Summary
これらのプロトコルは、皮質レンズの形態を分析するために開発された、固定および生きているレンズにおけるゼブラフィッシュレンズ縫合の構造的完全性、および前後部軸に沿ったゼブラフィッシュレンズ核の位置を測定する。
Abstract
ゼブラフィッシュは、遺伝子操作や生体内イメージングに適しており、逆遺伝子研究や in vivoイメージングのための transgenics の生成において、ますます普及しているモデルとなっています。これらのユニークな機能は、ゼブラフィッシュを眼レンズの開発と生理学を研究する理想的なプラットフォームにします。我々の最近の知見は、アクアポリン-0, Aqp0a は、前眼レンズ縫合の安定性のために必要なだけでなく、加齢に伴うレンズ中心へのレンズ核のシフトのために、ゼブラフィッシュレンズの特性を分析するのに適したツールを開発することに導いた。ここでは、幼虫と成体の両方のレンズに適用することができるレンズ解離の詳細な方法を概説し、組織学的分析、免疫組織化学および画像化のためにそれらを準備する。私たちは、レンズ縫合糸の完全性と皮質細胞の形態の分析に焦点を当て、遺伝子組み換えゼブラフィッシュによって可能になったレンズ形態のin vivoイメージングから得られたデータと解剖レンズから生成されたデータを比較する蛍光マーカーを符号化。軸方向に垂直に切開したレンズの分析により、前後部軸に沿ったレンズ核の相対位置を定量化することができます。初期の前方位置から中心へのレンズ核の移動は、成人ゼブラフィッシュにおける通常のレンズ光学に必要である。したがって、レンズ核位置の定量的測定値は、その光学的特性と直接相関する。
Introduction
ゼブラフィッシュは、哺乳類のレンズとの解剖学的類似のため、レンズ開発と生理学を研究するための優れたモデルであり、遺伝的および薬物操作の相対的な容易さ、胚眼の発達速度、小さなサイズおよび透明性初期段階では in vivoイメージングを可能にする。ここに記述された方法は、sutural 完全性、インビトロおよびインビボにおける皮質膜形態、およびレンズ核位置の位置に焦点を当てた胚性および成体期におけるゼブラフィッシュレンズ形態を分析するために開発した前後部軸ex 生体。これらの手法は、レンズの発達と生理機能に関する研究の開始点として、またゼブラフィッシュにおけるレンズの表現型についての逆遺伝スクリーンを提供する。
ゼブラフィッシュのレンズ形態の画像化
アクアポリン 0 (AQP0) は、最も豊富なレンズ膜タンパク質で、哺乳動物の複数の必須機能により、レンズの開発と明瞭性の両方にとって重要です。ゼブラフィッシュには2つの Aqp0s (Aqp0a と Aqp0b) があり、それらの機能の欠損を胚と成人の両方のレンズで分析する方法を開発しました。私たちの研究では、 aqp0a/-変異体が前縫合線の不安定性による極性の前極性不透明度を発現し、 aqp0a/b二重変異体が核不透明度1を発現していることが明らかになった。AQP0 は、水輸送2において役割を果たすことが示されており、接着性3、4、細胞骨格固定5および屈折率勾配6の生成において、これらの研究は大部分で行われてきたインビトロ。ゼブラフィッシュは、Aqp0a や Aqp0b の機能の低下や摂動機能が、生きている水晶体の形態や機能にどのような影響を与えるかを研究する絶好の機会を提供します。開発中にレンズ細胞の形態および sutural の完全性を評価するために、我々は、胚および成体レンズでの使用のために既存のインビトロ免疫組織化法7を修飾し、そしてインビボでこのプロセスをモニターする transgenics を生成した.
