Summary
이러한 프로토콜은 피 질 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 고정 및 라이브 렌즈에서 제 브라 피시 렌즈 봉합 사의 구조적 완전성을 측정 하 고, 전방 후부 축을 따라 제 브라 피시 렌즈 핵의 위치를 측정할 수 있다.
Abstract
Zebrafish는 유전 조작 및 생체 내 이미징에 유일 하 게 적합 하며 역 유전 연구와 생체 내 이미징에 대 한 transgenics 생성을 위한 점점 더 인기 있는 모델입니다. 이러한 독특한 기능은 제 브라 피시 안구 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 이상적인 플랫폼을 만든다. 우리의 최근 발견 된 아쿠아 포린-0, Aqp0a, 전방 렌즈의 안정성을 위해 요구 되는 봉합 사, 뿐만 아니라 렌즈 핵의 시프트에 대 한 렌즈 중심을 나이에 우리는 zebrafish 렌즈의 특성을 분석 하는 데 특히 적합 한 도구를 개발 하기 위해 우리를 이끌었다. 여기에서 우리는 조직 학적 분석, 면역 조직 화학 및 이미징을 위해 준비 하기 위해 애벌레 및 성인용 렌즈 모두에 적용 할 수 있는 렌즈 해 부에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 우리는 렌즈 봉합 사 무결성 및 대뇌 피 질의 세포 형태학의 분석에 집중 하 고 유전적으로 새로운 형질 전환 zebrafish 라인에 의해 가능 하 게 만든 렌즈 형태학의 생체 내 이미징에서 얻은 데이터로 해 부 렌즈에서 생성 된 데이터를 비교 인코딩된 형광 표식입니다. 광 축에 수직인 해 부 렌즈의 분석을 통해 전방 후부 축을 따라 렌즈 핵의 상대적인 위치를 정량화 할 수 있습니다. 렌즈 핵을 초기 전방 위치에서 중심으로 이동 하는 것은 성인 제 브라 피시의 일반 렌즈 광학에 필요 합니다. 따라서, 렌즈 핵 위치를 정량적으로 측정 하는 것은 광학적 특성과 직접적으로 관련이 있습니다.
Introduction
제 브라 피쉬는 포유류 렌즈에 대 한 해부학 적 유사성, 유전 및 약리 조작의 상대적인 용이성, 배아 눈 발달 속도, 작은 크기 및 투명성으로 인해 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 훌륭한 모델입니다 초기 단계에서 생체 내 이미징에 대 한 허용. 여기에 설명 된 방법은 조직 무결성에 초점을 맞춘 배아 및 성인 단계에서 zebrafish 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 체 외 및 생체내에서의 대뇌 피 질 막 형태학 및 렌즈 핵 위치의 위치 전방-후부 축 ex 생체 내. 이러한 방법은 렌즈 개발 및 생리학의 기능적 연구를 위한 출발점으로 서, zebrafish의 렌즈 표현 형에 대 한 역 유전 화면 역할을 합니다.
이미징 제 브라 피시 렌즈 형태학
아쿠아 포린 0(AQP0)은 가장 풍부한 렌즈 멤브레인 단백질 이며 포유류의 여러 필수 기능으로 인해 렌즈 개발과 선명도 모두에 중요 합니다. 제 브라 피쉬는 두 개의 Aqp0s (Aqp0a 및 Aqp0b)를가지고 있으며 배아 및 성인 렌즈 모두에서 기능 상실을 분석 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 연구 결과에 따르면aqp0a-/-돌연변이 체는 전방 봉합 사의 불안정성으로 인해 전방 극성 불투명도를 개발 하 고 aqp0a/b 이중 돌연변이는 핵 불투명도1을 개발 합니다. AQP0는 물 수송2, 접착 력3,4, 세포 골격 고정5 및 굴절률 구배6의 생성에서 역할을 하는 것으로 알려져 있으 나 이러한 연구는 크게 시험관. 제 브라 피쉬는 살아있는 렌즈의 형태와 기능에 영향을 미치는 기능 상실 또는 Aqp0a 또는 Aqp0b의 교란 기능에 대해 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공 합니다. 개발 중에 렌즈 셀 형태학 및 조직 무결성을 평가 하기 위해, 우리는 배아 및 성인 렌즈에 사용 하기 위한 시험관 내 면역 세포 화학적 방법7 을 수정 하 고, 생체 내에서이 과정을 모니터링 하기 위해 트랜스 젠 시를 생성 .
면역 조직 화학적 분석은 혈장 막의 구조 및 수 중 무결성을 전체 고정 배아 및 성인 렌즈에서 수행 하였다. 제 브라 피시 렌즈는 매우 작은 (렌즈 직경은 태아에서 ~ 100 µm 및 성인에서 1 mm까지) 그들의 포유류 대조 군과 비교 하 여 점 봉합 사 (8)가 자주 저온 단면에서 포착 됩니다. 따라서 전체 렌즈는 조직 무결성을 분석 하는 데 필수적입니다. 전방 봉합 사 형성 및 정밀한 렌즈 셀 구조의 이미징에 대 한 생체 내 분석을 위해, 우리는 특히 렌즈 멤브레인을 라벨링 mapple을 표현 transgenics를 생성 했습니다.
렌즈 멤브레인 트랜스 젠 시의 라이브 이미징의 장점: 1) 고정 아티팩트를 피하고, 2) 타임 랩 스 영화의 동적 형태학 적 변화를 연구 하 고, 3) 이전 이벤트를 나중에 상호 연관 시킬 수 있는 종단 연구 활성화 고기. 홍 채의 색소 침착은 일반적으로 렌즈 주변부의 선명한 이미징을 방지 합니다. 1-페 닐 2 티 오 요소 (PTU)의 첨가 전에 프리모 르 디 아-5(프림) 단계9 는 멜 라 닌 생성 및 눈 색소 침착을 약 4 일 후에 (dpf)까지 방지 한다. 그러나 4 dpf 이후, 렌즈 주변부는 생체 내, 특히 구형 단계에서 가려집니다. 또한 렌즈 자체의 밀도는 후방 극의 이미징을 모호 하 게 합니다. 따라서 렌즈 주변부의 형태학을 연구 하거나 후부 봉합을 하 여 4 dpf 후에 렌즈를 절제 하 고 고정 시켜야 합니다.
