenic عن طريق الحفر في سن الماوس حتى يتعرض لب الأسنان. بعد ذلك، لا يزال لب الأسنان عرضة للتلوث بالنباتات الفموية الطبيعية مع مرور الوقت، مما تسبب في إصابة اللثة. بعد هذه الفترة الزمنية ، يتم التضحية بالحيوان ، ويمكن تحليل الأسنان وعظم الفك بطرق مختلفة. وتشمل التحليلات النموذجية التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (لتقييم ارتشاف العظام)، وتلطيخ النسيج، والكيمياء المناعية، والتعبير عن الحمض النووي الريبي. هذا البروتوكول مفيد للبحوث في مجال البيولوجيا عن طريق الفم لفهم أفضل هذه العملية الالتهابية في بيئة تجريبية في الجسم الحي مع ظروف موحدة. يتطلب الإجراء التعامل الدقيق مع الفئران والفك المعزول، والعرض البصري للتقنية مفيد. يتم عرض جميع الجوانب التقنية للإجراءات المؤدية إلى أمراض اللثة المستحثة وتوصيفه في نموذج الماوس.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو الحث على وجود فحولاللثة في الماوس عن طريق تلويث قمة مع البكتيريا الطبيعية ، ومن ثم دراسة مختلف خصائص هذه العملية المرضية.
التهاب اللثة Apical (AP) هو مرض شائع من طبيعة التهابية في أنسجة اللثة المحيطة جذر الأسنان. يمكن أن يسبب هذا المرض الأسنان ألم شديد ويجب أن يعالج من قبل طبيب الأسنان. وتشمل خيارات العلاج علاج قناة الجذر (الابتدائية أو الثانوية)، والجراحة اللبية، واستخراج الأسنان، أو المتابعة اعتمادا على النتائج السريرية والإشعاعية، ورأي الطبيب. آلية هذه العملية الالتهابية ، على الرغم من دراستها لعدة عقود1،2،3، لا تزال غير مفهومة بشكل شامل. وبالنظر إلى شدة هذا المرض ، هناك بالتالي حاجة واضحة للبحوث التي تعالج طبيعته الأساسية. وبالتالي، فإن النظم التي يمكن فيها دراسة AP تحظى باهتمام علمي كبير.
منذ AP هي عملية مرضية معقدة تنطوي على الأنسجة المحلية والجهاز المناعي، والدراسات في المختبر غير كافية لفهم كامل للعمليات. دراسة العينات السريرية لهذا المرض هي أيضا إشكالية بسبب القيود الأخلاقية والتباين الكبير بين مختلف الناس والمراحل السريرية المختلفة4،5، وبالتالي ضرورة في نماذج الجسم الحي. وتستند هذه النماذج على مفهوم تعريض لب الأسنان للتلوث ومراقبة رد الفعل الالتهابي للجسم لهذا التحفيز في الأنسجة المحيطة6،7. وتشمل النماذج الشائعة في الجسم الحي القوارض أو الحيوانات الأكبر مثل الكلاب. على الرغم من التحدي السريري في علاج الفئران، والتي هي الحيوانات الصغيرة جدا مع أسنان مصغرة، ومزايا نموذج الماوس كبيرة: عمليا، والعمل مع الفئران هو بسيط من الناحية الفنية من حيث المرافق وأكثر فعالية من حيث التكلفة، و من الناحية العلمية، الماوس هو نموذج حيواني مدروس جيدا مع الأدوات الوراثية والجزيئية المتاحة بسهولة والجينوم مدروسة جيدا. في الواقع، استخدمت الدراسات السابقة نموذج الماوس لدراسة إشارات التهابية وارتشاف العظام والخلايا المشاركة في التهاب اللثة apical8،9،10،11. لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول واضح حول كيفية استخدام نموذج الماوس لدراسة AP. هنا، نحن نصف مثل هذا البروتوكول.
البروتوكول الموصوف هنا لديه ميزة كبيرة من كونها مناسبة لدراسة خروج المغلوب (KO) الفئران وتعلم كيف يؤثر عدم وجود جين معين التهاب الأسنان7،12. وتشمل التطبيقات المفيدة الأخرى لهذا البروتوكول دراسة آثار الأدوية والظروف النظامية على تطور التهاب اللثة الapical13، وتأثير التهاب اللثة الأوبيعلى تطور نخر العظم في الفكين14 , 15 والعلاج بالخلايا الجذعية لتجديد العظام16.
ويمكن أيضا تعميم هذا البروتوكول كنموذج لدراسة الالتهاب المحلي. لدراسة العملية الالتهابية ، تم تطوير العديد من نماذج الماوس ، والتي تشمل على سبيل المثال التهاب القولون المستحث أو التهاب المفاصل17،18. هذه النماذج لها آثار نظامية وليس لها سيطرة مدمجة في نفس الحيوان. نماذج لالتهاب اللثة apical المستحثة، والتي تشمل السيطرة المضادة دون التهاب، لديها ميزة التغلب على هذه القيود14،19.
