Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Deze protocollen werden ontwikkeld om de corticale lens morfologie, structurele integriteit van de zebravis lens hechtingen in vaste en live lenzen te analyseren en om de positie van de zebravis lens Nucleus te meten langs de voorste-posterior as.

Abstract

De zebravis is uniek geschikt voor genetische manipulatie en in vivo beeldvorming, waardoor het een steeds populairder model voor omgekeerde genetische studies en voor de productie van transgenes voor in vivo Imaging. Deze unieke mogelijkheden maken de zebravis een ideaal platform om oculaire lens ontwikkeling en fysiologie te bestuderen. Onze recente bevindingen dat een aquaporine-0, Aqp0a, is vereist voor de stabiliteit van de voorste lens hechting, evenals voor de verschuiving van de lenskern naar de lens centrum met de leeftijd leidde ons om tools te ontwikkelen vooral geschikt voor het analyseren van de eigenschappen van zebravis lenzen. Hier schetsen we gedetailleerde methoden voor lens dissectie die kunnen worden toegepast op zowel larvale en volwassen lenzen, om hen voor te bereiden op histologische analyse, Immunohistochemistry en imaging. We richten ons op de analyse van de lens hechting integriteit en corticale cel morfologie en vergelijk de gegevens gegenereerd uit ontleed lenzen met gegevens verkregen uit in vivo beeldvorming van de lens morfologie mogelijk gemaakt door een nieuwe transgene zebravis lijn met een genetisch gecodeerde fluorescerende marker. Analyse van ontleed lenzen loodrecht op hun optische as maakt kwantificering van de relatieve positie van de lenskern langs de voorste-posterior as. Beweging van de lenskern van een eerste voorste positie naar het centrum is vereist voor de normale lensoptiek in volwassen zebravis. Aldus, correleert een kwantitatieve maatregel van lenskern positie direct met zijn optische eigenschappen.

Introduction

De zebravis is een uitstekend model voor het bestuderen van lens ontwikkeling en fysiologie als gevolg van de anatomische gelijkenissen met zoogdieren lenzen, relatief gemak van genetische en farmacologische manipulatie, de snelheid van de embryonale ontwikkeling van het oog, kleine omvang en transparantie in een vroeg stadium waardoor in vivo beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn ontwikkeld om zebravis lens morfologie te analyseren op embryonale en volwassen stadia met een focus op sutural integriteit, corticale membraan morfologie in vitro en in vivo, en locatie van de lens nucleaire positie langs de anterior-posterior as ex vivo. Deze methoden dienen als uitgangspunt voor functionele studies van de lens ontwikkeling en fysiologie, evenals omgekeerde genetische schermen voor lens fenotypes in zebravis.

Imaging zebravis lens morfologie

Aquaporine 0 (AQP0) is de meest voorkomende lens membraan eiwit en is van cruciaal belang voor beide, lens ontwikkeling en duidelijkheid, als gevolg van meerdere essentiële functies bij zoogdieren. Zebravis hebben twee Aqp0s (Aqp0a en Aqp0b) en we hebben methoden ontwikkeld om het verlies van hun functies te analyseren in zowel embryonale en volwassen lenzen. Onze studies tonen aan dataqp0a-/-mutanten voorste polaire opaciteit te ontwikkelen als gevolg van instabiliteit van de voorste hechtdraad, en aqp0a/b dubbele mutanten ontwikkelen nucleaire opaciteit1. AQP0 is aangetoond rollen te spelen in het water transport2, adhesie3,4, cytoskelet verankering5 en generatie van de brekingsindex gradiënt6, maar deze studies zijn grotendeels uitgevoerd in vitro. De zebravis biedt een unieke gelegenheid om te bestuderen hoe het verlies van functie, of verstoord functie van Aqp0a of Aqp0b zou de morfologie en de functie van invloed zijn in een levende lens. Om te beoordelen lens cel morfologie en sutural integriteit tijdens de ontwikkeling, we gewijzigd bestaande in vitro immunohistochemische methoden7 voor gebruik in embryonale en volwassen lenzen, en gegenereerde transgenen om dit proces te controleren in vivo .

Immunohistochemische analyse van de plasmamembraan structuur en sutural integriteit werd uitgevoerd in hele vaste embryo's en volwassen lenzen. Zebravis lenzen zijn extreem klein (lens diameter is ~ 100 µm in embryo's en tot 1 mm bij volwassenen) in vergelijking met hun tegenhangers van zoogdieren en hebben punt hechtingen8, die zelden worden gevangen in cryosecties. Zo, hele lenzen zijn essentieel voor het analyseren van sutural integriteit. Voor in vivo analyse van de voorste hechting vorming, en de beeldvorming van precieze lens Cell architectuur, genereerden we transgenes uiten Mapple specifiek etikettering lens membranen.

Voordelen van Live Imaging van de lens membraan transgenes zijn: 1) het vermijden van fixatie artefacten, 2) het bestuderen van dynamische morfologische veranderingen in time-lapse films, en 3) het mogelijk maken longitudinale studies waarin eerdere gebeurtenissen kunnen worden gecorreleerd met later Fenotypen. Pigmentatie van de Iris voorkomt normaalgesproken duidelijke beeldvorming van de lens periferie. Toevoeging van 1-fenyl 2-thioureum (PTE) voor de Primordia-5 (Prim-5) fase9 voorkomt melanogenesis en oog pigmentatie tot ongeveer 4 dagen postfertilization (DPF). Echter, na 4 DPF, is de lens periferie verduisterd in vivo, met name in oudere stadia. Bovendien, de dichtheid van de lens zelf verduistert beeldvorming van de achterste paal. Daarom, om de morfologie van de lens periferie te bestuderen, of de achterste hechting, na 4 DPF, lenzen moeten worden versneden en vastgesteld.