제 브라이 선 형질 전환 체는 생체 내10 의배아 렌즈 막 구조를 분석 하는데 사용 되어 왔다. 상기 Q01 형질 전환 체는 렌즈 섬유 세포 (11)에서 DF4 pax6 증강 요소 ubiquitously의 EF1α 프로모터 및 hexamer에 의해 구동 되는 , Gap43의 멤브레인 표적화 서 열에 융합 된 시안 형광 단백질을 표현 한다. Q01 에는 망막의 무 축 삭 세포를 포함 한 추가적인 렌즈 표현이 있어 주요 관심사 인 경우 배경 신호를 추가 합니다. 우리는 여분의 렌즈 모양 신호를 피하는 것을 목표로 하 여 렌즈에 특별히 멤브레인 테더를 표현 하는 새로운 트랜스 제 닉 라인을 개발 했습니다.
렌즈 핵 현지화
우리는 렌즈 핵이 애벌레 zebrafish의 초기 전방 위치에서 성인 렌즈의 전방 후부 축의 중앙 위치로 이동 한다는 것을 발견 했습니다. 이러한 고 굴절 렌즈 핵의 위치 변화는 제 브라 피시 렌즈 광학1의 정상적인 발달에 요구 되는 것으로 생각 된다. 우리의 방법은 렌즈 반경과 관련 하 여 렌즈 핵 중앙 집중화를 정량화 할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 Aqp0a가 렌즈 핵 중앙 집중화1에 필요 하다는 것을 보여 주었고,이 간단한 방법은 제 브라 피쉬 모델에서의 렌즈 및이의 광학 특성의 발달 및 생리학에 대 한 다른 연구에도 적용 될 수 있다.
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Protocol
이 연구에서 사용 되는 동물 프로토콜은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대 한 ARVO 문을 준수 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 캘리포니아 대학의 어바인.
1. 제 브라 생선 축산 및 안락사
- 표준 실험실 조건에서 제 브라 피시 (AB 스트레인)를 올리고 유지 합니다12. 배아 배지 (EM)12에서 배아를 올립니다. 0.003% PTU를 20-24에서 EM에 추가 합니다 (프림-5 단계 이전) 배아에서 색소 형성을 방지 하기 위해 배아12 단계에서 이미징에 사용됩니다. 14 dpf까지 라이브로 티파이의 식단에 6-30 일 후에 (dpf)에서 애벌레를 인상 하 고, 14 d f f12후에 artemia를 살고 있습니다.
주의: PTU는 매우 독성이 있습니다. -
터치에 응답 하지 때까지 트리 네이 어를 사용 하 여 생선 마 취.
- 400 mg의 3-아미노 벤조산 산 데이 티 레스터의 2.1 mL를 사용 하 여 트리 네 스톡을 준비 하 고 ddH2의 100 Ml에 ph 7.0에 적응 하 여-20°c에서 보관 하십시오.
주의: 트리 레인은 독성이 있습니다. - 유 충/성인 또는 EM의 태아 마 취에 대 한 (0.0165%에서 트리 네이의 최종 농도)에 있는 탱크 물 100 mL의 트리 네 스 스톡 4.2 mL를 희석 한다.
- 400 mg의 3-아미노 벤조산 산 데이 티 레스터의 2.1 mL를 사용 하 여 트리 네 스톡을 준비 하 고 ddH2의 100 Ml에 ph 7.0에 적응 하 여-20°c에서 보관 하십시오.
2. 배아 및 애벌레의 고정
참고: 면역 조직 화학 프로토콜은 이전에 출판 된 물질7로부터 적응 시켰다.
- Dechorated 배아 또는 유 충을 로커에서 4 ° c에서 하룻밤 동안 인산 완충 식 염 수 (PBS)에서 4%의 파라 포름알데히드 (PFA)에서 2 주 후에 수정 합니다.
주의: PFA는 가연성 이며 발암 성입니다. - PBS에서 10 분 동안 배아를 3 회 세척 하 고 4°c에서 10% 트리톤 및 1% DMSO (PBS-T)로 투과 합니다.
주의: DMSO는 독성, 섭취 또는 피부 흡수에 의해 유해, 피부를 통해 유해 물질을 운반 하 고, 가연성 이다. 트리톤은 독성, 부식성 및 수생 환경에 유해 하다.
3. Larval과 성인 제 브라 피쉬 렌즈의 해 부
- 6 dpf 애벌레에서 물고기를 삼으 며 터치에 응답 할 때까지 하지만 여전히 강한 심장 박동을 보여주는 생선 마 취. 준비13에 대 한 쉴 링 (2002)에 따라 생선 표준 길이 측정 합니다.
-
미세 해 부가 위를 사용 하 여 즉시 눈을 소비 하 고 PBS에 하 절 접시에 넣습니다 (그림 2 는 성인 눈을 위해 표시 됨).
- 렌즈 디스 섹션에 대 한 실리콘으로 채워진 사용자 정의 35 mm 접시를 확인 합니다. 실리콘이 설정 되 면, 해 부 동안 성인 눈/렌즈를 고 정화 하기 위해 깊은 직경 2-3 mm 및 0.5 mm 주위에 디벗을 소비 한다.
-
성인 제 브라 피시 렌즈의 해 부
- 성인 눈을 PBS로 채워진 다이 버 후부의 접시에 올려 놓으십시오. 광학 디스크를 통해 < 45 ° 각도로 집게를 삽입 하 여 눈을 움직이지 않게 합니다. 렌즈를 닉 이나 압축 하지 않도록 주의 하십시오. 해 부가 위를 가진 모양 체 구역에 광학 디스크에서 망막과 공 막를 통해 2 개 또는 3 개의 반경 절 개를 만드십시오.
- 꽃 꽃잎 처럼 망막과 공 막를 벗 겨 눈, 각 막 측면을 뒤집습니다. 망막과 집게로 조직을 멀리 당기는 동안가 위 평평한 쪽으로 공 막 및 각 막의 조작을 통해 간접적으로 렌즈를 고정 시킵니다. 조심 스럽게 렌즈에서 여분의 조직을 손질.
참고: 지속적으로 건강 한 렌즈를 얻기 위해 신중 하 게 분해 하는 것이 중요 합니다.