原形質膜構造の免疫組織学的解析と sutural の完全性を、全固定胚と成体レンズで行った。ゼブラフィッシュレンズは、哺乳類と比較して非常に小さく (レンズの直径は約100μ m、成人では 1 mm まで)、公知ではほとんど捕捉されない点縫合線8を有する。したがって、sutural の完全性を分析するためには、全レンズが不可欠です。生体内での前縫合形成、精密レンズ細胞構造のイメージングにおいて、mApple 特異的に標識レンズ膜を発現する transgenics を生成した。
レンズ膜 transgenics のライブイメージングの利点は次のとおりです: 1) 固定アーチファクトの回避、2) タイムラプス映画の動的形態変化の研究、および 3) 以前のイベントを後で相関させることができる縦断的研究を可能にする表現。虹彩の色素沈着は、通常、レンズ周辺の鮮明な撮像を防止する。原基-5 (プリム-5) ステージ9の前に 1-フェニル 2-チオ尿素 (PTU) を添加すると、約4日間 postfertilization (dpf) までのメラニン形成および眼の色素沈着を防止する。しかし、4つの dpf の後、レンズ周辺は、特に古い段階でインビボで不明瞭になる。さらに、レンズ自体の密度は、その後の極の画像化を覆い隠します。したがって、レンズ周辺の形態、または後縫合線を研究するために、4 dpf の後に、レンズを摘出し、固定する必要がある。
トランスジェニックゼブラフィッシュ線は、インビボ10における胚性レンズ膜構造を分析するために使用されてきた。Q01トランスジェニックとは、膜ターゲティング配列に融合したシアン蛍光タンパク質を発現し、Gap43、 EF1αプロモーターおよび hexamer によって駆動される DF4 pax6エンハンサーは、レンズ繊維細胞11に遍在する。Q01は、主な関心がレンズである場合、バックグラウンドシグナルを追加する網膜のアマクリン細胞を含む、余分なレンズを持っています。私たちは、レンズに特に立体的な信号を避けることを目的として、膜連結された mApple を特異的に表現する新しいトランスジェニック線を開発しました。
レンズ nucleus ローカリゼーション
我々は、レンズ核が、幼虫ゼブラフィッシュにおける最初の前方の位置から、成人用レンズの前後部軸の中心位置に移動することを発見した。この高屈折率レンズ核の位置におけるこのシフトは、ゼブラフィッシュレンズ1の正常な開発のための必要条件であると考えられる。レンズの半径に関しては、レンズ核集中化の定量化が可能です。この方法を用いて、Aqp0a がレンズ核中央1に必要であることを示し、この簡便な方法は、ゼブラフィッシュモデルにおけるレンズの発達と生理学の他の研究に応用できる。
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Protocol
本研究で使用される動物プロトコルは、眼科および視覚研究における動物の使用のためのアルヴォステートメントに準拠しており、カリフォルニア大学アーバイン校の動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されています。
1. ゼブラフィッシュの飼育と安楽死
- 標準的な実験室条件12の下でゼブラフィッシュ (AB ひずみ) を上げて維持します。胚培地 (EM)12で胚を上昇させる。0.003% の PTU を 20-24 h postfertilization (プリム-5 段階の前) から EM に添加して、胚期9での画像化に使用される胚12の色素形成を防止した。6-30 日 postfertilization (dpf) から 14 dpf までの食餌で幼虫を上げ、14個の dpf12の後に生きアルテミア。
注意:PTU は非常に有毒 -
タッチに非応答するまで tricaine を使用して麻酔魚。
- 400の3アミノ安息香酸 acidethylester を 2.1 mL の 1 M トリス (tricaine) を 100 mL の ddH2O で組み合わせて準備します。 pH 7.0 に調整し、-20 ° c で保存します。
注意:Tricaine は有毒である。 - タンク水 100 mL の tricaine 株の 4.2 mL を麻酔の幼虫/成人に、または EM を麻酔胚 (0.0165% w/v で tricaine の最終濃度) に希釈した。
- 400の3アミノ安息香酸 acidethylester を 2.1 mL の 1 M トリス (tricaine) を 100 mL の ddH2O で組み合わせて準備します。 pH 7.0 に調整し、-20 ° c で保存します。
2. 胚と幼虫の固定
注:免疫組織化プロトコルは、以前公表された材料7から適応した。
- Dechorionated の胚または幼虫を2週間まで postfertilization に固定し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4%(v/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を4° c で1晩ロッカーに入れます。
注意:PFA は可燃性であり、発癌性です。 - PBS で10分間、胚を3回洗浄し、10% トリトンおよび 1% DMSO (PBS-T) を4° c で一晩 PBS で透過処理した。
注意:DMSO は有毒であり、摂取または皮膚吸収によって有害であり、皮膚を通して有害物質を運び、そして可燃性である。トリトンは有毒、腐食性、水生環境に危険である。
(3) 幼虫と成虫によるゼブラフィッシュレンズの解剖
- 麻酔は、6つの dpf の幼虫から成人期まで tricaine を持ち、接触するまで反応しないが、依然として強い鼓動を示している。ステージング13の場合、シリング (2002) あたりの魚の標準の長さを測定します。