Transgene zebravis lijnen zijn gebruikt om embryonale lens membraanstructuur te analyseren in vivo10. De Q01 transgene drukt een cyaan fluorescerende eiwit gesmolten tot een membraan targeting sequentie, Gap43, gedreven door de EF1α promotor en een hexamer van de DF4 Pax6 Enhancer element ubiquitously in lens Fiber cellen11. Q01 heeft extra-lensvormige uitdrukking, met inbegrip van amacrine cellen in het netvlies, die achtergrond signaal toevoegt als de primaire rente is de lens. We ontwikkelden een nieuwe transgene lijn die een membraan-tethered mApple specifiek in de lens uitdrukt, met als doel het vermijden van een extra-lensvormig signaal.

Lens Nucleus lokalisatie

We ontdekten dat de lens Nucleus verhuist van een eerste voorste locatie in larvale zebravis naar een centrale locatie in de voorste-posterior as in volwassen lenzen. Deze verschuiving in de positie van de hoge brekingsindex lens Nucleus wordt gedacht dat een eis voor de normale ontwikkeling van zebravis lens optica1. Onze methoden laten kwantificering van de lens nucleaire centralisatie in relatie tot de lens straal. Met behulp van deze methode, toonden we aan dat Aqp0a is vereist voor de lens nucleaire centralisatie1, en deze eenvoudige methode kan worden toegepast op andere studies van de ontwikkeling en fysiologie van de lens en de optische eigenschappen in de zebravis model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dierlijke protocollen gebruikt in deze studie voldoen aan de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en visie onderzoek en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Californië, Irvine.

1. zebravis veeteelt en euthanasie

  1. Raise en onderhoud zebravis (AB strain) onder standaard laboratorium condities12. Verhoog embryo's in embryo medium (EM)12. Voeg 0,003% Pte aan EM van 20-24 h postfertilization (vóór de Prim-5 fase) om pigment vorming te voorkomen in embryo's12 gebruikt voorbeeld vorming in embryonale stadia9. Verhoog de larven van 6-30 dagen postfertilization (DPF) op een dieet van Live raderdiertjes tot 14 DPF, en leef Artemia na 14 DPF12.
    Let op: PTE is zeer giftig
  2. Verdoven vis met behulp van tricaine tot niet-ontvankelijk te raken.
    1. Bereid tricaine voorraad door het combineren van 400 mg 3-amino benzeen acidethylester, met 2,1 mL van 1 M Tris (pH 9), in 100 mL ddH2O. pas aan pH 7,0 aan en bewaar bij-20 °c.
      Let op: Tricaine is giftig.
    2. Verdun 4,2 mL tricaine voorraad in 100 mL tank water tot verdoven larven/volwassenen of in EM tot verdoven embryo's (eindconcentratie van tricaine bij 0,0165% w/v).

2. fixatie van embryo's en larven

Opmerking: De protocollen van immunohistochemische werden aangepast van eerder gepubliceerde materialen7.

  1. Vast te stellen dechorionated embryo's of larven tot 2 weken postfertilization in 4% (v/v) Paraformaldehyde (de) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) overnachting bij 4 °C op een tuimelschakelaar.
    Let op: Het is een onbrandbaar en kankerverwekkend.
  2. Was embryo's drie keer voor 10 min in PBS, en permeabilize in PBS met 10% Triton en 1% DMSO (PBS-T) overnachten bij 4 °C.
    Let op: DMSO is giftig, is schadelijk door inslikken of huid absorptie, draagt gevaarlijke materialen door de huid, en is brandbaar. Triton is giftig, corrosief en is gevaarlijk voor aquatische omgevingen.

3. dissectie van larvale en volwassen zebravis lenzen

  1. Verdoven vis van 6 DPF larven naar volwassenheid met tricaine tot niet-ontvankelijk te raken, maar nog steeds met een sterke hartslag. Maatregel vissen standaard lengte per Schilling (2002) voor enscenering13.
  2. Onmiddellijk accijnzen ogen met behulp van micro-dissectie schaar en plaats in een dissectie schotel in PBS (Figuur 2 getoond voor volwassen ogen).
    1. Maak een aangepaste 35 mm schotel gevuld met siliconen voor lens dissecties. Zodra het silicone heeft geplaatst, accijns een Divot rond 2-3 mm in diameter en 0,5 mm diep voor het immobiliseren van volwassen ogen/lenzen tijdens dissectie.
  3. Dissectie van Adult zebravis lenzen
    1. Plaats een volwassen oog in de schotel Divot posterior kant omhoog gevuld met PBS. Immobiliseren het oog door het invoegen van een tang op < hoek van 45 ° door de optische schijf. Wees voorzichtig niet te Nick of de lens te comprimeren. Maak twee of drie radiale incisies door Retina en Sclera van de optische schijf naar de tril zone met dissectie schaar.
    2. Schil terug het netvlies en Sclera zoals bloemblaadjes en omkeren het oog, hoornvlies kant omhoog. Immobiliseren de lens indirect via manipulatie van de Sclera en het hoornvlies met de platte kant van de schaar, terwijl het trekken weg het netvlies en de bijgevoegde weefsels met een tang. Zorgvuldig trim overtollig weefsel van de lens.
      Opmerking: Het is van vitaal belang om ontleden zorgvuldig te verkrijgen consequent gezonde lenzen.
  4. Dissectie van larvale zebravis lenzen
    1. Plaats een larvale oog posterior kant omhoog op het vlakke deel van de siliconen schotel gevuld met PBS en gebruik een aangescherpte Tungsten naald te maken radiale bezuinigingen door het netvlies en Sclera, terwijl immobilisatie van het oog met een andere Tungsten naald of Tang.
      Opmerking: Zorg ervoor dat u de lens niet beschadigt.
      1. Verscherp het uiteinde van een 2 cm lengte van 0,1 mm wolfraam draad elektrolytisch door het opschorten van de draaduiteinde in 10% (w/v) NaOH en het toepassen van een laag voltage afwisselend-stroom14. Beveilig de naald in een Pasteur pipet door het glazen uiteinde te smelten met een broodjes brander.
        Opmerking: Alternatieve fijne dissectie tools kunnen ook worden gebruikt.
        Let op: NaOH is corrosief.
    2. Voorzichtig Scoop uit de lens van het gescheiden oog met een botte kant van de naald, en voorzichtig weg te trekken bevestigd weefsel.