-
애벌레 제 브라 피시 렌즈의 해 부
- PBS로 채워진 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후부를 올려 놓고 날카로운 텅스텐 바늘을 사용 하 여 망막과 공 막를 통해 방사형 절단을 하 고 다른 텅스텐 바늘 또는 집게로 눈을 움직이지 않게 합니다.
참고: 렌즈가 손상 되지 않도록 주의 하십시오.- 와이어 팁을 10(/w) NaOH로 중단 하 고 저전압 교류14를 적용 하 여 2cm 길이의 0.1 mm 텅스텐 와이어의 끝을 선명 하 게 합니다. 분 젠 버너를 사용 하 여 유리 끝을 녹여 파스퇴르 피 펫에 바늘을 고정 하십시오.
참고: 대체 미세 해 부 도구를 사용할 수도 있습니다.
주의: NaOH는 부식성입니다.
- 와이어 팁을 10(/w) NaOH로 중단 하 고 저전압 교류14를 적용 하 여 2cm 길이의 0.1 mm 텅스텐 와이어의 끝을 선명 하 게 합니다. 분 젠 버너를 사용 하 여 유리 끝을 녹여 파스퇴르 피 펫에 바늘을 고정 하십시오.
- 바늘의 무딘 측면으로 해리 된 눈에서 렌즈를 부드럽게 스 쿱 하 고 부착 된 조직을 조심 스럽게 당겨 빼냅니다.
- PBS로 채워진 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후부를 올려 놓고 날카로운 텅스텐 바늘을 사용 하 여 망막과 공 막를 통해 방사형 절단을 하 고 다른 텅스텐 바늘 또는 집게로 눈을 움직이지 않게 합니다.
4. 하 부 렌즈 고정
- 실 온 (RT)에서 24 시간 동안 1.5의 PFA에서 하 부 렌즈를 즉시 수정 합니다. 10 분 동안 PBS에서 세 번 렌즈를 세척 하십시오.
- 전체 마운트 분석 또는 저온 냉동 보호를 위한 투과 렌즈 (섹션 8 참조)
- 4 ° c에서 밤새 PBS-T에 투과 렌즈.
5. 렌즈 면역 조직 화학
- Phalloidin-알 렉 사 플 루 또는 546 (1:200) 및 세포 핵을 dapi와 함께 배양 하 여 고정 배아/larval 또는 성인 렌즈의 막에 PBS-T를 4°c에서 하룻밤 동안.
주의: DAPI는 피부와 눈 자극입니다. - PBS-T로 3 회 각각 10 분간 씻으십시오. 클리어 티슈는 각각 RT에서 1 시간 이상, 또는 4°c에서 밤새 30%, 50% 및 70% 글리세롤 인 PBS에서 인큐베이션 하 여.
- 70%의 글리세롤 인 마이크로 웰 (v/v)에서 유리 바닥 35 mm의 글 리세 린으로 생선을 평평 하 게 하 고 똑바로 뚜껑을 덮고 가능한 한 접시에 놓습니다. 더 젊은 물고기의 경우, 약간의 전방-측면 기울기는 렌즈 봉합이 커버 슬립과 평행 하도록 방향을 지정 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
6. 생체 내 형질 전환 라인을 이용한 Zebrafish 전방 렌즈 봉합 사 분석
- Tol2 키트15를 사용 하 여 Tg 를 생성 합니다. Tol2 transposable 요소 시스템 (15 )은 매 플 (crystallin) 프로모터의 300 bp로 구동 되는 구성의 안정한 통합을 가능 하 게 하며,이는 caax 서 열에의 한 멤브레인에 테더 링 된 인간 β b1-(16 )의 발현을 가져온다 특히 렌즈 섬유 세포 막에.
참고: 이 구조 (ID: 122451를 구입할 수 있습니다.- 주입의 아침에, 주입 혼합물을 준비 하 고 얼음에 유지. RNase 및 DNase가 없는 H2o를 포함 하는 10 µ의 최종 부피에 도달 하기위해, 추가: 1.5 µ의 호β B1외침: mAppleCAAX DNA 구조 50 ng/µ l-[0.375 pg/최종 주입] 1.5 µ l Tol2 transposase mRNA에서 300 ng/µ l (Tol2 키트)15 [15-30 pg/ 최종 사출), 1%의 페 놀 적색 지시약이 1µ/최종 사출이 하에 있습니다.
- 1 세포 단계 배아에 주입 혼합물의 50-100 pL을 주입 하십시오12.
- 3 dpf에서 mApple 포지티브 렌즈를 사용 하 여 배아의 빈도를 측정 하 여 F0 주입 된 배아의 변환 효율을 측정 합니다.
참고: 이 방법을 사용 하 여 > 80%의 변환 효율을 기대할 수 있습니다. F0 모자이크는 개별 세포의 막 형태학의 상세한 분석을 허용 합니다. 모자이크의 다양 한 수준은 하나 또는 작은 세포 그룹의 형태학을 이미지 할 수 있습니다, 더 많은 글로벌 렌즈 표현은 생체 내에서렌즈 봉합 같은 멀티 단 구조를 분석 할 수 있습니다. - 모든 섬유 세포 막에 라벨 안정적인 라인을 생성 하는 모자이크 물고기 F0 outcross. 생식 계열에 통합 된 이식 유전자를 가진 F0 설립자는 형질 전환 선으로 유지 될 수 있는 안정 되어 있는 통합을 가진 자손을 생성할 것입니다.
7. 생체 내 형질 전환 선을 이용한 제 브라 피시 전방 렌즈 봉합 사 분석
- 3 개의 dpf 또는 성인용 모자이크 또는 안정한 형질 전환 어류를 마 취 하 고 유리 바닥 마이크로 웰 접시의 커버 슬립에 대 한 평평한 눈과 함께 트리 네이 어로 1% 낮은 용융 아가 로스 (LMA)를 마운트합니다.
- 100 mL (메 틸 렌 블루 불포함)에서 LMA 1g을 녹여 1% LMA를 만듭니다. 4°c에서 15 mL 주식으로 장기간 보관 하십시오. 각 튜브가 사용 될 때까지 전자 렌지에서 재고를 녹 인 후 42 ° c로 보관 하십시오.