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すぐに、マイクロ解剖はさみを使用して目を切除し、PBS の解剖皿に置きます (大人の目のために示されている図 2 )。
- レンズ解剖用のシリコーンを充填したカスタム 35 mm ディッシュを作成します。シリコーンが設定されると、切除中に成人の目/レンズを固定化するために、切り込みの直径が約 2-3 mm、深さが 0.5 mm になります。
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成人ゼブラフィッシュレンズの解剖
- 成人の目を、PBS で満たされた後側切り込み皿に置く。光学ディスクを通して < 45 °の角度で鉗子を挿入することによって目を固定する。ニックや、レンズを圧縮しないように注意してください。網膜と強膜を通して2つまたは3つの放射状の切開を、視神経乳頭を解剖はさみで毛様域に通してください。
- 花びらのように網膜と強膜をはがし、目を反転させ、角膜側を上にします。このような場合は、ハサミの平面で強膜や角膜の操作によって間接的にレンズを固定し、網膜を引き離し、組織を鉗子で固定します。余分なティッシュをレンズから慎重に切り取ってください。
注:常に健康なレンズを得るためには、慎重に分析することが重要です。
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幼虫ゼブラフィッシュレンズの解剖
- 幼虫目を、PBS で満たされたシリコーン皿の平らな部分の上に置き、鋭利なタングステン針を使用して網膜と強膜を通してラジアルカットを行いながら、別のタングステン針または鉗子で目を固定化する。
注:レンズを傷つけないように注意してください。- ワイヤチップを 10%(w/v) NaOH に懸濁させることにより、0.1 mm タングステンワイヤ電解の 2 cm の長さの先端をシャープにし、低電圧交互電流14を適用する。ブンゼンバーナーを使用してガラス端を溶融させることにより、パスツールのピペットに針を固定します。
注:代替の細かい解剖ツールも使用することができます。
注意:NaOH は腐食性である。
- ワイヤチップを 10%(w/v) NaOH に懸濁させることにより、0.1 mm タングステンワイヤ電解の 2 cm の長さの先端をシャープにし、低電圧交互電流14を適用する。ブンゼンバーナーを使用してガラス端を溶融させることにより、パスツールのピペットに針を固定します。
- 針の鈍い側で解離した目からレンズをやさしくすくい出し、付着した組織を慎重に引き抜きます。
- 幼虫目を、PBS で満たされたシリコーン皿の平らな部分の上に置き、鋭利なタングステン針を使用して網膜と強膜を通してラジアルカットを行いながら、別のタングステン針または鉗子で目を固定化する。
4. 切開したレンズの固定
- 直ちに 1.5%(v/v) PFA 中の切開したレンズを室温 (RT) で24時間 PBS で固定する。PBS でレンズを3回、それぞれ10分間洗浄します。
- 透過処理のための全体のマウント分析または cryoprotect のためのレンズを使用してください (セクション8を見てください)。
- 透過処理は、4° c で一晩 PBS-T でレンズを装着します。
5. レンズ免疫組織化学
- ファロイジン-アレクサ Fluor 546 (1:200) および細胞核でのインキュベーションによる固定胚/幼虫または成人用レンズの標識膜 (1: 1000 5Mg/mL 株) を4° c で一晩 PBS にて培養した。
注意:DAPI は、皮膚及び眼の刺激剤である。 - PBS-T で3回、それぞれ10分間洗浄します。明確な組織を 30% でインキュベートすることにより、各 RT で少なくとも1時間、4° c で 50% および 70% のグリセロールを PBS-T (v/v) で、または一晩で培養する。
- 70% のグリセロールで PBS-T (v/v) をガラス底 35 mm のマイクロウェルディッシュに平らにし、カバースリップに対してまっすぐにすることができます。若い魚のために、わずかな前方側面の傾きはカバースリップに平行であるためにレンズの縫合線を向けるのを助けるかもしれない。
6. ゼブラフィッシュ前レンズ縫合をインビボでトランスジェニック線を用いて分析する
- Tol2 キット15を使用してTg (βB1cry: mAppleCAAX)ラインを生成します。Tol2 転移因子要素システム15は、mApple が発現し得た crystallin 配列によって膜に繋がれたヒトβB1-CAAX プロモーター16の 300 bp によって駆動されるコンストラクトの安定した統合を可能にする特にレンズ繊維細胞膜における。
注:このコンストラクト (ID: 122451) は購入可能です。- 注射の朝に、注入混合物を準備し、氷の上に維持します。DNase を含む10μ l の最終的な容量に達するためには、追加: 1.5 μ l の HuβB1mAppleCAAX:50 ng/μ l-[0.375-0.75 pg/最終注入] で、1.5 μ l の Tol2 トランスポゼース mRNA の 300 ng/μ l (Tol2 kit)15 [15-30 pg/最終注入]、1% w/v でのフェノールレッドインジケータの1μ l [1 x10-5%(w/v)/final インジェクション]。
- 注射混合物の 50-100 pL を1細胞期胚12に注入する。
- 3つの dpf で mApple 陽性レンズで胚の頻度を測定することにより、F0 注入胚の今後効率を測定します。