4. fixatie van ontleden lenzen

  1. Onmiddellijk vast te stellen ontleed lenzen in 1,5% (v/v)-genieter in PBS voor 24 uur bij kamertemperatuur (RT). Was lenzen drie keer in PBS voor 10 min elk.
  2. Permeabilize lenzen voor hele Mount analyse of cryoprotect voor cryosectioning (zie paragraaf 8).
    1. Permeabilize lenzen in PBS-T overnachting bij 4 °C.

5. lens Immunohistochemistry

  1. Label membranen van vaste embryo/larvale of volwassen lenzen door incubatie in Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) en CELKERN met DAPI (1:1000 van 5 mg/ml voorraad) in PBS-T overnachting bij 4 °c.
    Let op: DAPI is een huid en oog irriterend.
  2. Was drie keer met PBS-T voor 10 min elk. Duidelijk weefsel door incubatie in 30%, 50% en 70% glycerol in PBS-T (v/v) voor minstens 1 h bij RT elk, of overnachten bij 4 °C.
  3. Mount vis in 70% glycerol in PBS-T (v/v) op glasbodem 35 mm microwell gerechten met ogen zo plat en recht tegen de cover slip mogelijk. Voor jongere vissen, kan een lichte anterior-laterale schuine stand helpen om de lens hechting te oriënteren parallel aan de dekglaasje te zijn.

6. analyse van zebravis voorste lens hechtingen met behulp van een transgene lijn in vivo

  1. Genereer TG (βB1cry: mAppleCAAX) lijnen met behulp van de Tol2 Kit15. De Tol2 transponerende element systeem15 maakt een stabiele integratie van de constructie waar Mapple wordt gedreven door 300 BP van de menselijke βB1-crystallin promotor16 vastgebonden aan het membraan door de CAAX sequentie resulteert in expressie specifiek in lens Fiber celmembranen.
    Opmerking: Deze constructie (ID: 122451) is beschikbaar voor aankoop.
    1. Op de ochtend van injectie, bereid het injectie mengsel en houden op ijs. Om een definitief volume van 10 µ L te bereiken van het bevatten van ASE-en DNase-vrij H2O, voeg toe: 1,5 µ l van HuΒB1Cry: mAppleCAAX DNA construct op 50 ng/µ l-[0.375-0.75 PG/final injectie], 1,5 µ l van Tol2 transposase mRNA op 300 ng/µ l (Tol2 kit)15 [15-30 PG/ laatste injectie], en 1 µ L van fenol rode indicator op 1% w/v [1 X10-5% (w/v)/Final injectie].
    2. Injecteren 50-100 pL van injectie mengsel in 1-Cell fase embryo's12.
  2. Maatregel Transgenesis efficiency in F0 ingespoten embryo's door het meten van de frequentie van embryo's met mApple positieve lenzen op 3 DPF.
    Opmerking: Verwacht te hebben > 80% Transgenesis efficiëntie met behulp van deze methode. F0 mozaïeken maken een gedetailleerde analyse mogelijk van membraan morfologie van individuele cellen. Verschillende niveaus van mosaicisme maakt het mogelijk om het imago van de morfologie van enkele of kleine groepen van cellen, terwijl meer globale lens expressie maakt de analyse van multicellulaire structuren zoals lens hechtingen in vivo.
  3. Outcross F0 mozaïek vis te genereren stabiele lijnen, die label alle vezels celmembranen. F0 oprichters met het transgene geïntegreerd in de germline zal voortbrengen nakomelingen met stabiele integraties die kunnen worden gehandhaafd als transgene lijnen.

7. analyse van zebravis voorste lens hechtingen met behulp van een transgene lijn in vivo

  1. Verdoven 3 DPF of volwassen mozaïek of stabiele transgene vissen en onderstel in 1% lage smelting agarose (LMA) met tricaine met het oog vlak tegen de dekkingsstrook van glasbodem microwell schotels.
    1. Los 1 g LMA op in 100 mL EM (zonder methyleenblauw) om 1% LMA te maken. Bewaar lange termijn als 15 mL voorraden bij 4 °C. Magnetron op te lossen voorraad en op te slaan op 42 ° c tot elke buis wordt gebruikt.
  2. Bedek vis tot 6 DPF met EM met tricaine, of met tank water met tricaine voor volwassenen wanneer LMA is ingesteld.
    1. Meng 5 mL EM zonder methyleenblauw of tank water met 250 µ L van tricaine voorraad en 7 µ L van Pte als Imaging Pte behandelde vis.