- LMA가 설정 되어 있는 경우에는 성인을 위한 트리 네이로, 또는 탱크 물과 함께 최대 6 dpf로 물고기를 덮으 십시오.
- 메 틸 렌 블루 또는 탱크 물 없이 EM 5 mL를 혼합 하 여 트리 네 스톡의 250 µ L과 PTU의 7 µ L을 이미징 하면 PTU가 생선을 처리 합니다.
8. 렌즈 저온 절편 및 면역 조직 화학
- 냉동 보호 고정 배아 또는 성인용 렌즈는 PBS에 10% 자당을 넣고, 각각 RT에서 1 시간 동안 20% 자당 (또는 4°c에서 하룻밤) 및 4°c에서 30% 자당에서 하룻밤 동안.
- 10 월에 티슈를 기본 몰드에 내장 하 고 12-14 µm에서 10 월 제 빙 기를 사용 하 여 척에 고정 한 다음 슈퍼 프 로스트/플러스 현미경 슬라이드에 수집 합니다. 슬라이드 워 머에서 10 분 동안 슬라이드에 따뜻한 섹션은 ~ 35 ° c로 데워 졌습니다.
- 각 10 분 동안 PBS로 세 번 섹션을 씻으십시오. DAPI (1:1000) 또는 WGA-알 렉 사 밀가루 594 (1:200)를 사용 하 여 Phalloidin-알 렉 사 밀가루 546 (1:200)를 사용 하 여 섹션에 레이블을 지정 하면 3 개의 PBS 세척이 이어집니다. 안티 페이드 장착 매체로 마운트, 그리고 매니큐어와 인감 커버 슬립.
9. 이미징
- 공초점 현미경으로 이미지를 획득 합니다. 전방에서 후방 렌즈 극 까지의 특정 지역에서 60xn/1.2의 물 침수 목적 또는 유사한 방법으로 z 스택 또는 광학 슬라이스를 획득 합니다. 다음 수집 설정을 사용 합니다. 1.2 561 nm 레이저를 사용 하 여 통풍 디스크, phalloidin-알 렉 사 밀가루 546 또는 mApple에 대 한 텍사스 레드 필터, 또는 DAPI에 대 한 UV 필터와 405 레이저.
- 렌즈에 깊이 있는 신호 손실을 상쇄 하기 위해 z-강도 레이저 파워를 교정 합니다. 이것은 고정 되 고 살아있는 3 개의 dpf 배아의 후방 극에 강한 신호를 허용 하 고, 성인 물고기 렌즈에 있는 적도 광학적 인 조각에 있는 강한 신호를 가능 하 게 합니다.
- 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 컴파일하고 봅니다.
10. 전방 후부 축의 렌즈 핵 국 소화 측정
- 초점 평면에 평행 하 게 기둥과 봉합이 있는 커버 글래스 바닥이 있는 35 mm 접시에 PBS로 축방향으로 신선 하 게 절제 된 렌즈를 정위 시킵니다. 렌즈 핵을 식별 하기 위해 렌즈 피 질과 렌즈 핵의 계면에서 일반적으로 발생 하는 굴절률의 차이를 찾으십시오.
참고: 건강 한 야생 형 성인 렌즈는 매우 투명 하 여 렌즈 봉합과 핵을 보거나 렌즈 방향을 결정 하기가 어렵습니다. 이 경우, 렌즈 캡슐에 집게와 약간의 닉은 작은 손상을 초래 하 여 봉합 사 및 렌즈 핵이이 측정을 위해 렌즈의 방향을 정하기 위해 약 10 분 내에 명백 하 게 만듭니다. 그러나 현재 손상 된 렌즈는 다운스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 없게 됩니다. - 렌즈가 부착 된 해 부 현미경을 사용 하 여 DIC 광학의 유무에 관계 없이 밝은 필드 조명에서 렌즈 핵을 사용 하 여 렌즈의 이미지를 촬영 합니다. 보정을 위해 동일한 배율로 마이크로미터를 이미지 합니다.
- 라이브 뷰 버튼을 클릭 하 고 노출 설정을 조정 하 여 렌즈 핵과 렌즈 주변부를 시각화 하 고 스냅 샷 버튼을 클릭 하 여 이미지를 촬영 합니다. Tif 파일로 저장 합니다.
- 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 획득 한 렌즈 이미지를 보정 합니다. 직선 도구를 선택 하 고 마이크로 미터 이미지에 알려진 길이의 선을 그린 다음 분석 | 배율을 설정 합니다. 알려진 거리 단위를 입력 하 고 ' 전역 ' 교정을 선택한 후 확인을 클릭 합니다.
- 전방 극 (a-r)에 대 한 렌즈 핵의 중심 거리를 측정 한다.
- 이미지 처리 소프트웨어의 직선 도구를 사용 하 여 렌즈 핵의 이미징 중심에 축 방향으로 선을 그립니다. 이 라인의 중심을 렌즈 핵의 중심으로 가져가 세요.
- 이 점에서 렌즈의 전방 극까지 다른 선을 그리고 ' 분석 ' 메뉴에서 ' 측정 '을 선택 하 여 거리 (a-r)를 측정 하 고 렌즈의 반지름 은 렌즈의 중심에서 중심 까지의 거리 입니다. 핵.
- 전방에서 후방 극 까지의 다른 선을 그리고 렌즈 지름 (2a)으로이 거리를 측정 합니다. ' 결과 ' 창에서 이러한 길이를 복사 하 고 스프레드시트나 통계 프로그램으로 전송 합니다.
참고: 렌즈 핵의 중심에서 렌즈의 중심까지 측정 하는 것 보다 핵의 중심에서 전방 극까지 정확 하 게 측정 하는 것이 더 쉽습니다. 이 측정은 렌즈 핵의 중심에서 렌즈의 중심 까지의 거리를 보고 하는 단계 10.3.5의 수식에 의해 변환 된다. 배아 핵이 명백 하다 하더라도, 항상 측정을 위해 성체 핵을 사용 하십시오. - 직경을 2로 나누어 렌즈 반경 a를 계산 합니다.
- 렌즈 반경에 대하여 렌즈 핵
의 정규화 된 국 소화 인 것과 같이, r/a를 계산 한다.