注:この方法を使用して > 80% の今後効率を期待してください。F0 モザイクは個々の細胞の膜の形態の詳細な分析を可能にする。モザイクの様々なレベルは、1つの細胞の単一または小グループの形態をイメージすることができます, よりグローバルなレンズの表現は、インビボでのレンズ縫合のような多細胞構造の分析を可能にする. - Outcross F0 モザイク魚は、すべての繊維細胞膜にラベルを付け、安定したラインを生成します。細胞系列に統合されたトランスジーンを持つ F0 創始者は、トランスジェニック線として維持することができる安定した統合で子孫を生成します。
7. ゼブラフィッシュ前方レンズ縫合線をインビボで使用しての解析
- 麻酔 3 dpf または成人モザイクまたは安定したトランスジェニック魚と、ガラス底部のマイクロウェルディッシュのカバースリップに対して眼を平らにした tricaine との 1% 低溶融アガロース (LMA) でのマウント。
- 1% の LMA を作るために 100 mL の EM (メチレンブルーなし) に LMA 1 g を溶解させます。4° c で 15 mL のストックとして長期保存してください。各チューブが使用されるまで、マイクロ波はストックを溶解し、42° c で保存します。
- Tricaine の EM が付いている6つの dpf まで魚をカバーする、または LMA が設定されているとき大人のための tricaine が付いているタンク水と。
- PTU 処理された魚を画像化する場合は、250μ l の tricaine ストックおよび7μ l のメチレンブルーまたはタンク水なしで 5 mL の EM を混合してください。
8. レンズ Cryosectioning および免疫組織化学
- Cryoprotect 固定された胚または大人のレンズは、PBS (w/v) で 10% スクロースに配置することにより、RT (または4° c で一晩) で1時間、4° c で 30% ショ糖において 20% のスクロースを有する。
- 10月にベースモールドにティッシュを埋め込み、12-14 μ m で OCT Cryosection でチャックに固定し、Superfrost/プラス顕微鏡スライド上に集めます。スライドに10分間の暖かいセクションは ~ 35 ° c の prewarmed になります。
- 各セクションを PBS で3回洗浄し、それぞれ10分間使用します。ファロイジン小麦粉 546 (1:200) と DAPI (1: 1000) または WGA-アレクサ小麦粉 594 (1:200) を用いて、3つの PBS 洗浄を行い、ラベルセクション。アンチフェードマウント媒体でマウントし、マニキュアでシールカバースリップ。
9. イメージング
- 共焦点顕微鏡で画像を取得する。60x N/A 1.2 を使用して z スタックまたは光学スライスを取得する水浸対物レンズ、または類似の、前方から後方の水晶柱までの特定の領域で。次の取得設定を使用します。1.2 のエアリーディスク 561 nm レーザーを使用して、テキサス州の赤いフィルターファロイジンの小麦粉546か mApple、または DAPI のための紫外線フィルターが付いている405レーザー。
- レンズに奥行きのある信号損失を打ち消すために、z 強度のレーザーパワーを補正します。これは固定および生きている3つの dpf の胚の後部の棒で強い信号および大人の魚レンズの赤道の光学スライスの強い信号を可能にする。
- 画像処理ソフトウェアを使用して画像をコンパイルして表示します。
10. 前後部軸におけるレンズ核局在の測定
- チェンバー底を有する 35 mm ディッシュで PBS の軸方向に新しく摘出したレンズは、焦点面に平行な極と縫合線を有する。レンズの核を識別するために、レンズの皮質とレンズの核の界面で通常発生する屈折率の違いを探します。
注:健康な野生型の成人用レンズは非常に透明であり、レンズの縫合や核の確認、またはレンズの向きの決定が困難です。このケースでは、レンズカプセルに鉗子を持つわずかなニックは、小さな損傷を引き起こし、縫合糸とレンズの核の明らかに約10分で、この測定のためのレンズの向きを助けます。しかし、現在は損傷しているため、ダウンストリームアプリケーションではレンズが使用できなくなります。 - カメラが取り付けられた解剖顕微鏡を使用して、DIC 光学系の有無にかかわらず明るいフィールド照明の下でレンズの核とレンズの画像を撮影します。キャリブレーションのために同じ倍率でマイクロメーターをイメージします。
- [ライブビュー] ボタンをクリックし、露出設定を調整してレンズの核とレンズ周辺部を視覚化し、[スナップショット] ボタンをクリックして画像を撮影します。Tif ファイルとして保存します。
- 画像処理ソフトウェアを使用して、取得したレンズ画像をキャリブレーションします。直線ツールを選択し、マイクロメータ画像に既知の長さの線を引き、[解析] をクリックします。 |スケールを設定します。[既知の距離]、[単位] を入力し、[グローバル] キャリブレーションを選択し、[ok] をクリックします。
- レンズ核の中心と前極 (a − r) との距離を測定する。
- 画像処理ソフトウェアの直線ツールを使用して、レンズ核のイメージされた中心を軸方向に線を描画します。この線の中心をレンズ核の中心としてください。
- レンズの前極にこの点から別の線を描画し、距離を測定するために、「分析」メニューで「測定」を選択します (a-r)、 aはレンズの半径、 rはレンズの中心からの中心までの距離核。
- 前方から後極に別の線を引き、この距離をレンズの直径 (2a) として測定します。[結果] ウィンドウからこれらの長さをコピーし、スプレッドシートまたは統計プログラムに転送します。
注:核の中心から前方の極まで、レンズの核の中心からレンズの中心まで正確に測定する方が簡単です。この測定は、ステップ10.3.5 の式によって変換され、レンズの核の中心とレンズの中心との距離を報告する。胚核が明らかであっても、常に成体の核を測定に使用してください。 - 直径を2で割り、レンズ半径を計算し、 a.