8. lens Cryosectioning en Immunohistochemistry

  1. Cryoprotect vaste embryo's of volwassen lenzen door het plaatsen in 10% sacharose in PBS (w/v), 20% sacharose voor 1 h bij RT elk (of overnachting bij 4 ° c) en overnachting in 30% sacharose bij 4 °C.
  2. Embed weefsel in oktober in base mallen, en vervolgens bevriezen op chucks met OCT. Cryosection op 12-14 µm en verzamelen op een SuperFrost/plus Microscoop dia's. Warme delen op dia voor 10 min op een dia warmer voorverwarmd tot ~ 35 ° c.
  3. Was secties drie keer met PBS voor 10 min elk. Label secties met Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) met DAPI (1:1000) of WGA-Alexa Flour 594 (1:200), gevolgd door drie PBS wast. Mount met anti-fade montage medium, en Seal dekglaasje met nagellak.

9. Imaging

  1. Verwerf beelden met een confocale Microscoop. Verwerven z-stacks of optische segmenten met behulp van een 60x N/A 1,2 water-onderdompeling doelstelling, of iets dergelijks, op specifieke regio's van de voorste naar achterste lens Pole. Gebruik de volgende acquisitie-instellingen: 1,2 luchtige schijf met behulp van de 561 nm laser, Texas Red filter voor phalloidin-Alexa Flour 546 of mApple, of de 405 laser met de UV-filter voor DAPI.
  2. Juiste z-intensiteit laservermogen om signaalverlies tegen te gaan met diepte in de lens. Dit zorgt voor een sterk signaal op de achterste pool van vaste en Live 3 DPF embryo's, en een sterk signaal in equatoriale optische plakjes in volwassen vis lenzen.
  3. Compileer en Bekijk beelden met behulp van beeldverwerkingssoftware.

10. meting van de lens Nucleus lokalisatie in de voorste-posterior as

  1. Orient vers besneden lenzen axiaal in PBS in een 35 mm schotel met een coverglass bodem, met palen en hechtingen georiënteerd parallel aan het vlak van de focus. Kijk voor een verschil in de brekingsindex, die meestal optreedt op de interface van de lens cortex en de lens Nucleus om de lenskern te identificeren.
    Opmerking: Gezond wild type volwassen lenzen zijn uiterst transparant waardoor het moeilijk is om de lens hechtingen en kern te zien, of om de lens oriëntatie te bepalen. In dit geval, een lichte Nick met een tang om de lens capsule veroorzaakt kleine beschadigingen, waardoor de hechtingen en de lenskern zichtbaar in ongeveer 10 min helpen om de lens te oriënteren voor deze meting. Echter, de lenzen onbruikbaar geworden voor downstream-toepassingen zoals ze zijn nu beschadigd.
  2. Neem beelden van lenzen met de lens Nucleus in focus onder fel veld verlichting met of zonder DIC optiek met behulp van een dissectie Microscoop met een camera bevestigd. Afbeelding een micrometer onder dezelfde vergroting voor kalibratie.
    1. Klik op de Live View knop, aanpassen van de belichting instellingen om de lenskern en de lens periferie te visualiseren, en neem een afbeelding door te klikken op de Snapshot knop. Opslaan als een TIF-bestand.
    2. Gebruik image processing software om de verworven lens beelden te kalibreren. Selecteer de rechte lijn gereedschap en teken een lijn van bekende lengte op de micrometer afbeelding, klikt u op analyseren | Stel schaal in. Voer bekende afstand, eenheden en selecteer ' Global ' kalibratie, en klik op OK.
  3. Meet de afstand van het midden van de lenskern aan de voorste paal (a-r).
    1. Gebruik het rechte-lijn hulpmiddel in beeldverwerkingssoftware om een lijn over het gebeelde centrum van de lenskern in een axiale richtlijn te trekken. Neem het midden van deze lijn als het midden van de lenskern.
    2. Teken een andere lijn van dit punt naar de voorste paal van de lens en selecteer ' maat ' in het ' analyseren ' menu om de afstand (a-r), waar a is de straal van de lens en r is de afstand van het midden van de lens naar het midden van de Nucleus.
    3. Teken een andere lijn van de voorste naar de achterste palen en meet deze afstand als de lens diameter (2a). Kopieer deze lengtes uit het venster ' resultaten ' en breng deze over naar een spreadsheet-of Statistiekprogramma.
      Opmerking: Het is makkelijker om precies te meten vanuit het midden van de kern naar de voorste paal, dan meten van het midden van de lenskern naar het midden van de lens. Deze meting wordt omgezet door de formule in stap 10.3.5 om de afstand van het midden van de lenskern te rapporteren aan het midden van de lens. Gebruik altijd de volwassen Nucleus voor metingen, ook al is de embryonale kern evident.
    4. Verdeel de diameter door 2, om de lens RADIUS te berekenen, a.
    5. Bereken r/a, zoals Equation 1 , dat is de genormaliseerde lokalisatie van de lenskern met betrekking tot de lens straal.
      Opmerking: voor een Nucleus dichter bij de voorste paal, r/a zal worden > 0.0, terwijl een centraal gelokaliseerde kern zal een r/a van 0,0.
  4. Grafiek de log van de genormaliseerde axiale Nucleus meting als een functie van de standaard lengte om veranderingen in de lens Nucleus lokalisatie te bepalen tijdens zebravis ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Adult zebravis Eye anatomie lijkt sterk op die van zoogdieren (Figuur 1a). Ondanks enkele verschillen tussen zebravis en zoogdier ogen, zoals het hebben van een tril gebied in plaats van een tril lichaam17, verschillen in optische eigenschappen18, en verschillen in morfogenese tijdens de embryonale ontwikkeling19, de zebravis Eye is een uitstekend model voor het bestuderen van ontwikkeling van het oog en het begrijpen oogheelkundige ziekte20,21,22. Een eenvoudige epitheel lijnen de voorste pool van de lens, die bij de evenaar ondergaat een leven lang proces van proliferatie, rek, en differentiatie in vezel cellen, die het grootste deel van de lens. Oudere vezel cellen (Figuur 1b, licht blauw) eerst differentiëren in het embryo, zijn verstoken van organellen en worden nooit vervangen. Differentiëring Fiber Cell tips voldoen aan de Polen om de voorste en achterste hechtingen vormen. Deze cellen worden dan intern door nieuw onderscheiden vezel cellen. Net als alle gewervelde lenzen, de zebravis lens heeft dus een gradiënt van de ontwikkeling met de oudste cellen gelegen in het midden van de lenskern. De zebravis lens placode vormen op 16 h postfertilization (HPF), die verlengt om de primaire lensvezels vormen op 18 HPF, en secundaire vezels vormen de overgang zone op 28-36 HPF. De achterste hechting is zichtbaar op 48 HPF, dat is voordat de voorste hechting zichtbaar wordt10.