주: 전방 극에 가깝게 배치 된 핵의 경우 r/a 는 0.0 > 되 고 중앙 집중화 된 핵은 0.0의 r/a 를 갖게 됩니다.
- 제 브라 피시 개발 시에 렌즈 핵 현지화의 변화를 결정 하기 위해 표준 길이의 함수로 서 정규화 된 축방향 핵 측정의 로그를 그래프로 작성 합니다.
의 정규화 된 국 소화 인 것과 같이, r/a를 계산 한다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
성인 제 브라 피쉬 아이 해부학은 포유류와 밀접 하 게 유사 합니다 (그림 1a). 제 브라 피쉬와 포유동물 눈의 차이에도 불구 하 고, 모양 체 체 (17) 대신에 모양 체 지 대를 갖는 것은 광학적 성질 (18)의 차이, 배아 발달 동안 형태 형성에 있어서의 차이 (19), 제 브라 피시 아이는 눈 발달 및 이해 안과 질환20,22를 연구 하는 훌륭한 모델입니다. 간단한 상피 라인은 렌즈의 전방 극, 적도에서 확산, 신장, 및 섬유 세포로의 분화의 수명이 긴 과정을 겪는 다. 성숙한 섬유 세포 (그림 1b, 하늘색) 태아에서 첫째로 분화 하 고, 소기관이 결여 되 고 결코 대체 되지 않습니다. 섬유 세포 팁을 차별화 하는 것은 전방 및 후방 봉합을 형성 하기 위해 극에서 만난다. 이러한 세포는 새로 분화 된 섬유 세포에 의해 내 면화 된다. 모든 척추 동물 렌즈와 마찬가지로 제 브라 피시 렌즈는 렌즈 핵의 중심에 위치한 가장 오래 된 세포로 개발 된 그라데이션을가지고 있습니다. 제 브라 어 렌즈는 18 hpf에서 1 차 렌즈 섬유를 형성 하는 것을 연장 하는 16 시간 후 시비 (hpf)에서 형태를 이루고, 2 차 섬유는 28-36 hpf에서 천이 영역을 형성 합니다. 후부 봉합 사는 48 hpf에서 볼 수 있습니다,이는 전방 봉합이 보이기 전에입니다10.
일반 렌즈 아키텍처의 정밀한 개발과 유지 보수는 광학에 필수적입니다. 여기서 우리는 제 브라 피쉬 렌즈 세포 형태학을 시험관 내 및 생체내 에서 분석 하는 방법을 설명 하며,이는 장점과 한계를 모두 포함 하 여, 제 브라 피시 Aqp0s 두 가지의 기능 돌연변이의 상실에서 기인 하는 표현 형을 분석 하기 위해 개발 된, Aqp0a 및 Aqp0b1. 시험관 내에서성인 렌즈 형태학의 평가를 위해 렌즈를 하 부 (그림 2) 하 고 즉시 고정 시켰다. 배아 평가는 전체 고정 배아 (도 3) 및 살아있는 형질 전환 배아에 비해 수행 하였다 (도 4). 해 부 및 고정 성인 렌즈 (도 5)는 이미징 성인 렌즈와 비교 하 여 라이브 (도 6). 이러한 방법을 사용 하 여 렌즈의 특정 부분의 검출 및 가시화의 차이를 요약 한다 (표 1).
Phalloidin은 밀 배아 응집 (WGA)에 비해 제 브라 피쉬에서 렌즈 섬유 세포 막을 라벨링 하는 것이 월등 한 것으로 밝혀졌다. Wga는 N-아 세 틸 D 글루코사민과 시 알 산에 결합 하는 렉 틴 이며, 형광 단에 접합 된 wga는 통상적으로 인간 (23)에서 렌즈 섬유 세포 막에 라벨을 사용 하 여 소24, 양 류25, 마우스26, 쥐27 및 제 브라 피시28,29. 여기에서 우리는 전체 zebrafish 렌즈에 phalloidin을 사용 합니다 (그림3, 그림 5).
배아 및 애벌레 zebrafish 애벌레까지 7 dpf는 렌즈 외부 피 질에 phalloidin의 침투를 허용 하기에 충분히 작고 투과성 이다. 3 개의 dpf에 의해 렌즈 핵이 소형이 고 세포 소기관이 결여 되어 있으며 전방 극에서 전방 봉합 사 (도 3a,B) 및 phalloidin은 적도 광학 평면에서 렌즈 핵 으로부터 배제 된다 (도 3c,D). Phalloidin은 섬유 세포 막의 높은 압축 때문에 핵에서 제외 될 확률이 높습니다, 이전 연구28에 일관 된. 그러나, 외부 피 질은이 염색 (그림 3c-F)와 함께 아주 자세하게 시각화 됩니다. 횡단면에서 섬유 셀은 평평한 육각형 모양, 더 긴 넓은 면, 짧은 좁은 면을 취합니다. Phalloidin 강하게 넓은 측면 사이의 대뇌 피 질의 섬유 세포의 다짐을 강조 하는 좁고 넓은 섬유 세포 막 (그림 3e-F) 모두를 레이블. 이 조직은 aqp0a/b 이중 돌연변이 (그림 3b, D, F 및 H)에서 크게 영향을 받지 않습니다.
이식 유전자의 모자이크 발현 (인간 β B1 crystallin 프로모터의 300 bp 프로모터 영역에 의해 구동 되는 CAAX 모티프에 의해 세포 막을 테더 링 하 여 2 dpf에서 시작 하는 렌즈를 강하게 표현 한다. 이식 유전자는 게놈에 무작위로 통합 되어 mApple의 이종 발현을 초래 한다. 우리는 피 질 (그림 4)에 강한 표현이 있는 3 개의 dpf 렌즈의 예를 보여주고 핵의 부분에서 표현 합니다 (그림 4d). 멤브레인 마커는 phalloidin 같은 투과성에 의해 제한 되지 않습니다, 따라서 그것은 렌즈 핵을 레이블. 모자이크 (그림 4)는 세포의 작은 하위 집합 에서만 발현 되는 DNA 주사에 의해 생성 되며, β b1 crystallin를 표현 하는 모든 세포에 라벨링 된 안정한 라인과 비교 하 여 개별 세포 형태를 분석 하는데 유용 하다 (도 6). Tg 에서 전방 봉합 사의 형태학은 전방 극에서 촬영 된 z-돌기에서 가시화 될 수 있다 (도 4a,B). 세포 막의 형태학은 phalloidin으로 표시 된 고정 렌즈 (그림 3a,B) 및 광범위 한 세포 막에서 하위 도메인의 존재 (그림 4a의 흰색 화살표)와 다르며 이전에는 다른 렌즈에서 식별 됨 종30 이 보입니다. 그러나 좁은 섬유 세포 막의 라벨링은 phalloidin으로 표지 된 고정 렌즈에서 볼 수 있는 전방 봉합 사 (그림 4a,b 화살표)에서 세포의 눈에 띄는 수렴을 보는 무 능력을 초래 합니다 (그림 3a,b 화살표).