- R/aを計算し
、レンズ半径に対してレンズ核の局在化を行う。
注: 前極の近くに配置された原子核の場合、 r/aは > 0.0 になり、中央に局在する原子核のr/aは0.0 になります。
- 標準的な長さの関数として正規化された軸核測定の対数をグラフ化して、ゼブラフィッシュ開発時の水晶体局在の変化を決定します。
、レンズ半径に対してレンズ核の局在化を行う。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
成人ゼブラフィッシュアイ解剖は、哺乳動物のものとよく似ている (図 1a)。ゼブラフィッシュと哺乳動物の眼との間のいくつかの相違にもかかわらず、毛様体17の代わりに毛様帯を有するような、光学的性質18の違い、および胚発生19時の形態形成の違い、ゼブラフィッシュアイは、眼の発達を研究し、眼科疾患20、21、22を理解するための優れたモデルである。水晶体の前極である単純上皮は、赤道において寿命の長い増殖、伸長、繊維細胞への分化の過程を経て、レンズの大部分を構成する。成熟した繊維細胞 (図 1b、水色) は、最初に胚に分化し、オルガネラを欠いており、置換されない。識別の繊維の細胞の先端は前部および後部の縫合を形作るために棒で会う。これらの細胞は、その後、新たに分化した繊維細胞によって内在化される。すべての脊椎動物のレンズと同様に、ゼブラフィッシュレンズは、レンズの核の中心に位置する最も古い細胞と開発の勾配を持っています。ゼブラフィッシュレンズ placode は postfertilization (hpf) で形成され、18本の hpf で一次水晶体繊維を形成し、2次繊維は 28-36 hpf の移行帯を形成しています。後部の縫合線は 48 hpf で目に見え、前方の縫合線が目に見えるようになる前に10。
標準レンズアーキテクチャの正確な開発とメンテナンスは、その光学に不可欠です。ここでは、2つのゼブラフィッシュ Aqp0s の機能喪失変異体から生じる表現型を解析するために開発した、利点と限界の両方を含むインビトロおよび in vivoにおけるゼブラフィッシュレンズ細胞形態の分析方法について述べる。Aqp0a と Aqp0b1.インビトロでの成人のレンズ形態の評価のために、レンズを解剖し (図 2)、直ちに固定した。胚性評価は全固定胚において行われ (図 3)、生トランスジェニック胚と比較した (図 4)。成人用レンズを解剖した、および固定した (図 5)、生像したトランスジェニック成人用レンズと比較した (図 6)。これらの方法を用いてレンズの特定部分の検出と可視化の違いをまとめました (表 1)。
ファロイジンは、小麦胚芽凝集素 (WGA) と比較して、ゼブラフィッシュにおけるレンズ細胞膜の標識に優れていることが判明した。WGA は、N-アセチル-D-グルコサミンとシアル酸に結合するレクチンであり、蛍光色素に結合した WGA は、ヒト23、ウシ24、ヒツジ25、マウス26、ラット27での標識レンズ細胞膜に通常使用されゼブラフィッシュ28、29。ここでは、ゼブラフィッシュレンズ全体にファロイジンを使用しています (図 3、図 5)。
胚および幼虫のゼブラフィッシュは、最大7つの dpf が、レンズ外皮にファロイジンの浸透を可能にするほど小さく透過性がある。3つの dpf レンズの核は密集して、細胞小器官を欠いている、前の棒の前の縫合線の形態 (図 3a、B)、およびファロイジンは赤道光学面の水晶体から除かれる (図 3c、D)。ファロイジンは、繊維細胞膜の高い圧密のために核から除外される可能性があり、以前の研究28と一致した。しかしながら、外皮はこの染色を用いて非常に詳細に可視化される (図 3c−F)。断面において、繊維細胞は平坦な六角形になり、より広い側面を持ち、狭い側面が短くなります。ファロイジンは、狭くて広い繊維細胞膜 (図 3e-F) の両方を強く標識し、広い側面の間の皮質繊維細胞の圧迫を強調する。この組織は、 aqp0a/b二重変異体 (図 3b、 D、 FおよびH) ではほとんど影響を受けません。
導入遺伝子のモザイク発現 (ヒトβB1 crystallin プロモーターの 300 bp プロモーター領域によって駆動される CAAX モチーフによって細胞膜に繋がれた mApple) は、2 dpf で始まるレンズで強く表現する。導入遺伝子は、mApple の多様な発現をもたらすゲノムに無作為的に統合される。皮質に強い発現を持つ3つの dpf レンズの例 (図 4) と核の部分での発現を示します (図 4d)。膜マーカーはファロイジンのような透磁率によって制限されないため、レンズの核にラベルを付けます。細胞の小さなサブセットでのみ発現されている DNA 注射によって生成されるモザイク (図 4) は、βB1 crystallin を表すすべての細胞にラベルを付ける安定した線と比較して、個々の細胞形態を分析するのに役立ちます (図 6)。Tg (βB1cry: mAppleCAAX)のモザイクで前方の縫合線の形態は前部棒で取られる z 突起で視覚化することができる (図 4a、B)。細胞膜の形態は、ファロイジン (図 3a,B) で標識された固定レンズとは異なること、および広範な細胞膜におけるサブドメインの存在 (図 4a「白色矢印) は、以前に他からのレンズで識別種30が見える。しかし、狭い繊維細胞膜の標識が弱くなると、ファロイジンで標識された固定レンズに見られる前方縫合線 (図 4a、b矢印) での細胞の顕著な収束を見ることができなくなります (図 3a、b矢印)。