De precieze ontwikkeling en het onderhoud van de reguliere lens architectuur is essentieel voor de optiek. Hier beschrijven we methoden voor de analyse van zebravis lens cel morfologie in vitro en in vivo, met inbegrip van zowel voordelen en beperkingen, die we ontwikkelden om fenotypen als gevolg van verlies van-functie mutanten van twee zebravis Aqp0s te analyseren, Aqp0a en Aqp0b1. Voor de beoordeling van de volwassen lens morfologie in vitro, lenzen werden ontleed (Figuur 2) en onmiddellijk vast. De embryonale beoordeling werd uitgevoerd in hele vaste embryo's (Figuur 3) en vergeleken met levende transgene embryo's (Figuur 4). Ontleed en vaste volwassen lenzen (Figuur 5) werden vergeleken met transgene volwassen lenzen beeld levend (Figuur 6). Verschillen in detectie en visualisatie van specifieke delen van de lens met behulp van deze methoden zijn samengevat (tabel 1).

Phalloidin bleek superieur te zijn voor het labelen van lens Fiber celmembranen in zebravis in vergelijking met tarwekiem agglutinin (WGA). WGA is een lectine die aan N-acetyl-D-glucosamine en sialic zuur bindt, en WGA die aan fluorophores wordt vervoegd wordt typisch gebruikt om de celmembranen van de vezel van de lens van het etiket in menselijke23, runderen24, schapen25, muis26, rat27 en zebravis28,29. Hier gebruiken we phalloidin op hele zebravis lenzen (Figuur 3, Figuur 5).

Embryonale en larvale zebravis larven tot 7 DPF zijn klein en doordringbaar genoeg om de penetratie van phalloidin in de lens buitenste cortex mogelijk te maken. Door 3 DPF de lenskern is compact en verstoken van organellen, anterior hechtingen vorm aan de voorste paal (Figuur 3a,B), en phalloidin is uitgesloten van de lenskern in een equatoriale optisch vliegtuig (figuur 3c,D). Phalloidin is waarschijnlijk uitgesloten van de kern als gevolg van de hoge verdichting van Fiber celmembranen, in overeenstemming met eerdere studies28. Echter, de buitenste cortex is gevisualiseerd in groot detail met deze kleuring (figuur 3c-F). In dwarsdoorsnede, nemen de vezel cellen een afgeplatte zeshoekige vorm, met langere brede kanten, en kortere smalle kanten op. Phalloidin sterk labels zowel de smalle en brede vezel celmembranen (figuur 3e-F) markeren de verdichting van de corticale vezel cellen tussen brede kanten. Deze organisatie is grotendeels onaangetast in aqp0a/b dubbele mutanten (Figuur 3b, D, F en H).

Mozaïek expressie van het trans gen (mApple vastgebonden aan de celmembraan door de CAAX motief gedreven door een 300 BP promotor regio van de menselijke βB1 crystallin promotor) sterk uitdrukt in lenzen vanaf 2 DPF. Het transgene is willekeurig geïntegreerd in het genoom wat resulteert in heterogene expressie van mApple. We tonen voorbeelden van een 3 DPF lens met sterke expressie in de cortex (Figuur 4) en expressie in delen van de kern (figuur 4D). De membraan marker is niet beperkt door permeabiliteit zoals phalloidin, dus het etiket van de lenskern. Mozaïeken (Figuur 4) gegenereerd door DNA-injecties die alleen worden uitgedrukt in een kleine subset van cellen zijn nuttig voor het analyseren van individuele cel morfologie ten opzichte van stabiele lijnen, die het label elke cel die uitdrukt βB1 Crystallin (Figuur 6). In TG (βB1cry: mAppleCAAX) mozaïeken de morfologie van de voorste hechting kan worden gevisualiseerd in z-projecties genomen op de voorste paal (figuur 4a,B). Merk op dat de morfologie van celmembranen verschilt van vaste lenzen gelabeld met phalloidin (Figuur 3a,B), en de aanwezigheid van subdomeinen in brede celmembranen (figuur 4a' witte pijlen) eerder geïdentificeerd in lenzen van andere soorten30 is zichtbaar. Echter, zwakkere etikettering van smalle vezels celmembranen resulteert in een onvermogen om de opvallende convergentie van de cellen te zien op de voorste hechting (figuur 4a,b pijl) gezien in vaste lenzen gelabeld met phalloidin (Figuur 3a,b pijlen).