흥미롭게도, 렌즈 적도에서 촬영 한 광학 조각은 또한 WT에 비해 aqp0a/b 이중 돌연변이에서 세포 부피에 명백한 중단으로 다른 라벨링 패턴을 공개 한다 (도 4c-F). 이는 형질 전환 된 광범위 한 섬유 세포 막을 phalloidin 보다 더 효과적으로 라벨 하기 때문 이다. 우리는 후방 극을 통해 z 돌기를 얻을 수 있었고, Z-보정을 사용 하 여 후부 봉합 사의 무결성을 분석 하 여 조직에 깊이 있는 레이저 동력을 증가 시켰습니다. 온전한 어류에서의 후방 봉합 사 (도 4g,H)에 대 한 명확한 분석은 처음 5 dpf로 제한 되었고, 그 후에 렌즈가 너무 조밀 하 여, 렌즈의 후방 부분에서 신호의 손실을 초래 하였다.
전방 봉합 사 (그림 5a, 화살표) 및 피 질의 형태학을 형성 하기 위해 수렴 하는 섬유 세포 행의 고도로 순서가 지정 된 아키텍처에서 phalloidin으로 레이블이 붙은 고정 해 부성인 렌즈 (그림 5c-h), 때문에 phalloidin에 의해 좁은 섬유 세포 막의 매우 강한 라벨링. 전방 극의 최대 Z-돌기는 광학에서 멤브레인 및 세포 핵의 질량으로 분명 한 WT (도 5a, 화살표)와 비교 하 여 aqp0a/b 이중 돌연변이 렌즈 (도 5b, 화살표)에서 타이트 한 전방 봉합 사의 손실을 밝혀 내었다 슬라이스 30 µm 전방 극에서 (그림 5d). 깊은 광학 조각에서, phalloidin 라벨링은 깊은 렌즈 피 질 및 핵에서 제외 되었다 (도 5e,F). 외부 피 질에 있는 섬유 세포 행의 전반적인 조직은 aqp0a/b 이중 돌연변이 렌즈에 있는 단단한 전방 봉합 사의 부족에 다소 영향을 받지 않았기 때문에, 렌즈를 이미징 면에 정확 하 게 수직으로 배치 하는 것이 불가능 합니다 (그림 5f )을 WT 렌즈에 비교 하 여 (그림 5e) 그러나, 적도 평면에서 찍은 섬유 세포 행의 높은 전력 이미지는 외부 피 질에 있는 세포가 여전히 질서 있는 행을 형성 밝혀, 강한 좁은 섬유 세포 라벨링으로 인해 보이는 (그림 5g,H). 그들의 단단한 압축의 조합으로 인해 개별 섬유 세포 넓은 막을 분별 하는 것은 불가능 하 고, 약한 신호. 이러한 렌즈는 해 부 되었기 때문에 후방 봉합 사의 z-돌기를 허용 하 여 후부 섬유 세포 팁이 단단한 봉합을 형성 하는 것과 같은 유전자 형 사이에 아무런 차이가 없음을 보여 주는 목적을 마주 하 고 있습니다. J 화살표).
살아있는 마 취 성인 안정한 Tg의 렌즈의 Z-돌기 ( β B1외침: Mapplaax) 물고기는 전방 피 질에 있는 대뇌 피 질의 막 형태학을 공개 합니다 (도 6a,a ') 뿐만 아니라 전방 극에서의 세포 수렴 정도 ( 도 6B). 고정 된 해 부 렌즈에 비해 렌즈 봉합 사를 이미징 평면에 수직으로 장착 하는 것이 더 어려웠습니다. 이식 유전자를 운반 하는 안정한 라인은 렌즈 핵에 mApple를 표현 한다 (도 6c,D). 적도의 광학 조각은 전방 피 질과 동일한 레이저 파워를 이미지화 할 때 핵의 광범위 한 압축을 나타내는 강한 신호를 공개 했다 (그림 6c). 흥미롭게도, 외부 피 질의 세포 해상도는 배아와 달리 성인에서 명백 했다. 이는 조리개가 렌즈 주변부에서 명확한 신호를 차단 하기 때문일 수 있습니다. 이미징 전에 눈동자의 팽창 시킴에 의해 더 강한 렌즈 대뇌 피 질 신호를 얻을 수 있다. 레이저 출력을 줄여 렌즈 핵의 일부 세포 층을 구별할 수 있었습니다 (그림 6d). 성인 제 브라 피시 렌즈는 매우 조밀 하며, 생체 내후방 극 으로부터 신호를 얻는 것이 불가능 하였다.