興味深いことに、レンズの赤道で撮影された光学スライスはまた、WT (図 4c-F) と比較して、 aqp0a/b二重変異体における細胞体積への明らかな混乱と、異なるラベリングパターンを明らかにする。これはおそらく、ファロイジンよりも広い繊維細胞膜をより効果的に標識する。後極を通して z 突起を取得し、Z 補正を使用して後縫合線の完全性を分析し、深さのあるレーザーパワーを組織に増加させることができました。無傷の魚における後縫合 (図 4g、H) の明確な分析は、最初の5つの dpf に限定され、そしてその後レンズが緻密すぎると、レンズの後部部分におけるシグナルの喪失をもたらす。
ファロイジンで標識した固定解剖された成人用レンズは、前方縫合糸を形成するために収束した繊維細胞列の高度に秩序づけたアーキテクチャにおいて顕著な詳細を明らかにした (図5a、矢印) および皮質の形態ファロイジンによって狭い繊維細胞の膜の非常に強い標識が原因で。前極の最大 Z-突起は、 aqp0a/b二重突然変異体レンズ (図 5b、矢印) に比べて、膜および細胞核の塊として明らかな、WT (図 5a、矢印) における堅い前方縫合線の損失を明らかにした前極から30μ m のスライス (図 5d)。より深い光学スライスでは、ファロイジン標識は、より深いレンズ皮質および核から除外された (図 5e、F)。外皮の繊維の細胞の列の全面的な組織はaqp0a/bの二重突然変異レンズの堅い前方の縫合線の欠乏によって幾分影響を受け、イメージ投射平面に正確に直角にレンズを置くことを不可能にさせた (図5f) を WT レンズと比較した (図 5e)。しかしながら、赤道面で撮影された繊維細胞列の高出力画像は、外側の皮質の細胞が、依然として整然とした行を形成していることを明らかにした (図 5g、H)。そのタイトな圧縮、および弱い信号の組み合わせに起因する個々の繊維細胞の広い膜を識別することは不可能であった。これらのレンズが解剖されたので、それらは、目的に面した後側に装着することができ、後縫合の z −突起を可能にし、遺伝子型間に差異を示さなかった後部繊維細胞の先端がタイトな縫合糸を形成した (図5I、J矢印)。
生きて麻酔をかけた成人安定Tg (βB1cry: mAppleCAAX)魚類のレンズの Z 突起は、前皮質における皮質膜形態 (図 6a、a ')、ならびに前極での細胞収束の程度を明らかにする (図 6B)。固定解剖されたレンズと比較して、撮像面に垂直なレンズ縫合糸で魚を取り付けることはより困難であった。レンズ核における導入遺伝子発現 mApple を担持した安定ライン (図 6c、D)。赤道での光学スライスは、前皮質と同じレーザーパワーで撮像されたときに核の広範な圧縮を示す強い信号を明らかにした (図 6c).興味深いことに、胚の場合とは異なり、外皮質の細胞分解能は成人では明らかではなかった。これは、虹彩がレンズ周辺からの明瞭な信号を遮断しているためであると考えられる。画像化する前に瞳孔の拡張によってより強いレンズ皮質信号を得ることが可能であり得る。レーザーパワーを低下させて、レンズ核内のいくつかの細胞層を区別することができた (図 6d)。大人のゼブラフィッシュレンズは非常に密であり、インビボで後方の極からのシグナルを得ることは不可能であった。
ゼブラフィッシュレンズ核は、幼虫レンズにおける初期の前方の位置から、成人1の中心位置まで光軸で動くことが示されている。これらの動きは軸レンズのセクションで、ファロイジンおよび WGA がレンズの核から除外されるので強調される (図 7A-C)。この集中化プロセス1には Aqp0a が必要であることが示されていますが、このメカニズムは他のタンパク質の影響を受ける可能性があります。レンズ核の中心が前後部軸に沿った位置に関連していることを測定し、DIC 照明下での軸方向と結像にレンズ全体を解剖し、屈折特性 (図 7e)。縫合糸は、通常、周囲の皮質とは異なる屈折率を有するので、配向のためのガイドとして使用することができる。若い幼虫レンズは、より明白な縫合 (非常に若いレンズの後縫合) を持ち、異なる屈折率を有する水晶体核は明らかに非対称であり、これらの段階でレンズを配向させるのが容易になります。レンズの中心から核の中心までの相対距離 (r) は、レンズ半径 (a) に対して正規化される。これをゼブラフィッシュの開発との関係でグラフ化し、標準的な長さの測定を13に使用します。WT では、レンズの核は前のレンズのポール
の近くから始まり、 
成人期には集中します (図 7f)。