Interessant is dat optische plakjes genomen op de lens evenaar ook een ander etiketterings patroon, met duidelijke verstoringen van de cel volume in de aqp0a/b dubbele mutanten in vergelijking met WT (figuur 4c-F). Dit is waarschijnlijk omdat de transgene etiketten brede vezel celmembranen effectiever dan phalloidin. We waren in staat om z-projecties te verkrijgen via de achterste paal om de integriteit van de achterste hechting te analyseren met het gebruik van Z-correctie, die laservermogen verhoogd met diepte in weefsel. Duidelijke analyse van de achterste hechting (figuur 4G,H) in intacte vis was beperkt tot de eerste 5 DPF, en na dat de lens was te dicht, wat resulteert in verlies van het signaal in het achterste deel van de lens.

Vaste ontleed volwassen lenzen gelabeld met phalloidin onthulde opvallend detail in de zeer bestelde architectuur van Fiber cel rijen convergeren naar anterior hechtingen vorm (figuur 5a, pijl) en de morfologie van de cortex (figuur 5c-H), door de zeer sterke etikettering van smalle vezel celmembranen door phalloidin. Maximum Z-projecties van de voorste paal onthuld verlies van een strakke voorste hechtdraad in aqp0a/b dubbele Mutant lenzen (Figuur 5b, pijl), in vergelijking met WT (figuur 5a, pijl), die duidelijk als een massa van membranen en cel kernen in optische plakjes 30 µm van de voorste paal (figuur 5d). In diepere optische segmenten werd phalloidin labeling uitgesloten van de diepere lens cortex en kern (figuur 5e,F). De algehele organisatie van Fiber cel rijen in de buitenste cortex was enigszins beïnvloed door het ontbreken van een strakke voorste hechting in aqp0a/b dubbele Mutant lenzen, waardoor het onmogelijk is om lenzen positie precies loodrecht op de Imaging vliegtuig (figuur 5F ) vergeleken met WT lenzen (figuur 5e). Echter, hoge macht beelden van Fiber cel rijen genomen in het equatoriale vliegtuig bleek dat cellen in de buitenste cortex nog steeds geordende rijen gevormd, zichtbaar als gevolg van sterke smalle vezel cel etikettering (figuur 5g,H). Het was onmogelijk om individuele vezel cellen brede membranen te wijten aan een combinatie van hun strakke verdichting, en zwak signaal te onderscheiden. Aangezien deze lenzen werden ontleed, konden ze worden gemonteerd met de achterste zijde geconfronteerd met de doelstelling, waardoor z-projecties van de achterste hechtingen, die geen verschillen tussen de genotypen als posterior Fiber Cell tips gevormde strakke hechtingen toonde (figuur 5I,J pijlen).

Z-projecties van lenzen van Live verdoofd volwassen stabiel TG (βB1cry: mAppleCAAX) vis onthullen corticale membraan morfologie in de voorste cortex (Figuur 6a,a '), evenals de omvang van de cel convergentie op de voorste paal ( Figuur 6B). Het was moeilijker om de vis te monteren met lens hechtingen loodrecht op de Imaging vliegtuig, in vergelijking met vaste ontleed lenzen. Stabiele lijnen die de transgene Express mApple in de lenskern dragen (figuur 6C,D). Optische plakjes op de evenaar bleek een sterk signaal met vermelding van uitgebreide verdichting van de kern wanneer afgebeeld met dezelfde laservermogen als de voorste cortex (figuur 6C). Interessant, was geen cellulaire resolutie van de buiten schors duidelijk bij volwassenen, in tegenstelling tot in embryo's. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de Iris het blokkeren van een duidelijk signaal van de lens periferie. Het kan mogelijk zijn om een sterkere lens corticale signaal te verkrijgen door uitzetting van de leerling voorafgaand aan de beeldvorming. Met verminderde laservermogen, was het mogelijk om een aantal cel lagen te onderscheiden in de lenskern (figuur 6d). De volwassen zebravis lens is zeer dicht, en het was onmogelijk om het signaal te verkrijgen van de achterste paal in vivo.