우리는 제 브라 피시 렌즈 핵이 애벌레 렌즈의 초기 전방 위치에서 성인1의 중앙 위치로 이동 하는 광학 축에서 움직이는 것을 보여주었습니다. Phalloidin 및 WGA는 렌즈 핵 (그림 7-C)에서 제외 되기 때문에 이러한 움직임은 축 렌즈 섹션에서 강조 표시 됩니다. 우리는 Aqp0a이 중앙 집중화 과정1에 필요 하다는 것을 보여주었습니다, 그러나이 기계 장치는 그밖 단백질에 의해 영향을 받기 위하여 확률이 높습니다. 전방 후부 축을 따라 위치와 관련 하 여 렌즈 핵의 중심을 국 소화 하는 것은 해 부 전체 렌즈 들을 DIC 조명 하에서 축 방향 및 이미징에 배치 하 여 측정 하였으며, 따라서 약간의 차이를 강조 굴절 특성 (그림 7e). 봉합 사는 일반적으로 주위 피 질 보다는 다른 굴절률, 그래서 오리엔테이션을 위한 가이드로 사용 될 수 있습니다. 젊은 애벌레 렌즈는 더 명백한 봉합 사 (매우 젊은 렌즈의 후부 봉합)를가지고 있으며, 다른 굴절률을 갖는 렌즈 핵은 분명히 비대칭 이기 때문에이 단계에서 렌즈를 쉽게 정위 할 수 있습니다. 렌즈 (r)의 중심 으로부터 렌즈 핵의 중심 까지의 상대적인 거리는 렌즈 반경 (a)으로 정규화 된다. 이는 표준 길이 측정이13을 사용 하는 zebrafish 개발과 관련 하 여 그래프로 표현 됩니다. WT에서는 렌즈 핵이 전방 렌즈 극 
가까이에서 시작 하 여 성인 기 
에 중앙 집중화 합니다 (그림 7f).
그림 1 : 제 브라 피시 성인용 아이와 렌즈 다이어그램. 전방은 빛이 눈에 들어가는 곳으로 촬영 되 고, 제 브라 피시는 실제로 횡 방향입니다. (A) 제 브라 피시 렌즈는 각 막과 함께 망막에 초점을 맞추고 있습니다. 수생 동물에서 각 막은 가벼운 굴절에서 사소한 역할을 하지만 대신, 렌즈는 더 높은 굴절률18을 갖습니다. 렌즈는 수성 유머로 채워진 전방 실과 유리 체 유머로 채워진 후방 챔버를 분리 합니다. (B) 제 브라 피시 렌즈는 포유류 렌즈 보다 구형 이다. 섬유 세포 팁은 전방 및 후방 극에서 지점 또는 배꼽 봉합 사8 에서 만납니다. 렌즈 핵 (물색)에 있는 성숙한 섬유 세포는 소기관 및 핵이 결여 되 고 있는 동안에 핵과 세포 소기관을 가진 피 질에 있는 섬유 세포 분화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 제 브라 피시 렌즈 해 부. (A) 마 취 된 생선에서 눈을 부 어 서 후부를 위 (B)로 두었다. (C) 안구는 광학 디스크 (od)를 통해 집게로 고 정화 되며 2 ~ 3 개의 방사형 절 개는 광학 디스크에서 zonules로 망막과 공 막에서 만들어집니다. (D) 플랩을 접어 렌즈를 표시 합니다. (E) 눈을 각 막 위로 향하게 회전 시키고, 각 막을 통해 간접적으로 렌즈를 움직이지 않게 하 고 sclera 망막을 멀리 당깁니다. (F) 남아 있는 망막을 자르고 렌즈에서 영역/zonules을 모양 체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 시험관 내배아 렌즈 형태학. DAPI (청색)와 함께 phalloidin (적색) 및 세포 핵으로 표시 된 고정 및 투과 배아는 막 형태학과 극의 봉합 무결성을 나타냅니다. Z-돌기는 WT 및 aqp0/b 이중 돌연변이 렌즈가 3dpf (a, b)에서 매우 단단한 전방 봉합 사 (화살표)에서 만나는 매우 규칙적인 섬유 세포 배열을 나타냅니다. 적도에서 찍은 광학 조각은 두 유전자 형 (c&c)의 외부 피 질에 포장 된 육각형 섬유 세포의 단단한 행을 드러냅니다. 섬유 세포 막의 좁고 넓은 측면은 모두 (E)에 표시 된 바와 같이 라벨이 붙어 있습니다. 후부 봉합 (화살표)은 두 유전자 형 (G, H) 모두에서 형성 되 고 단단 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 생체 내배아 렌즈 형태학. 마 취 된 3 개의 dpf 모자이크 F0 주입 된 Tg의 살아있는 화상 진 찰 ( β B1외침: Mapplaax) 렌즈는z 전망에 있는 전방 봉합 사 (화살)를 드러냅니다. (a ') 멤브레인 하위 도메인은 넓은 섬유 세포 막에서 puncta (흰색 화살표)로 분명 하다. 좁은 섬유 세포 막도 분명 합니다 (검은색 화살표). WT 렌즈는 확실 한 팽 윤 세포 (D, F)와 aqp0a/b 이중 돌연변이의 중단 된 피 질과 비교 하 여 단단히 포장 된 렌즈 대뇌 피 질의 섬유 세포 (C, E)를 드러냅니다. 후방 (g, h)에 초점을 맞춘 봉합 (화살표)은 유전자 형 (g, h) 간의 차이를 밝혀 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 시험관 내성인 렌즈 형태학. 23mm 이상의 표준 길이를 초과 하는 어류 로부터 적 출하, 고정 및 투과 렌즈는 phalloidin (적색) 및 DAPI (청색)로 표기 하였다. 전방 극에서의 150 µm Z 프로젝션은 WT (a)의 단단한 봉합 사 (화살표)에서 수렴 되는 섬유 세포 팁의 엄격한 배열을 표시 하지만, 대신에 멤브레인과 핵 (b)의 질량이 있는 aqp0a/b 이중 돌연변이 (화살표)가 아닙니다. 전방 극에서 42 µm 촬영 한 광학 슬라이스는 WT (C)에서 중심에 수렴 하는 정렬 된 세포를 표시 하지만 봉합 사는 돌연변이 렌즈 (D)에 있어야 하는 핵 덩어리입니다. 렌즈의 적도를 통해 광학적 인 조각, 전방 극에서 130 µm에서 섬유 세포의 조밀 하 게 포장 된 행을 WT (E, G) 및 돌연변이 체 (F, H)에 드러냅니다. 후부 봉합 (화살표)은 두 유전자 형 (I, J) 모두에서 형성 되 고 단단 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 생체 내에서성인 렌즈 형태학. 마 취 성인 안정한 Tg (β B1외침: mAppleCAAX) WT 렌즈의 라이브 이미징. 전방 피 질에서 Z-돌기는 단일 광학 슬라이스 (B, 화살표)의 지점으로 수렴 하는 세포와 대뇌 피 질의 형태학 (a) 및 전방 봉합 사 (화살표)를 공개 한다. 