図 1: ゼブラフィッシュアダルトアイとレンズ図。前方は光が目に入ると、ゼブラフィッシュでは実際には横になるように撮影されます。(A) ゼブラフィッシュレンズと角膜が網膜上に焦点を合わせる。水生動物において、角膜は軽い屈折においてマイナーな役割を果たすが、その代わりに、レンズはより高い屈折率18を有する。レンズは、水硝子のユーモアで満たされた水性のユーモアと後部のチャンバで満たされた前房を分離します。(B) ゼブラフィッシュレンズは哺乳動物レンズよりも球状である。繊維細胞先端は、前方および後方の極で点または臍縫合線8で会合する。レンズ皮質の分化した繊維細胞には核やオルガネラがあり、一方で、水晶体の核 (水色) の成熟した繊維細胞はオルガネラや核を欠いています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ゼブラフィッシュレンズ解剖。(A) 目は、魚に麻酔をかけてから解剖され、後側に置かれる (B)。(C) 眼は、光学ディスク (od) を介して鉗子によって固定化され、2〜3本の放射状の切開部は、オプティックディスクから zonules に網膜および強膜で作られる。(D) フラップを折りたたんで、レンズを露出させる。(E) 角膜を上に向けて眼を回転させ、角膜を通して間接的にレンズを固定し、強膜網膜を引っ張る。(F) レンズから残りの網膜および毛様ゾーン/zonules を離れてトリムする。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:インビトロでの胚性レンズ形態。ファロイジン (赤色) で標識された胚および透過性 (青色) の細胞核は、膜形態と極での縫合の完全性を明らかにする。Z 突起は、WT およびaqp0/b倍変異型レンズが、3つの Dpf (a, b) で非常にタイトな前方縫合糸 (矢印) で会合する非常に規則的な繊維細胞配列を示すことを明らかにする。赤道で撮影した光学スライスは、両方の遺伝子型 (C-F) で外側皮質に充填された六角形の繊維細胞のタイトな行を明らかにする。(E) に示すように、繊維細胞膜の狭くて広い側面は、標識されている。後縫合 (矢印) は両方の遺伝子型 (G, H) で形成され、きつくなっている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:インビボにおける胚性レンズ形態。麻酔をかけた3つの dpf モザイクの F0 注入されたTg (βB1cry: mAppleCAAX)のレンズは z 突起 (a、B) の前方の縫合線 (矢) を明らかにする。(a ')膜サブドメインは、広範な繊維細胞膜において尚 (白色矢印) として明らかである。狭光繊維細胞膜もまた明白である (黒色矢印)。WT レンズは、 aqp0a/b二重突然変異体の破壊された皮質と比較して、しっかりと詰まったレンズ皮質繊維細胞 (C、E) を明らかにします-明らかに腫れた細胞 (D、F)。後部 (g、h) 縫合に焦点を当てた (矢印) は、遺伝子型 (g、h) の間に違いがないことを明らかにする。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:インビトロでの成人のレンズ形態。摘出し、23 mm 標準長以上の魚からの固定レンズと透過性を、ファロイジン (赤) 及び DAPI (青) で標識した。150μ m の前極での Z-突起は、WT (a) のタイトな縫合糸 (矢印) で収束する繊維細胞チップの厳密な配置を明らかにするが、 aqp0a/b二重変異体 (矢印) ではなく、膜および核の質量を有する (b)。前極から42μ m 撮影した光学スライスは、WT (C) で中心に収束した順序の細胞を明らかにするが、縫合糸が変異レンズ (D) にあるべき核の質量を示す。レンズの赤道を通る光学スライスは、前極から130μ m で、WT (E、G) および変異体 (F、H) 中の繊維細胞の密にパックされた列を明らかにする。後縫合 (矢印) は両方の遺伝子型 (I、J) で形成され、タイトである。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6インビボにおける成人のレンズ形態。麻酔をかけた成人安定Tg (βB1cry: mAppleCAAX) WT レンズのライブイメージング。前の皮質の Z 突起は皮層の形態 (a、a ') および前方の縫合線 (矢) を明らかにし、細胞は単一の光学スライス (B、矢) のポイントに収束する。この皮質は、レンズの核となる強いシグナル (D) と比較して、赤道 (C) を通る光学スライス中のより高いレーザーパワーで可視化することができる。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7:ゼブラフィッシュレンズ核中央集権。固定および cryoprotected した胚 (A) およびレンズ (B、c) は、軸上にファロイジン-546 ( a、b)、DAPI ( a、b)、または WGA-594 ( Cにおいて赤色) で標識した。レンズ核は、細胞核を欠くものであり、前眼 (a) レンズの3つの dpf (a) と、1ヶ月の古いレンズ (B) の中央に置かれた成人用レンズ (C) に近い位置に置かれます。1ヶ月前のゼブラフィッシュから 4.1 mm の標準長さのレンズを切開し、equatorially (D)、または軸方向 (E) を配向した。軸におけるレンズ核の相対局在は、以下の戦略を用いて計算した:(E) レンズ核の中心 (*) の距離 (白の点線) を測定するよりも実用的なものとして、前極まで測定した。レンズの中心 (プラス) への距離 (r)。これを軸 (intially) レンズ径として測定したレンズ半径 (a) に対して標準化した。正規化された軸核局在の対数を、ゼブラフィッシュ開発の関数としてグラフ化し、標準長さ (F) で測定した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 機能 | IHC 胚 | Tg胚 | 全 IHC 成人用レンズ | Tg大人 |