ولذلك فإن البروتوكول الموضح أدناه مفيد للباحثين المهتمين بالعمليات الالتهابية المحلية. الطبيعة الخاضعة للرقابة من هذا الالتهاب، وحبسه إلى موقع معين، والأسنان السيطرة المضادة، وكلها تجعل هذا البروتوكول قيمة لدراسة الآليات التي تنطوي عليها هذه العملية. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول مفيد للباحثين المهتمين في الجوانب السريرية للالتهاب المحيط. نموذج الماوس مثالية لدراسة متغيرات مختلفة من المرض، بالإضافة إلى ميزة القدرة على إجراء التلاعب اتلاف وراثي بسهولة في نموذج الماوس، للتحقيق في نشاط جينات محددة في التهاب حول اللبأ.
من الناحية الفنية، فإن الإجراء السريري يشكل تحديا لتنفيذ بسبب الأبعاد الصغيرة للأسنان الفئران. سيكون من المفيد تصور هذا الإجراء من أجل معرفة المزيد عن تحديد المواقع، والمعدات اللازمة، والأداء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة للجامعة العبرية (الأخلاقيات رقم. MD-17-15093-5).
1. التخدير الحيواني وتحديد المواقع
- إعداد حلول معقمة على النحو المبين أدناه.
- إعداد 5 مل من 7 ملغ / مل من الكيتامين و 0.09 ملغ / مل ميديتوميدين المخففة في محلول الفوسفات العازلة (PBS) / المالحة.
- إعداد محلول معقم من Atipamezole (0.4 ملغ / مل) المخفف في PBS / المالحة (الموصى بها لإعداد كمية 5 مل).
- إعداد محلول معقم من Mepivacaine (7.5 ملغ / مل) المخفف في PBS / المالحة للتخدير الموضعي (قارورة واحدة الموردة من Mepivacaine يكفي لمخزون من 7.2 مل).
- استخدام 6-8 أسابيع من العمر الإناث C57BL/6 الفئران لهذه التجربة. إبقاء الحيوانات في وحدة حيوانية محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF)، مع المياه والغذاء القياسية التي يوفرها المرفق وتغذية الحيوانات ad libitum.
- وزن الفئران وحقن داخل peritoneally (IP) حجم 10 درجة مئوية لكل غرام من الوزن. على سبيل المثال، للماوس الذي يزن 20 غراما،
حقن 200 ميكرولتر من محلول الكيتامين / ميديتوميدين. وهذا سيعطي التركيز النهائي من (70 ملغ / كغ) الكيتامين و (0.9 ملغ / كغ) Medetomidine
لكل الحيوان. - من أجل منع تقرح العين بسبب الجفاف أثناء الإجراء، وتطبيق مرهم العين التي تحتوي على الكلورامفينيكول (5٪) على عيون الحيوانات وهم تحت التخدير. الحفاظ على الحيوانات الدافئة مع مصباح في حين أنها التخدير. تحقق من عمق التخدير عن طريق التحقق من رد الفعل دواسة (أداء قرصة اصبع القدم شركة).
- بعد تخدير الماوس، ضع الماوس على جانبه الأيمن (للباحث الأيمن) على سطح رغوة البوليسترين مقذوف الخلية المغلقة وإرفاق القدمين على السطح باستخدام الشريط.
- فتح الفم باستخدام العصابات المطاطية الصغيرة حول القواطع (1 للقواطع العليا، و 1 للقواطع السفلى) التي عقدت في مكان بواسطة الإبر الطويلة المثبتة في سطح رغوة البوليسترين مقذوف الخلية المغلقة.
- اسحب الخد الأيمن باستخدام ملقط مسجلة على السطح. استخدام الملقط التي يتم إغلاقها في حالة ثابتة.
- ضع السطح مع الماوس في وضع عمل مريح يتيح الوصول إلى الأضراس الفكية، وذلك باستخدام التكبير السليم (مجهر مجهر أو مجهر سريري) والضوء.
- سحب اللسان باستخدام ملقط أو ملعقة الأسنان وحقن التخدير الموضعي مع إبرة قياس 27 في أضعاف المخاطية المتاخمة للضرس الفك السفلي الأول. 25-50 درجة مئوية كافية. وينبغي تصور تورم الأنسجة حول موقع الحقن.
2. التعرض لب الورق
- استخدام لدغ الأسنان جولة ، أو نفس الحجم لدغ الماس (ينصح ساق طويلة) بسرعة 800 طلقة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) ، تعلق على أي محرك الأسنان مناسبة (على سبيل المثال خفض عزم الدوران التلقائي (ATR) المحرك).
- حفر على الجزء الانسدادي من الأضراس الفك السفلي الأيمن الأول حتى قرون اللب مرئية من خلال العاج. استخدام رشقات نارية قصيرة من المحرك لمنع منطقة الإفراط في التدفئة.
- استخدام ملف K أو H-ملف #8 أو #10 لاختراق اللب وإدراج الملف في قرون اللب (mesial والبعيدة) عن طريق كسر العاج تغطيلهم. يتم تعقيم الملفات بواسطة الأوتوكلاف.
- مواصلة العمل مع الملفات داخل اللب في عمق ممكن، مع توسيع الفتحات مع الملفات. عادة سيكون هناك نزيف مرئي من اللب.
- تأكد من تقريب حواف حادة من الأسنان مع لدغ وإزالة الأسنان من انسداد، من أجل الحد من الألم أثناء التجربة. تنظيف الحطام أثناء الإجراء باستخدام فرشاة دقيقة.
- اترك الأسنان المنافية (اليسرى الأولى الأضراس الفكية) كتحكم.
3. نهاية الإجراء السريري
- تحرير الماوس من حالة التثبيت وحقن Atipamezole IP (10 درجة مئوية لكل غرام من وزن الجسم. وهذا سيعطي جرعة نهائية من (4 ملغ / كغ) Atipamezole.
- حقن البوبرينورفين المخفف في PBS / المالحة (0.05 ملغ / كغ) IP (الموصى بها لإعداد كمية 3 مل في يوم الإجراء). راجع المناقشة للحصول على تفسير لماذا تخفيف الألم ضروري.
- تأكد من تعافي الحيوانات من التخدير قبل تركها. أعطهم الطعام اللين لأنهم قد يكونون غير قادرين على تناول الطعام الصلب بسبب ألم الأسنان.
4- متابعة الإجراءات اللاحقة (42 يوماً)
- في الأيام الثلاثة الأولى بعد الإجراء، قم بوزن الحيوانات وحقن البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) IP مرة واحدة في اليوم (يوصى بإعداد كمية 6 مل).
- خلال فترة التجربة (42 يوما عندما يتراكم التهاب) رصد الحيوانات من حيث الوزن والتقييم السلوكي العام 2-3 مرات في الأسبوع.
- توصيل الطعام اللين للالحيوانات خلال فترة المتابعة. بلل الطعام بالماء ووضعه في طبق بيتري على أرضية القفص.
5- إنهاء التجارب وتحليلها
- عندما تم الانتهاء من 42 يوما11 من المتابعة ، والتخدير الحيوانات IP مع الكيتامين / xylazine بتركيز 106.25 ملغ / كغ الكيتامين ، و 75 ملغ / كغ Xylazine (حل الأوراق المالية من 42.5 ملغ / مل الكيتامين ، و 1.5 ملغ / مل Xylazine في حجم إجمالي قدره 2 مل هو الموصى بها) وإصلاح خلع عنق الرحم.
ملاحظة: هناك خيارات مختلفة للتحليلات المحتملة من أجل تقييم التهاب20،21. هنا سيتم وصف تحليل الأنسجة بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وتلطيخ النسيج. - بعد القتل الرحيم، استخدم المقص الجراحي والملقط لقطع جزء من الفك بما في ذلك الأضراس الثلاثة (بشكل منفصل لكل تحكم معالج من الجانب وغير المعالج). باستخدام ملقط قشر قبالة قدر الإمكان الأنسجة الرخوة، وترك العظام والأسنان في الغالب على العينة.
- شطف الأنسجة لفترة وجيزة في PBS، ومن ثم وضعه في البارافورمالهايد (PFA) 4٪ (المخفف في PBS) لمدة 24-48 ساعة لتثبيت.
تحذير: استخدم PFA في غطاء محرك السيارة الكيميائية، ووفقاً للمبادئ التوجيهية لورقة بيانات سلامة المواد (MSDS). - بعد 24-48 ساعة، شطف مع PBS 3X من أجل غسل PFA.
- التصوير المقطعي المحوسب
- لتحليل التصوير المقطعي المحوسب الصغير، خذ الأنسجة المقطوعة (جزء من الفك السفلي بما في ذلك 3 أضراس، بأبعاد حوالي 4 مم × 5 مم × 1 مم) إلى ماسح ضوئي صغير مقطعي، ضعها في أنبوب قطره 12 مم مملوء بـ 1.5 مل من PBS الموجهة بحيث تكون الأسطح الشدكة أو اللغوية من الأسنان والجذر ووضع موازية لأسفل الأنبوب. فصل بين العينات مع الإسفنج، وتغطيالجزء العلوي من الأنبوب مع فيلم مرن.
- افتح لوحة المسح واختر رقم القياس. اختيار ملف التحكم مع المعلمات التالية: الطاقة من 70 كيلو فولت، كثافة 114 درجة مئوية، والقرار من 6 ميكرومتر3 حجم voxel.
- انقر على طريقة العرض الكشفية، وعندما تظهر الصورة، انقر فوق الخط المرجعي ووضع علامة على منطقة العينات للمسح الضوئي. بعد كل عينة فوق إضافة المسح الضوئي. عند الانتهاء من وضع علامة على العينات، انتقل إلى قائمة المهام واختر بدء مهام التفاعل.
ملاحظة: يمكن استخدام نفس العينات فيما بعد لعلم الأنسجة. من المهم أن لا تجف أثناء التصوير المقطعي المحوسب.
- استخدم برنامج كمبيوتر مناسب لمحاذاة الأشعة المقطعية الدقيقة وتحليلها.
- افتح العينة على مستوى XY في تقييم التصوير المقطعي المحوسب الصغير. اختر ثلاث نقاط على كل عينة للمحاذاة:
إنقباض الانقباض الوضيع - يحدد أصل نظام الإحداثيات.
الجزء الإكليلي من القناة الميسيال - يحدد نقطة على محور Z.
انقباض apical القاصي - يحدد نقطة على مستوى XZ. - استخدم أداة القياس على اللوحة اليسرى، وارسم خطًا يصل إلى كل نقطة. حدد كل نقطة من النقاط الثلاث بقيمة X وY و Z، كما تظهر في اللوحة اليمنى.
- حدد مجال الاهتمام في العينة عن طريق اختيار المهمة في إطار تقييم μCT، وانقر على التقييم ثلاثي الدُعد . سيظهر مستطيل ونافذة ذات أبعاد لكل محور على الشاشة. تطابق أبعاد المستطيل لتناسب منطقة الاهتمام على محور XY عن طريق النقر في الزوايا مع الزر الأوسط للماوس. اختر الأبعاد في محور Z عن طريق إدراج أول شريحة من الفائدة في المربع Z ضمن VOI Start، وعدد الشرائح من الأول حتى آخر شريحة عدد من الفائدة في المربع Z تحت Dim.
- انقر على التطبيقات تحت مدير جلسةالعمل، واختر DECterm. انتظر بضع ثوان ٍ لفتح نافذة، ثم اكتب الخطوات الخمس للبرنامج النصي المائل الموضحأدناه وفقًا للإرشادات التالية (بين الأسطر انقر فوق enter):
الشعيرات
محمد الدوسري
محمد الدوسري - نسخ اسم isq (ملف الفائدة): اختر طرق العرض ضمن مدير جلسة العمل وانقر فوق microCTdata. ابحث عن الملف الذي يعمل عليه، وانقر على الملف الأوسط. ثم انقر مرة أخرى في منتصف الإطار من DECterm.
- أدخل قيم X وY & Z (مع وجود مسافة بينهما) التي تم تحديدها ضمن VOI عند اختيار المنطقة ذات الأهمية.
- أدخل قيم X وY & Z (مع وجود مسافة بينهما) والتي تم تحديدها تحت التعتيم عند اختيار المنطقة ذات الأهمية.
- انتظر حتى تلقي رسالة: isq إلى الهدف مكتمل.
(الخطوة الثانية - محاذاة):
محاذاة z
محمد الدوسري
محمد الدوسري - أدخل قيم X وY & Z (مع مسافة بينهما) التي تم تحديدها لأصل نظام الإحداثيات.
- أدخل قيم X وY & Z (مع مسافة بينهما) التي تم تحديدها للنقطة على محور z.
- أدخل قيم X وY & Z (مع مسافة بينهما) التي تم تحديدها للنقطة على مستوى XZ.
- الانتظار حتى تلقي رسالة: "تم إكمال align_Z"
(الخطوة الثالثة- رأس):
راس
محمد الدوسري
0 0 0
0 0 0 - انقر فوق enter.
(الخطوةالرابعة - تحويل الملف من الهدف إلى isq):
محمد محمد
محمد الدوسري - نسخ اسم isq (ملف الفائدة): اختر طرق العرض ضمن مدير جلسة العمل وانقر فوق بيانات microCT. ابحث عن الملف الذي تعمل عليه، وانقر على الملف الأوسط. ثم انقر مرة أخرى في منتصف الإطار من DECterm. محو (باستخدام "backspace") ". ISQ" في نهاية الملف ثم اكتب:"_new. ISQ" للتعرف على الملف المحاذي.
- انقر على enter | أدخل.
- الانتظار حتى تلقي رسالة: "toisq_from_aim مكتمل"
(الخطوة الخامسة- الوجه):
محمد محمد
(أ) - نسخ اسم isq الجديد (ملف الفائدة): اختر طرق العرض تحت مدير جلسة العمل وانقر فوق بيانات microCT. ابحث عن الملف الذي يعمل عليه، وانقر على الملف الأوسط. ثم انقر مرة أخرى في منتصف الإطار من DECterm.
- انقر على enter | أدخل. انتظر لتلقي رسالة: "اكتمال isq_to_aim"
الوجه
(أ)
Aa
Zx
الانتظار لتلقي رسالة: "flip_aim مكتمل"
من
Aa - نسخ اسم isq الجديد: اختر طرق العرض ضمن مدير جلسة العمل وانقر فوق بيانات microCT. ابحث عن الملف الذي يعمل عليه، وانقر على الملف الأوسط. ثم انقر مرة أخرى في منتصف الإطار من DECterm. محو (باستخدام "backspace") ". ISQ" في نهاية الملف ثم اكتب: "_flip. ISQ" للتعرف على الملف المحاذي.
- الانتظار حتى تلقي رسالة: "من_aim_to_isq إكمال"
- افتح العينة على مستوى XY في تقييم التصوير المقطعي المحوسب الصغير. اختر ثلاث نقاط على كل عينة للمحاذاة:
- الكنتوري
- اختيار الشريحة التي تمثل ما يقرب من منتصف الأسنان، والتي يتم تقديم اللب الإكليلي، لب الرادسي من كل من القنوات، وكلا foramens apical.
- يدويا وضع علامة على كفاف الفائدة على شريحة الأوسط عن طريق النقر على لوحة كفاف العلوي الأيسر- بدءا من نقطة بعيدة من قمة الجذر القاصي علامة الحدود apical بشكل كوري إلى منطقة apical radiopaque، من خلال الحدود mesial من قمة الجذر mesial بعد الحدود البعيدة للجذر الوضيع والحدود الميسية للجذر القاصي عبر منطقة الفرو (انظر الشكل 3 ثانياً والرابع).
- نسخ هذا كفاف (Ctrl + C، Ctrl + V) وتعديله وفقا لذلك إلى 5 شرائح وضعت على جانبي الشريحة الوسطى.
- لحساب حجم الأنسجة من كفاف ملحوظ لكل عينة اختيار مهمة في إطار تقييم μCT، وانقر على التقييم 3D. في إطار التقييم 3D انقر فوق حدد قرب المهمة واختيار عامل تصفية لحساب حجم الأنسجة (التلفزيون).
- علم الأنسجة
- بعد إزالة الأنسجة من الماسح الضوئي MICRO-CT، صائق الأنسجة عن طريق وضع كل عينة في أنبوب الطرد المركزي الصغير مع 1 مل من حمض الإيثيلين ديايمينتراسيتيك (EDTA) 0.5 M درجة الحموضة 8.0 لمدة 10 أيام. تغيير حل EDTA كل 3 أيام.
- الجفاف: وضع عينات في أشرطة النسيجية، وإلى زيادة تركيزات الإيثانول، ساعة لكل منهما، على النحو التالي: 70٪ الإيثانول (في هذه المرحلة يمكن وقف العملية لعدة أسابيع، طالما يتم الاحتفاظ العينات في الإيثانول)، 90٪ الإيثانول 2X، 100٪ الإيثانول 2X، xylene 2X (الحذر: استخدام إكسيلين في غطاء محرك السيارة الكيميائية، ووفقا للمبادئ التوجيهية MSDS).
- نقل الكاسيت إلى البارافين السائل (60 درجة مئوية) وترك في غطاء محرك السيارة الكيميائية بين عشية وضحاها للزيلين لتتبخر.
- حظر: استخدام آلة حظر النسيجية لتضمين العينات في البارافين. كن حذرا لتضمينها في موقف صحيح (أي، يجب أن تكون موجهة إلى التاج والجذور موازية للجزء السفلي من القالب، بطريقة أن الأسنان هو "الاستلقاء") من أجل الحصول على أقسام المترهل. العينات الآن على استعداد لقطع مع ميكروتومي.
- قطع المقاطع: ابدأ بقطع شرائح سميكة من حوالي 20 درجة مئوية حتى تصل إلى الجزء ذي الصلة من الأنسجة. مرة واحدة التعرف على أي جزء من الأسنان (التاج أو الجذور) تغيير إلى أقسام من 6 ميكرومتر، وتغيير زاوية القطع وفقا للقسم السابق.
- على سبيل المثال، إذا كان القسم السابق يتضمن التاج ولكن ليس الجذور، تغيير زاوية الكتلة في ميكروتومي بحيث تأتي الجذور أقرب إلى السكين، والتاج يعود (أجزاء من الأسنان يمكن التعرف عليها بالعين المجردة على الكتلة نفسها).
- الاستمرار في ضبط زاوية حتى الحصول على أقسام sagittal بما في ذلك اللب الإكليلي والرادجي، وforamen apical. قطع في هذا الاتجاه أكبر عدد ممكن من شرائح، حتى يتم قطع جميع الأنسجة ذات الصلة.
- لبروتوكولات تلطيخ (على سبيل المثال، هايموتوكسيلين وإيوسين تلطيخ (H & E)، براون وبرين تلطيخ، تارترات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) تلطيخ، الكيمياء المناعية)، انظر20،21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد في الشكل 1مخطط انسيابي للخطوات التجريبية. كما هو مذكور في البروتوكول ، يتم التخدير الفئران ، ويتم حفر الأضراس الفك السفلي الأول على جانب واحد حتى التعرض لب الورق ، في حين يتم ترك الأسنان الغيرالأضلاع كسيطرة. بعد ذلك، تترك الأسنان لتكون ملوثة بالنباتات عن طريق الفم لمدة 42 يوما، يتم خلالها رصدها وتلقي أدوية الألم. بعد 42 يوما، يتم قتل الفئران، ويتم أخذ الأسنان والفك المجاور لتحليلها.
ويبين الشكل 2 الصور السريرية للماوس الفك السفلي بعد التعرض الأول لب الأضراس الأيمن. في الشكل 2A يظهر الفك السفلي كله، في حين أن بداية في الشكل 2B يظهر توسيع الأضراس اليمنى الأولى المعالجة. يتم استخدام الأضراس الأول الأيسر كعنصر تحكم. ويمكن رؤية التعرض لكل من قرون اللب mesial والبعيدة ومدخل القنوات في الشكل 2B. لاحظ أنه تم خفض الأسنان ميكانيكيا إلى انسداد فرعي من أجل الحد من الألم.
بعد تعرض لب الأسنان للنباتات عن طريق الفم ، يتم تلوث لب الأسنان في نهاية المطاف6،7 ويصبح نخريا. وفقا للأدب22, غرام البكتيريا السلبية ثم تفرز lipopolysaccharide (LPS) إلى المنطقة apical من الأسنان. من خلال رد فعل معقد من الجهاز المناعي ، واحدة من النتائج هي ارتشاف العظام في المنطقة المحيطية ، والتي هي السمة المميزة لالتهاب اللثة الأبهري23. ويمكن تحديد هذا ارتشاف العظام وتحديد هالك بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. في الصور المقطعية الدقيقة، تشير المناطق المحيطة بالأشعة إلى المناطق التي أصبحت فيها أنسجة العظام الصلبة آفة سهلة الذوبان بسبب العملية الالتهابية. في الشكل 3، تظهر الصور التمثيلية للميكرو CT الأسنان المعالجة مقارنة بعنصر التحكم. يشير السهم في الشكل 3AIII إلى التعرض لب mesial (لا يظهر التعرض لب القاصي على هذه الشريحة من العينة)، وتحيط المناطق الإشعاعية المحيطة بالميسيال والبعيدة من ارتشاف العظام بخط متقطع. رسم بياني للقطعة المربعة هو موضح هنا يحدد كمية ارتشاف العظام المحيطية الكبيرة في الأسنان المعالجة مقارنة بالضوابط.
في حين أن التصوير المقطعي المحوسب الجزئي هو تقنية ممتازة لتقييم حجم ثلاثي الأبعاد للآفات، إلا أنه يفتقر إلى المعلومات المتعلقة بتكوينها البيولوجي. تلطيخ النسيج، كما هو معروض في الشكل4، يوفر هذه المعلومات. يتم إظهار تلطيخ H & E في الأسنان التحكم مقارنة مع الأسنان المعالجة. في الأسنان المعالجة (الشكل4B، C،D)، لب الأسنان نفسه يعرض نخر التي يمكن رؤيتها بوضوح في H & E تلطيخ (الشكل4C)،مقارنة مع السيطرة على الأنسجة اللب المنظمة (الشكل4A). بالإضافة إلى ذلك، والأهم من ذلك، في المنطقة المحيطة بالأسنان المعالجة آفة حول الجنب، تتألف من الخلايا المناعية (الضامة والخلايا الليمفاوية المهيمنة)، وتصور (الشكل4D)(بالمقارنة مع الرباط اللثة صحية (PDL) و أنسجة العظام في المنطقة المحيطة من الأسنان السيطرة). هذه الآفة المحيطية هي النتيجة المرجوة من تقنية أمراض اللثة اللاهسية المستحثة المعروضة هنا.
من ناحية أخرى، يمثل الشكل 5 تلوثًا غير ناجح يمكن أن يحدث في حالات نادرة (يظهر 85% على الأقل من الحيوانات ارتشاف العظام في التصوير المقطعي المحوسب الدقيق)، أي السن الذي تعرض للنباتات الفموية لمدة 42 يومًا، ولكنه لم يقدم نخر اللب ، وبالتالي لم تثبت فقدان العظام وآفة حول الشبه في الأشعة المقطعية الدقيقة (الشكل5A)والأنسجة (الشكل5B)التحليلات.
الشكل 1: المحور الزمني للعملية التجريبية. تمثيل تخطيطي للتقدم الزمني للإجراء التجريبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور السريرية للفأر الفك السفلي بعد التعرض لب الأضراس الأول. (أ) الفأر الفك السفلي، أول الأضراس اليمنى مع اللب المكشوفة، أول الأضراس اليسرى بمثابة عنصر تحكم غير معالج. (ب) توسيع الأضراس الأيمن مع اللب المكشوفة. ويمكن تصور مدخل القنوات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل التصوير المقطعي المحوسب. (أ) التصوير المقطعي المحوسب الدقيق التمثيلي (شرائح 6 ميكروغرام) من الأسنان المعالجة (AIII، AIV) والتحكم (الذكاء الاصطناعي، AII). نقاط السهم في التعرض لب mesial (التعرض لب القاصي غير موجود في هذه الشريحة). تحيط بخطوط متقطعة المناطق المحيطة بالعظام المجاورة للسن المعالج. AII، AIV- صور تمثيلية لوضع علامات كفاف. (ب) مربع مؤامرة قياس حجم الأنسجة (كما تقاس كفاف ملحوظ ل 11 شريحة من كل عينة) من السيطرة (البرتقال، ن = 14 الحيوانات) مقارنة مع العينات المعالجة (الأزرق، ن = 15 الحيوانات). وقد أُجري التحليل باستخدام برنامج التقييم Scanco للأشعة المقطعية الدقيقة. حول التوجه). تم وضع علامة على ملامح لمدة 5 شرائح على جانبي منطقة منتصف الأسنان (جميع معا 11 شرائح). تم حساب حجم الأنسجة لمحيط كل عينة باستخدام البرنامج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الصور التمثيلية للنسيج H&E: (أ) شريحة النسيج ية من أسنان التحكم. (ب) شريحة النسيج ية من الأسنان المعالجة، مع آفة شديدة حول الشبه المقدمة. (C) توسيع الأنسجة النخرية. (D) توسيع أنسجة الورم الحبيبي حول اللب P = اللب، D = العاج، B = العظام، BM = نخاع العظام، PDL = الأربطة اللثة، N = اللب النخري، G = الورم الحبيبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال على التلوث غير الناجح: (أ) صورة تمثيلية للميكرو CT للسن مع تعرض اللب (سهم أبيض)، ولكن لا يوجد فقدان كبير للعظام المحيطة، يرتبطبالصورة التمثيلية للنسيج H&E من نفس الأسنان الكشف عن اللب الحيوي (وليس نخري)، والأنسجة apical العادي. P = اللب، D = العاجين، B = العظام، BM = نخاع العظام، PDL = الأربطة اللثة. (ج) توسيع الأنسجة المكلسة المعروضة في B. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم إدخال طريقة هنا لتحريض من أمراض اللثة apical في الفئران. والهدف من هذه الطريقة هو استغلال شرط التهاب اللثة apical لدراسة آليات ونتائج هذه العملية الالتهابية. وقد تسبب في أمراض اللثة Apical في الفئران 6-8 أسابيع القديمة، وهو العمر الذي يتم تطوير الجذور بشكل كامل24. من أجل التسبب في فُقد اللثة في هذا النموذج ، يتعرض لب الأسنان من الأضراس الفكية للفأر باستخدام نتوء الأسنان. البكتيريا من النباتات عن طريق الفم من الفئران (في ظروف منتدى جنوب المحيط الهادئ) غزو قنوات اللب والجذر من الأسنان، مما تسبب في نخر اللب، وإفراز LPS إلى الأنسجة apical، مما يؤدي إلى التهاب apical.
عند تنفيذ هذا الإجراء، إيلاء الاهتمام لهذه الخطوات الحرجة التالية. تحديد المواقع الصحيح للالحيوانات أثناء التعرض لب هو أمر بالغ الأهمية لنجاح الإجراء. خطوة حاسمة هي التعرض السليم لللب. عدم كفاية التعرض للقناة يمكن أن يؤدي إلى تشكيل جسر Dentin، مما قد يؤدي إلى فشل الإجراء وعدم القدرة على إنشاء AP. خلال التعرض لب الورق، يلزم الاهتمام لتقليل إصابة الأنسجة الرخوة أثناء التعرض لب الورق لتجنب الألم غير المرغوب فيه والالتهاب في مناطق أخرى والتي قد تسبب آثار جانبية. المحاذاة السليمة للعينات في برنامج تحليل التصوير المقطعي المحوسب الجزئي أمر بالغ الأهمية من أجل الحصول على نتائج قابلة للتفسير. عند إعداد أنسجة الفك لعلم الأنسجة ، من المستحسن أن تقشر الأنسجة الرخوة المحيطة بالعظام لتحقيق التوجه الصحيح عند إعداد قوالب لعلم الأنسجة. يجب الاحتفاظ بالعينات في وسط رطب خلال العملية بأكملها (من مرحلة الحصاد، من خلال التصوير المقطعي المحوسب الدقيق، حتى إجراء الكتلة النسيجية). عند قطع الأنسجة في ميكروتومي، يجب أن تكون ثابتة زاوية العينة من أجل تحقيق شرائح sagittal من الأسنان. ومن المهم أيضا أن تأخذ في الاعتبار المسائل الأخلاقية المتعلقة برفاه الحيوانات. على سبيل المثال، التخدير السليم أمر بالغ الأهمية أثناء الإجراء (على حد سواء الجهازية والمحلية، انظر25،26). دواء الألم ضروري، وخاصة في الأيام القليلة الأولى بعد الإجراء، ومراقبة الوزن والسلوك، فضلا عن تزويد الحيوانات مع المواد الغذائية اللينة ينبغي تنفيذها. من التجربة السابقة، رد الفعل العام للفئران هو أن تتسامح بشكل جيد الإجراء وأنها لا تظهر الضائقة الشديدة.
يتم النظر في فشل هذه الطريقة في الحالات التي فشل فيها التهاب apical في تشكيل: لا يوجد دليل على ارتشاف العظام في المنطقة المحيطة من الأسنان على التصوير المقطعي المحوسب الصغير، وأنسجة PDL من الأسنان سليمة في تلطيخ النسيج (كما في الشكل5). وتشمل الأسباب المحتملة لعدم تحقيق التهاب الاختلافات العشوائية في سلوك الحيوانات وكذلك التعرض المحدد لكل الحيوانات للبكتيريا. على الرغم من تحقيق نتائج جيدة في التسبب في أمراض اللثة apical باستخدام هذا الأسلوب (على الأقل 85٪ من الحيوانات تظهر ارتشاف العظام)، اتبع البروتوكول عن كثب للحد من أي اختلاف بين العينات. إذا ظهرت على أي فئران علامات الشدة خلال فترة المتابعة، فكر في إزالتها من التجربة لمنع المعاناة. ويمكن المساعدة في اتخاذ قرار القيام بذلك بالنظر إلى فقدان أو زيادة وزن الحيوانات خلال فترة المتابعة. الحيوانات التي تفقد الكثير من الوزن تعاني وينبغي إزالتها. وقد لاحظنا أيضا أن الحيوانات التي تعاني أكثر من غيرها هي تلك التي بدأت التجربة في حالة منخفضة الوزن أو سوء الحالة الصحية. بشكل عام، يجب أن يسفر الإجراء، إذا تم تنفيذه بشكل صحيح، عن نتائج متسقة.
وتجدر الإشارة إلى عدة قيود على هذه التقنية. من المهم أن نلاحظ أن هذا النموذج تم تطويره من أجل دراسة التهاب اللثة apical الناجمة عن التلوث البكتيري ولا يحاكي العديد من الآليات الممكنة الأخرى التي قد تنشأ التهاب اللثة apical، مثل الإصابات الصادمة و مرض التهاب ذاتي. وعلاوة على ذلك، توجد اختلافات كبيرة بين هذا النموذج والحالة السريرية في المرضى البشر. في الفئران ، لم يتم وصف الآفات العفوية حول اللبية وهذا هو تماما حالة اصطناعية. تشريح الأسنان القوارض يختلف أيضا عن ذلك من البشر. أهمية هذه الاختلافات كونها غير معروفة. ومع ذلك، فإن الفأر نموذج مفيد للغاية لفهم الآليات والظواهر الأساسية. وعلاوة على ذلك، لم يتم الإبلاغ حتى الآن عن نموذج شفاء قناة الجذر في الماوس (عن طريق العلاج مع قناة الجذر)، ولكن من المحتمل أن يكون له أهمية كبيرة في هذا المجال من البحوث إذا ثبت أن يكون ممكنا. وقد تم الإبلاغ عن طريقة تغطية اللب للفئران، مما يدل على إمكانات كبيرة27. وقد وضعت في الواقع نموذج شفاء قناة الجذر في الآونة الأخيرة في الفئران, نموذج الحيوان غالبا ما تستخدم في البحوث اللبية28. الطريقة المبلغ عنها هنا يمكن أن تكون بمثابة إجراء أولي لتطوير هذا النموذج شفاء قناة الجذر.
استخدام طريقة في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لدراسة مثل هذا التفاعل المناعي المعقد، ونموذج الماوس، على الرغم من التحدي سريريا بسبب صغر حجم الحيوان، لديه العديد من المزايا: أنها فعالة من حيث التكلفة، وينطوي على مرافق يمكن الوصول إليها بسهولة، ومجموعة من الأدوات الوراثية والجزيئية المتاحة (مثل الضربات الخارجية المتاحة، ومكتبات كريسبر والعديد من البيانات الجينية). هذا النموذج هو الأكثر ملاءمة للبحوث اللبية، كما أنه يحفز العرض السريري AP في ظروف المختبر المعقمة، مع الحد الأدنى من الاختلافات (بدلا من الدراسات السريرية). وعلاوة على ذلك، هذا النموذج له أيضا مزايا في مجالات البحوث الأخرى، مثل التهاب مزمن، وذلك بسبب القدرة على التسبب في التهاب مزمن ولكن المحلية مع الحد الأدنى من المشاركة النظامية، واستخدام الجانب المقابل من نفس الحيوان كعنصر تحكم.
هذا العمل تقارير استخدام التصوير المقطعي المحوسب الجزئي وعلم الأنسجة لتحليل الآفة. ومن المحتمل أن تستخدم أنواع أخرى من التحليلات في هذا النموذج التي لم يتم إجراؤها هنا، مثل عزل الحمض النووي واختبار مثيلة الحمض النووي على جينات مختلفة في الخلايا الالتهابية؛ عزل الحمض النووي الريبي وأداء RNA-seq لرؤية نمط التعبير الجيني في الخلايا المناعية المختلفة أو أنواع مختلفة من الفئران. أو عزل الخلايا ووصفها بـ FACS20و21و29. وبشكل جماعي، هناك إمكانات كبيرة في النموذج المبلغ عنه هنا، والتي نأمل أن يسهلها هذا البروتوكول والبيان العملي المبلغ عنه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه
Acknowledgments
نود أن نعرب عن تقديرنا للدكتور أويد هيمان لمساعدته في تحديد مواقع الحيوانات، ورافاييل ليبر للمساعدة في تحليل التصوير المقطعي المحوسب الصغير، والبروفيسور أنديارا دي روسي دالديغان للحصول على المشورة بشأن تشكيل التجربة مسبقاً. ونود أيضا أن نعرب عن تقديرنا للدكتور سيدني كوهين للقراءة والتحرير النقديين.
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من صندوق الهبات البحثي للدكتور إيزادور إ. كاباكوف إلى عضو الكنيست وIA، وزمالة إسحاق نافون من وزارة العلوم والتكنولوجيا الإسرائيلية إلى شركة EG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
References
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z.
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