피 질은 더 강한 신호 형성 렌즈 핵 (D)에 비해 적도 (C)를 통해 광학 슬라이스 내에서 더 높은 레이저 전력으로 가시화 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 제 브라 피시 렌즈 핵 중앙 집중화. 고정 및 동결 보호 배아 (a) 및 렌즈 (b, c)는 축방향으로 단면 처리 되었으며 phalloidin-546 (적색 a, b) 또는 wga-594 (적색)의 dapi로 라벨링 하였다. 렌즈 핵은 세포 핵이 없고, 3 dpf (a)에서 전방 (a) 렌즈에 더 가깝게 배치 되 고, 1 개월 된 렌즈 (B)에서 중앙에 성인 렌즈 (C)에 배치 되는 것에 비해. 4.1 mm 표준 길이의 제 브라 피시 로부터 1 개월 동안 하 부 렌즈는 평형 (D) 또는 축 방향 (E)을 지향 하였다. 축에서 렌즈 핵의 상대적인 국부 화는 다음의 전략을 사용 하 여 계산 하였다 (E) 렌즈 핵의 중심 (*)의 거리를 전방 극으로 측정 하였으며,이를 측정 하는 것 보다 더 실용적으로 렌즈 (플러스)의 중심 까지의 거리 (r). 이를 렌즈 반경 (a)으로 정규화 하 여 렌즈 직경을 축방향으로 측정 하였다. 정규화 된 축 핵 국 소화의 로그는 표준 길이 (F)에 의해 측정 된 제 브라 피쉬 개발의 함수로 서 그래프 화 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 기능 | IHC 배아 | Tg 배아 | 전체 IHC 성인 렌즈 | Tg 성인 |
| 라이브 | N | Y | N | Y |
| 전방 봉합 사 | Y | 다소 | Y | 다소 |
| 후부 봉합 | Y | Y | Y | N |
| 대뇌 피 질의 셀룰러 세부 사항 | 다소 | Y | Y | 앞쪽 약간 |
| 렌즈 핵 세부 사항 | N | Y (안정) | N | Y (안정) |
| 보조 레이블 | Y-항 체 | 만 Tg와 라이브 | Y-항 체 | 만 Tg와 라이브 |
| 넓은/좁은 섬유 라벨 | 모두 | 넓은 | 대체로 좁은 | 넓은 |
표 1: 제 브라 피시에서의 렌즈 형태학 분석을 위한 생체 내 대 시험관 내 방법의 비교 요약. Y = 예, N = 아니오
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Discussion
제 브라 피시 렌즈 형태학의 분석은 돌연변이 체의 표현 형을 이해 하는 초기 단계, 또는 안구 렌즈의 생물학을 연구 하기 위한 약리학 적 개입의 효과입니다. 렌즈 봉합, 대뇌 피 질 섬유 세포 형태학 및 렌즈 핵의 측면을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 접근법은 시험관 내 및 생체 내에서의 조합 ( 표 1과 비교 하 여) 이다. 시험관 내 방법은 외부 피 질 세포 형태학의 더 큰 세부 사항을 허용 뿐만 아니라, 성인 렌즈의 후부 봉합에 대 한 액세스.
생체 내 분석은 형질 전환 마커를 사용 하 여 가능 하다. 여기서 소개 하는 이식 유전자는 기존의 Q01 제 브라 피시 라인과 비교 하 여 렌즈 멤브레인 특유 이며,이는 렌즈 멤브레인을 라벨링 하는 동안 무 축 삭 세포를 포함 한 눈의 다른 세포 타입에 라벨을 부착 하는 동시에 해석을 복잡 하 게 합니다.11 . 생체 내 신호는 배아 발생의 제 2 일 동안 형성 되는 안구의 색소 상피에 의해 제한 되며, 따라서 태아는이 및 후속 단계에서 분석을 위해 ptu 처리 될 필요가 있다. 성인의 경우, 아이리스는 렌즈 피 질의 명확한 분석을 모호 하 게 하지만 전방 렌즈 피 질의 생체 내 분석이 가능 합니다. 물고기 렌즈의 라이브 이미징 같은 동물에서 렌즈 형태학의 세로 연구를 할 수 있습니다. 이것은 삼투성 또는 약리학 적인 섭 동에 응 하 여 세포 부피 중단과 같은 동적인 프로세스에 효력을 공부 하기를 위한 아주 유용한 공구 일 수 있습니다. 예기치 않은 발견은 우리가 명확 하 게 살아있는 애벌레 transgenics에 있는 넓은 섬유 세포 막에 있는 막 하위 도메인을 시각화할 수 있다는 것입니다, 그러나 고정 된 렌즈에서 아닙니다. 이것은이 하위 도메인이 고정 과정에 의해 영향을 받을 수 있다는 사실 뿐만 아니라 이식 유전자 및 phalloin에의 한 라벨링의 차이를 강조 합니다.
렌즈 핵 중앙 집중화의 분자 메커니즘의 분석 우리가 설명 하는 방법을 사용 하 여 렌즈 광학 특성의 발달에 필수적인 메커니즘을 발견 할 수 있습니다. 비록, 지금까지, 축 렌즈 핵 비대칭은 zebrafish에서 보고 된만,이 과정을 연구 함으로써 우리는 다른 종의 렌즈 광학의 개발에 필요한 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻을 가능성이 높습니다. 미래에, 형질 전환 동물 들은 녹색 전이 마커를 사용 하 여과 발현 연구와 같은 다른 응용 들과 조합 하 여 사용 될 수 있다. 이들은 렌즈에 있는 특정 단백질을과 발현의 효과를 연구 하기 위하여, 또는 기존 돌연변이에 있는 표현 형의 구조를 위해 사용 될 수 있었습니다.
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Disclosures
우리는 공개 하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 우리의 자금 출처를 인정 하 고 싶습니다: NIH R01 EY05661에 게 J. H, 네 스 Gehring aqp0a/b 이중 돌연변이와 zebrafish를 생성 하는 것을 돕기 위한, 박사 다니엘 Dranow transgenics의 세대에 이르는 논의를 위해, 브루스 박사 블 룸 베르크와 박사는 하 부 현미경 사용을 위한 연구소와 미 건 스미스 박사는 통계 분석에 도움을 주었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21 °C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont #5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION - toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
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