| ライブ | N | Y | N | Y |
| 前部縫合 | Y | なんとか | Y | なんとか |
| 後部縫合 | Y | Y | Y | N |
| 皮質細胞の詳細 | なんとか | Y | Y | やや前方 |
| レンズの核の詳細 | N | Y (安定版) | N | Y (安定版) |
| 二次ラベル | Y-抗体 | Tg だけで生きる | Y-抗体 | Tg だけで生きる |
| ブロード/ナローファイバーラベル | 両方とも | 広い | ほとんど狭い | 広い |
表 1:中での比較の概要とゼブラフィッシュのレンズ形態の分析のための in vitro法Y = はい、N = いいえ
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Discussion
ゼブラフィッシュレンズ形態の分析は、変異体における表現型、または眼レンズの生物学を研究することを目的とする薬理学的介入の効果を理解する上での最初のステップである。レンズ縫合、皮質繊維細胞の形態、レンズ核の側面を分析する方法を概説します。これらのアプローチは、インビトロおよびインビボでの組み合わせである (表1 に比べた)。インビトロの方法は外の皮質の細胞形態のより大きい細部を、また大人レンズの後部縫合線へのアクセスを可能にする。
In Vivo での分析は、トランスジェニックマーカーを使用して可能である。ここで紹介する導入遺伝子は、レンズ膜特異的であり、既存のQ01ゼブラフィッシュラインと比較して、レンズ膜にラベルを付けながら、アマクリン細胞を含む他の細胞タイプを眼内にも標識し、解釈を複雑にする。.In vivoのシグナルは、胚発生の2日目に形成される眼の色素上皮によって制限されるので、胚はこの後の段階で分析のために PTU に処理される必要がある。成人では、虹彩は、水晶体の透明な分析を覆い隠しているが、前眼レンズ皮質の in vivo での分析を可能にする。魚レンズのライブイメージングは、同じ動物のレンズ形態の縦断的研究を可能にします。これは、浸透性または薬理学的摂動に応答した細胞体積破壊などの動的プロセスに対する効果を研究するための非常に有用なツールとなり得る。予想外の発見は、生きた幼虫 transgenics では広い繊維細胞膜の膜サブドメインを明確に視覚化できるが、固定レンズでは可視化できないことである。これは、導入遺伝子およびファロイジンによるラベリングの違いだけでなく、これらのサブドメインが固定プロセスによって影響を受ける可能性があるという事実を強調しています。
レンズ核集中化の分子機構の解析我々が述べる方法を用いて、レンズ光学特性の発達に不可欠なメカニズムを明らかにすることができる。現在まで、軸レンズの核非対称はゼブラフィッシュでしか報告されていませんが、このプロセスを研究することで、他の種のレンズ光学系の開発に必要なメカニズムについての洞察を得ることができるでしょう。将来的には、トランスジェニック動物を、過剰発現試験などの他の用途と組み合わせて、緑色の今後マーカーを使用して使用することができる。これらは、レンズ内の特定のタンパク質を過剰発現するか、既存の変異体の表現型の救出の効果を研究するために使用することができます。
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Disclosures
開示はございません。
Acknowledgments
私たちは資金源を確認したいと思います: ゲーリングの NIH R01 EY05661、 aqp0a/bの二重変異体とゼブラフィッシュの畜産の生成を支援するためのイネス博士は、Dranow の生成につながる議論のためにダニエル・ transgenics 医師、ブルース博士ブルンバーグと博士の解剖顕微鏡の使用のための研究所とメガン・スミス博士は、統計分析の助けを借りています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21 °C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont #5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION - toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T.
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
- Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