We hebben aangetoond dat de zebravis lens Nucleus beweegt in de optische as van een initiële voorste positie in larvale lenzen naar een centrale positie bij volwassenen1. Deze bewegingen zijn gemarkeerd in axiale lens secties, zoals phalloidin en WGA zijn uitgesloten van de lenskern (Figuur 7A-C). We hebben aangetoond dat Aqp0a is vereist voor dit centralisatie proces1, maar dit mechanisme zal waarschijnlijk worden beïnvloed door andere eiwitten. De lokalisatie van het centrum van de lenskern in relatie tot zijn positie langs de voorste-posterior as werd gemeten door het plaatsen van ontleed hele lenzen in hun axiale oriëntatie en beeldvorming onder DIC verlichting, waardoor de nadruk kleine verschillen in refractieve eigenschappen (figuur 7e). De hechtingen hebben meestal een andere brekingsindex dan de omliggende cortex, dus kan worden gebruikt als leidraad voor oriëntatie. Jonge larvale lenzen hebben meer voor de hand liggende hechtingen (posterior hechtingen in zeer jonge lenzen), en de lens kernen, die een andere brekingsindex hebben, zijn uiteraard asymmetrisch, waardoor het makkelijker om lenzen oriënteren in deze stadia. De relatieve afstand van het midden van de lenskern van het midden van de lens (r) is genormaliseerd om de lens straal (a). Dit wordt dan gefotografeerd met betrekking tot zebravis ontwikkeling, waarvoor de standaard lengtemeting wordt gebruikt13. In WT, de lens Nucleus begint dichter bij de voorste lens Pole Equation 2 , en dan centraliseert Equation 3 in de volwassenheid (figuur 7F).

Figure 1
Figuur 1 : Zebravis volwassen oog en lens diagram. Anterior is genomen als waar het licht komt in het oog, die in de zebravis is eigenlijk laterale. (A) de zebravis lens samen met het hoornvlies focus licht op het netvlies. In aquatische dieren, het hoornvlies speelt een kleine rol in het lichtbreking, maar in plaats daarvan, de lens heeft een hogere brekingsindex18. De lens scheidt de voorste kamer gevuld met waterige humor en achterste kamer gevuld met glasvocht. (B) de zebravis lens is sferischer dan zoogdieren lenzen. Fiber Cell tips ontmoeten op punt of navelstreng hechtingen8 op de voorste en achterste palen. Differentiëren vezel cellen in de lens cortex hebben kernen en organellen, terwijl de rijpe vezels cellen in de lenskern (licht blauw) zijn verstoken van organellen en kernen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.    

Figure 2
Figuur 2 : Zebravis lens dissectie. (A) ogen worden ontleed uit verdoofd vis en geplaatst posterior zijde omhoog (B). (C) ogen worden immobiled door een tang via de optische schijf (OD) en twee tot drie radiale incisies zijn gemaakt in Retina en Sclera van de optische schijf naar de zonules. (D) Vouw de flappen uit om de lens te onthullen. (E) draai het oog om het hoornvlies omhoog, immobiliseren de lens indirect via het hoornvlies en trek de Sclera-retina. (F) trim weg resterende netvlies en trilhaar zone/zonules van de lens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Embryonale lens morfologie in vitro. Vaste en permeabilized embryo's gelabeld met phalloidin (rood) en celkern met DAPI (blauw) onthullen de membraan morfologie en hechting aan de Polen. Z-projecties blijkt dat WT en aqp0/b dubbele Mutant lenzen vertonen zeer regelmatige vezel cellen regeling die voldoen aan een zeer strakke voorste hechting (pijlen) op 3 DPF (a, b). Optische plakjes genomen op de evenaar onthullen strakke rijen van zeshoekige vezel cellen verpakt in de buitenste cortex in beide genotypen (C-F). Beide, smalle en brede zijden van de vezel celmembranen worden geëtiketteerd zoals aangegeven in (E). Posterior hechtingen (pijlen) worden gevormd en strak in beide genotypen (G, H). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Embryonale lens morfologie in vivo. Live beeldvorming van verdoofd 3 DPF mozaïek F0 geïnjecteerd TG (βB1cry: mAppleCAAX) lenzen onthullen voorste hechtingen (pijlen) in z-projecties (a, B). (a ') Membraan subdomeinen zijn duidelijk als puncta (witte pijlen) in de brede vezel celmembranen. Narrow Fiber celmembranen zijn ook duidelijk (zwarte pijlen). WT lenzen onthullen strak verpakt lens corticale Fiber cellen (C, E), in vergelijking met verstoorde cortex van aqp0a/b dubbele mutanten- met duidelijke gezwollen cellen (D, F). Het scherpstellen op posterior (g, h) hechtingen (pijlen) onthult geen verschil tussen de genotypen (g, h). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 : Volwassen lens morfologie in vitro. Geaccijnsde, vaste en permeabilized lenzen van vis boven 23 mm standaard lengte werden geëtiketteerd met phalloidin (rood) en DAPI (blauw). 150 µm Z-projectie op de voorste paal onthullen strikte regeling van Fiber Cell tips convergerende op een strakke hechting (pijl) in WT (a), maar niet aqp0a/b dubbele mutanten (pijl), die in plaats daarvan hebben een massa van membranen en kernen (b). Een optische slice genomen 42 µm van de voorste paal onthullen bestelde cellen convergeren in het centrum in WT (C), maar een massa van kernen waar de hechtdraad moet worden in Mutant lenzen (D). Optische schijfjes door de evenaar van de lens, op 130 µm van de voorste paal onthullen strak verpakt rijen van vezel cellen in WT (E, G) en mutanten (F, H). Posterior hechtingen (pijlen) worden gevormd en strak in beide genotypen (I, J). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6 Volwassen lens morfologie in vivo. Live beeldvorming van verdoofd volwassen stabiel TG (βB1cry: mAppleCAAX) WT lenzen. Z-projecties op de voorste cortex onthullen corticale morfologie (a, a '), en voorste hechting (pijl), met cellen convergeren naar een punt in een optische slice (B, Arrow). De cortex kan worden gevisualiseerd bij hogere laservermogen in een optische slice door de evenaar (C), in vergelijking met de sterkere signaalvorm van de lenskern (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Zebravis lens Nucleus centralisatie. Vaste en cryoprotectede embryo's (a) en lenzen (B, C) waren axiaal Cryo-sectie en geëtiketteerd met phalloidin-546 (rood in a, b), DAPI (blauw in a, b) of WGA-594 (rood in C). De lenskern is verstoken van cel kernen, en is dichter bij de voorste (a) lens geplaatst op 3 DPF (a), en in 1 maand oude lenzen (B), in vergelijking met centraal geplaatst in volwassen lenzen (C). Ontleed lenzen van een 1 maand oude zebravis van 4,1 mm standaard lengte waren Equatoriaal georiënteerd (D), of axiaal (E). De relatieve lokalisatie van de lenskern in de as werd berekend met behulp van de volgende strategie: (E) de afstand van het centrum (*) van de lenskern (witte stippellijn) werd gemeten aan de voorste paal, als deze praktischer dan het meten van de afstand (r) naar het midden van de lens (plus). Dit werd genormaliseerd om de lens RADIUS (a), die aanvankelijk werd gemeten als de axiale (Ant.-POS.) lens diameter. De log van de genormaliseerde axiale Nucleus lokalisatie werd gefotografeerd als een functie van zebravis ontwikkeling, gemeten door de standaard lengte (F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Functie IHC embryo GS embryo Hele IHC Adult lens GS volwassen
Live N Y N Y
Voorste hechting Y Enigszins Y Enigszins
Posterior hechting Y Y Y N
Corticale cellulaire detail Enigszins Y Y Anterior enigszins
Lens Nucleus detail N Y (stabiel) N Y (stabiel)
Secundair label Y-antilichamen Leef slechts met slechts TG Y-antilichamen Leef slechts met slechts TG
Brede/smalle vezel label Zowel Brede Meestal smal Brede

Tabel 1: samenvatting van de vergelijking van in vivo versus in vitro methoden voor de analyse van de lens morfologie in zebravis. Y = Ja, N = Nee

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse van de zebravis lens morfologie is de eerste stap in het begrijpen van fenotypen in mutanten, of de effecten van farmacologische interventies gericht op het bestuderen van de biologie van de oculaire lens. We schetsen methoden om lens hechtingen, corticale Fiber Cell morfologie en aspecten van de lens Nucleus te analyseren. Deze benaderingen zijn een combinatie van in vitro en in vivo (vergeleken in tabel 1). De in vitro methoden zorgen voor meer detail van de buitenste corticale cel morfologie, evenals de toegang tot de achterste hechting in volwassen lenzen.

In vivo analyse is mogelijk met het gebruik van transgene markers. De trans Gene we hier introduceren is lens membraan specifiek, in vergelijking met de bestaande Q01 zebravis lijn, die, terwijl de etikettering van de lens membranen ook labels andere cel types in het oog, met inbegrip van amacrine cellen, complicerende interpretatie11 . Het in vivo signaal wordt beperkt door de gepigmenteerde epitheel van het oog, die zich vormt tijdens de tweede dag van embryogenese, dus embryo's moeten worden Pte behandeld voor analyse in deze en latere stadia. Bij volwassenen, de Iris verduistert duidelijke analyse van de lens cortex, maar zorgt voor in vivo analyse van de voorste lens cortex. Live beeldvorming van vis lenzen zorgt voor longitudinale studies van de lens morfologie in hetzelfde dier. Dit kan een uiterst nuttig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van gevolgen voor dynamische processen, zoals de verstoring van het volume van de cel in reactie op osmotische of farmacologische verstoringen. Een onverwachte bevinding is dat we de membraan subdomeinen in brede Fiber celmembranen duidelijk kunnen visualiseren in de levende larvale transgenes, maar niet in vaste lenzen. Dit benadrukt het verschil in etikettering door het transgene-en phalloidin, evenals het feit dat deze subdomeinen door het fixatie proces kunnen worden beïnvloed.

Analyse van de moleculaire mechanismen van de lens Nucleus centralisatie met behulp van de methoden die we beschrijven kunnen mechanismen van essentieel belang voor de ontwikkeling van de lens optische eigenschappen te ontdekken. Hoewel, tot op heden, axiale lens Nucleus asymmetrie is alleen gemeld in zebravis, door het bestuderen van dit proces zijn we waarschijnlijk inzicht te krijgen in de mechanismen die nodig zijn voor de ontwikkeling van lens optica in andere soorten. In de toekomst kunnen de transgene dieren worden gebruikt in combinatie met andere toepassingen-zoals overexpressie studies, met het gebruik van een groene Transgenesis marker. Deze kunnen worden gebruikt om effecten te bestuderen van het overexpresseren van een specifiek eiwit in de lens, of voor het redden van fenotypen in bestaande mutanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben geen onthullingen.

Acknowledgments

We willen graag onze financiële bron te erkennen: NIH R01 EY05661 aan J. E. H, Ines Gehring voor het assisteren bij het genereren van de aqp0a/b dubbele mutanten en zebravis veeteelt, Dr Daniel Dranow voor discussies die leiden tot generatie van de transgenes, Dr Bruce Blumberg en Dr Ken Cho Labs voor het gebruik van hun ontleden microscopen, en Dr Megan Smith voor hulp bij statistische analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Tags

Biologie zebravis lens lens hechting lens Nucleus AQP0 MIP Live Imaging lens ontwikkeling transgene
Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vorontsova, I., Hall, J. E.,… More

Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter