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Biology

Evaluación de la localización del núcleo de la lente de pez zebrafish y integridad sutural

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Estos protocolos se desarrollaron para analizar la morfología de las lentes corticales, la integridad estructural de las lentes de pez cebra en lentes fijas y vivas y para medir la posición del núcleo de la lente de pez cebra a lo largo del eje anterior-posterior.

Abstract

El pez cebra es especialmente adecuado para la manipulación genética y la imagen in vivo , convirtiéndolo en un modelo cada vez más popular para estudios genéticos inversos y para la generación de transgénicos para imágenes in vivo . Estas capacidades únicas hacen que el pez cebra sea una plataforma ideal para estudiar el desarrollo de lentes oculares y la fisiología. Nuestros hallazgos recientes que un Aquaporin-0, Aqp0a, es necesario para la estabilidad de la sutura de la lente anterior, así como para el cambio del núcleo de la lente al centro de la lente con la edad nos llevó a desarrollar herramientas especialmente adecuadas para el análisis de las propiedades de las lentes de pez cebra. Aquí describimos métodos detallados para la disección de lentes que se pueden aplicar tanto a las lentes larvaria como a las adultas, para prepararlas para el análisis histológico, la inmunohistoquímica y las imágenes. Nos centramos en el análisis de la integridad de la sutura de la lente y la morfología de las células corticales y comparamos los datos generados a partir de lentes diseccionadas con datos obtenidos de imágenes in vivo de morfología de lentes hechas posibles por una novela línea de pez cebra transgénica con un marcador fluorescente codificado. El análisis de las lentes diseccionadas perpendiculares a su eje óptico permite cuantificar la posición relativa del núcleo del objetivo a lo largo del eje anterior-posterior. Se requiere el movimiento del núcleo de la lente desde una posición anterior inicial hasta el centro para la óptica de lente normal en el pez cebra adulto. Por lo tanto, una medida cuantitativa de la posición nuclear de la lente se correlaciona directamente con sus propiedades ópticas.

Introduction

El pez cebra es un excelente modelo para el estudio del desarrollo de lentes y la fisiología debido a las similitudes anatómicas con las lentes de mamíferos, la relativa facilidad de manipulación genética y farmacológica, la velocidad del desarrollo embrionario de los ojos, el tamaño pequeño y la transparencia en etapas tempranas que permiten la creación de imágenes in vivo . Los métodos descritos aquí se desarrollaron para analizar la morfología de las lentes de pez cebra en etapas embrionarias y adultas con un enfoque en la integridad sutural, la morfología de la membrana cortical in vitro e in vivo, y la ubicación de la posición nuclear de la lente a lo largo del eje anterior-posterior ex vivo. Estos métodos sirven como punto de partida para estudios funcionales de desarrollo de lentes y fisiología, así como pantallas genéticas inversas para fenotipos de lentes en pez cebra.

Morfología de lente de pez cebra de imagen

Aquaporin 0 (AQP0) es la proteína de membrana de lente más abundante y es fundamental para el desarrollo de lentes y la claridad, debido a múltiples funciones esenciales en los mamíferos. El pez cebra tiene dos Aqp0s (Aqp0a y Aqp0b) y hemos desarrollado métodos para analizar la pérdida de sus funciones tanto en lentes embrionarias como adultas. Nuestros estudios revelan que aqp0a-/-los mutantes desarrollan opacidad polar anterior debido a la inestabilidad de la sutura anterior, y los mutantes dobles aqp0a/b desarrollan opacidad nuclear1. Se ha demostrado que AQP0 juega papeles en el transporte de agua2, la adherencia3,4, el anclaje citoesquelético5 y la generación del índice de refracción gradiente6, pero estos estudios se han realizado en gran parte en Vitro. El pez cebra proporciona una oportunidad única para estudiar cómo la pérdida de la función, o la función perturbada de Aqp0a o Aqp0b afectaría la morfología y la función en un lente vivo. Para evaluar la morfología de las células de los lentes y la integridad sutural durante el desarrollo, modificamos los métodos inmunohistoquímicos in vitro existentes7 para su uso en lentes embrionarias y adultas, y generamos transgénicos para monitorear este proceso in vivo .

El análisis inmunohistoquímico de la estructura de la membrana plasmática y la integridad sutural se realizó en embriones fijos enteros y lentes para adultos. Las lentes de pez cebra son extremadamente pequeñas (el diámetro de la lente es de ~ 100 μm en embriones y hasta 1 mm en adultos) en comparación con sus homólogos de mamíferos y tienen suturas puntuales8, que se capturan con poca frecuencia en las criáreas. Por lo tanto, las lentes enteras son esenciales para analizar la integridad sutural. Para el análisis in vivo de la formación de sutura anterior, y la creación de imágenes de la arquitectura precisa de células de lentes, generamos transgénicos expresando Mapple específicamente las membranas de los lentes.

Las ventajas de la imagen en vivo de transgénicos de membrana de lente incluyen: 1) evitar artefactos de fijación, 2) estudiar cambios morfológicos dinámicos en películas de lapso de tiempo, y 3) permitir estudios longitudinales en los que los eventos anteriores pueden correlacionarse con más adelante Fenotipos. La pigmentación del iris normalmente previene imágenes claras de la periferia de la lente. La adición de 1-fenil 2-tiourea (PTU) antes de la fase9 de primordia-5 (Prim-5) previene la melanogénesis y la pigmentación ocular hasta alrededor de 4 días de postfertilización (DPF). Sin embargo, después de 4 DPF, la periferia de la lente está oscurecida in vivo, particularmente en las etapas más antiguas. Además, la densidad de la lente en sí oscurece la imagen de su polo posterior. Por lo tanto, para estudiar la morfología de la periferia de la lente, o la sutura posterior, después de 4 DPF, las lentes deben ser extirpado y fijas.

Se han utilizado líneas de pez pez cebra transgénicos para analizar la estructura de la membrana de la lente embrionaria in vivo10. El Q01 transgénico expresa una proteína fluorescente cian fusionada a una secuencia de objetivo de membrana, Gap43, impulsada por el promotor EF1α y un hexámero del elemento DF4 PAX6 Enhancer ubiadamente en las células de fibra de lente11. El Q01 tiene una expresión extra-lenticular, incluyendo células amacrinas en la retina, que añade señal de fondo si el interés principal es la lente. Desarrollamos una novedosa línea transgénica que expresa un mApple de membrana atada específicamente en la lente, con el objetivo de evitar cualquier señal extra-lenticular.

Localización del núcleo de la lente

Descubrimos que el núcleo de la lente se mueve desde una ubicación anterior inicial en el pez cebra de la larval hasta una ubicación central en el eje anterior-posterior en lentes adultas. Este cambio en la posición del núcleo del objetivo de alto índice de refracción se cree que es un requisito para el desarrollo normal de la óptica de la lente de pez cebra1. Nuestros métodos permiten la cuantificación de la centralización nuclear de la lente en relación con el radio de la lente. Usando este método, mostramos que Aqp0a es necesario para la centralización nuclear de la lente1, y este método simple se puede aplicar a otros estudios del desarrollo y la fisiología de la lente y sus propiedades ópticas en el modelo de pez cebra.

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Protocol

Los protocolos animales utilizados en este estudio se adhieren a la declaración ARVO para el uso de animales en Oftalmología y la investigación de la visión y han sido aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de California, Irvine.

1. la cría de peces de cebra y la eutanasia

  1. Levante y mantenga el pez cebra (cepa AB) en condiciones de laboratorio estándar12. Criar embriones en medio embrionario (EM)12. Añadir 0,003% PTU a EM de 20-24 h postfertilización (antes de la etapa Prim-5) para prevenir la formación de pigmentos en embriones12 utilizados para la toma de imágenes en etapas embrionarias9. Elevar las larvas de 6-30 días de postfertilización (DPF) en una dieta de rotíferos vivos hasta 14 DPF, y vivas Artemia después de 14 DPF12.
    PRECAUCIÓN: La PTU es muy tóxica
  2. Anestesiar el pescado usando tricaína hasta que no responda al tacto.
    1. Preparar el caldo de Tricaine combinando 400 mg de acidethylester 3-amino benzoico, con 2,1 mL de Tris de 1 M (pH 9), en 100 mL de ddH2O. ajustar a pH 7,0 y almacenar a-20 ° c.
      PRECAUCIÓN: La Tricaine es tóxica.
    2. Diluir 4,2 mL de caldo de Tricaine en 100 mL de agua del tanque para anestesiar larvas/adultos o en EM para anestesiar embriones (concentración final de tricaína en 0,0165% p/v).

2. fijación de embriones y larvas

Nota: Los protocolos inmunohistoquímicos fueron adaptados de los materiales publicados anteriormente7.

  1. Fijar embriones o larvas dechorionated hasta 2 semanas de postfertilización en 4% (v/v) paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada de fosfato (PBS) durante la noche a 4 ° c en un Rocker.
    PRECAUCIÓN: La PFA es combustible y es cancerígeno.
  2. Lavar los embriones tres veces durante 10 min en PBS, y permeabilizar en PBS con 10% Tritón y 1% DMSO (PBS-T) durante la noche a 4 ° c.
    PRECAUCIÓN: La DMSO es tóxica, es perjudicial por ingestión o absorción de la piel, transporta materiales peligrosos a través de la piel y es combustible. Tritón es tóxico, corrosivo y es peligroso para los ambientes acuáticos.

3. disección de lentillas de larval y de pez cebra adulta

  1. Anestesiar el pez de 6 larvas de DPF hasta la adultez con tricaína hasta que no responda al tacto, pero que aún muestre un latido cardíaco fuerte. Mida la longitud estándar del pez según Schilling (2002) para la puesta en escena13.
  2. Inmediatamente los ojos se usan con tijeras de microdisección y se colocan en un plato de disección en PBS (figura 2 para ojos adultos).
    1. Haga un plato personalizado de 35 mm lleno de silicona para disecciones de lentes. Una vez que la silicona se ha fijado, el consumo de un divot alrededor de 2-3 mm de diámetro y 0,5 mm de profundidad para ininmovilizar ojos/lentes adultos durante la disección.
  3. Disección de lentes de pez cebra adultos
    1. Coloque un ojo de adulto en el plato divot posterior lado arriba lleno de PBS. Inmovilizar el ojo insertando fórceps a < ángulo de 45 ° a través del disco óptico. Tenga cuidado de no rasguño ni comprimir la lente. Realice dos o tres incisiones radiales a través de la retina y la esclerótica desde el disco óptico hasta la zona ciliaria con las tijeras de disección.
    2. Pela la retina y la esclerótica como pétalos de flores e invierte el ojo, con el lado corneal hacia arriba. Inmovilizar la lente indirectamente a través de la manipulación de la esclerótica y la córnea con el lado plano de las tijeras, mientras que la extracción de la retina y los tejidos Unidos con fórceps. Recorte cuidadosamente el exceso de tejido de la lente.
      Nota: Es vital diseccionar cuidadosamente para obtener lentes saludables consistentemente.
  4. Disección de las lentes de pez cebra de larval
    1. Coloque un lado posterior del ojo larval hacia arriba en la parte plana del plato de silicona lleno de PBS y utilice una aguja de tungsteno afilada para hacer cortes radiales a través de la retina y la esclerótica mientras inmovilizar el ojo con otra aguja de tungsteno o fórceps.
      Nota: Tenga cuidado de no dañar la lente.
      1. Afilar la punta de una longitud de 2 cm de 0,1 mm de alambre de tungsteno electrolíticamente suspendiendo la punta del alambre en un 10% (w/v) NaOH y aplicando una corriente alterna de baja tensión14. Fije la aguja en una Piera Pasteur fundiendo el extremo de cristal con un quemador Bunsen.
        Nota: También se pueden utilizar herramientas de disección fina alternativa.
        PRECAUCIÓN: NaOH es corrosivo.
    2. Saque suavemente la lente del ojo disociado con un lado Romo de la aguja, y tire cuidadosamente del tejido adjunto.

4. fijación de las lentes diseccionadas

  1. Fije inmediatamente las lentes diseccionadas en 1,5% (v/v) PFA en PBS durante 24 h a temperatura ambiente (RT). Lave las lentes tres veces en PBS durante 10 min cada una.
  2. Permeabilizar las lentes para el análisis de montaje completo o criproteía para criseccionamiento (ver sección 8).
    1. Permeabilizar las lentes en PBS-T durante la noche a 4 ° c.

5. inmunohistoquímica de lentes

  1. Las membranas de la etiqueta de embriones fijos/larvas o lentes adultas por incubación en Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200 ) y núcleos celulares con DAPI (1:1000 de 5 mg/ml de stock) en PBS-T durante la noche a 4 ° c.
    PRECAUCIÓN: DAPI es un irritante de la piel y los ojos.
  2. Lavar tres veces con PBS-T durante 10 min cada uno. Tejido transparente por incubación en 30%, 50% y 70% glicerol en PBS-T (v/v) durante al menos 1 h en RT cada uno, o durante la noche a 4 ° c.
  3. Monte el pescado en el 70% de glicerol en PBS-T (v/v) sobre los platos de micropozo de fondo de vidrio de 35 mm con los ojos como planos y rectos contra el resguardo de la cubierta como sea posible. Para los peces más jóvenes, una ligera inclinación lateral anterior puede ayudar a orientar la sutura del objetivo para que sea paralela a la cobertura.

6. Análisis de las suturas de la lente anterior del pez cebra utilizando una línea transgénica en vivo

  1. Genere líneas TG (βB1cry: mAppleCAAX) utilizando el kit Tol215. El sistema de elementos transponibles Tol215 permite una integración estable de la construcción donde Mapple es impulsado por 300 BP del promotor de βb1-crystallin humano16 atado a la membrana por la secuencia caax que resulta en la expresión específicamente en membranas celulares de fibra óptica.
    Nota: Esta construcción (ID: 122451) está disponible para su compra.
    1. En la mañana de la inyección, prepare la mezcla de inyección y manténgase en hielo. Para alcanzar un volumen final de 10 μL que contenga RNasa-y sin DNase-H2O, añadir: 1,5 μl de Huβb1cry: construcción de ADN mAppleCAAX a 50 ng/μl-[0.375-0.75 PG/inyección final], 1,5 ΜL de Tol2 ARNm transposasa a 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 PG/ inyección final], y 1 μL de indicador rojo de fenol al 1% p/v [1 x10-5% (p/v)/inyección final].
    2. Inyectar 50-100 pL de mezcla de inyección en embriones de fase de 1 célula12.
  2. Mida la eficiencia de la transgénesis en los embriones inyectados F0 midiendo la frecuencia de los embriones con lentes positivos mApple a 3 DPF.
    Nota: Espere tener > 80% de eficiencia de transgénesis utilizando este método. Los mosaicos F0 permiten un análisis detallado de las morfologías de membrana de las células individuales. Los diferentes niveles de mosaicismo permiten a uno la imagen de las morfologías de grupos simples o pequeños de células, mientras que la expresión de lente más global permite el análisis de estructuras multicelulares como las suturas de lentes in vivo.
  3. Outcross F0 peces mosaico para generar líneas estables, que etiquetan todas las membranas de las células de fibra. Los fundadores de F0 con el transgénico integrado en la línea germinal generarán crías con integraciones estables que se pueden mantener como líneas transgénicas.

7. Análisis de las suturas de la lente anterior del pez cebra utilizando una línea transgénica en vivo

  1. Anestesiar 3 DPF o un mosaico adulto o pescado transgénico estable y montar en un 1% de agarosa de baja fusión (LMA) con tricaína con el ojo plano contra el resguardo de la tapa de los platos de micropozo de fondo de vidrio.
    1. Disolver 1 g de LMA en 100 mL de EM (sin azul de metileno) para hacer un 1% de LMA. Almacene a largo plazo como 15 mL de stocks a 4 ° c. Microondas para disolver el caldo y almacenarlo a 42 ° c hasta que se utilice cada tubo.
  2. Cubra los pescados hasta 6 DPF con EM con tricaína, o con agua de tanque con Tricaine para adultos cuando se establece LMA.
    1. Mezclar 5 mL de EM sin el azul de metileno o el agua del tanque con 250 μL de caldo de Tricaine y 7 μL de PTU si la toma de imágenes de peces tratados con PTU.

8. Criseccionadores de lentes e inmunohistoquímica

  1. Cryoprotect fija embriones o lentes adultos colocando en un 10% de sacarosa en PBS (w/v), 20% de sacarosa durante 1 h en RT cada uno (o durante la noche a 4 ° c) y durante la noche en un 30% de sacarosa a 4 ° c.
  2. Inserte el tejido en OCT en moldes de base, y luego congele sobre mandriles con OCT. Cryosection a 12-14 μm y recoger en un microscopio Superfrost/Plus diapositivas. Secciones cálidas en la diapositiva durante 10 min en un calentador de diapositivas precalentado a ~ 35 ° c.
  3. Lave las secciones tres veces con PBS durante 10 min cada una. Secciones de etiqueta con Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) con DAPI (1:1000) o WGA-Alexa Flour 594 (1:200), seguida de tres lavados PBS. Monte con medio de montaje anti-desvanecimiento y cierre de sellado con esmalte de uñas.

9. imágenes

  1. Adquiera imágenes con un microscopio confocal. Adquiera pilas z o cortes ópticos utilizando un objetivo de inmersión en agua de 60x N/A 1,2, o similar, en regiones específicas desde el poste de la lente anterior al posterior. Utilice los siguientes ajustes de adquisición: 1,2 disco ventilado con el láser 561 nm, filtro rojo de Texas para la harina de Phalloidin-Alexa 546 o mApple, o el láser 405 con el filtro UV para DAPI.
  2. Corrija la potencia del láser de intensidad z para contrarrestar la pérdida de señal con profundidad en la lente. Esto permite una señal fuerte en el polo posterior de embriones fijos y vivos de 3 DPF, y una fuerte señal en rodajas ópticas ecuatoriales en lentes de peces adultos.
  3. Compile y visualice imágenes utilizando software de procesamiento de imagen.

10. medición de la localización del núcleo de la lente en el eje anterior-posterior

  1. Orientar las lentes recién excizadas axialmente en PBS en un plato de 35 mm con fondo de cristal, con polos y suturas orientados paralelamente al plano de enfoque. Busque una diferencia en el índice de refracción, que suele producirse en la interfaz de la corteza del objetivo y el núcleo del objetivo para identificar el núcleo de la lente.
    Nota: Los lentes adultos sanos de tipo salvaje son extremadamente transparentes, lo que dificulta ver las suturas y el núcleo del objetivo, o determinar la orientación del objetivo. En este caso, un leve rasguño con fórceps a la cápsula de la lente causa daños leves, lo que hace que las suturas y el núcleo del objetivo sean evidentes en aproximadamente 10 minutos ayudando a orientar la lente para esta medición. Sin embargo, las lentes se vuelven inutilizables para las aplicaciones descendentes, ya que ahora están dañadas.
  2. Tome imágenes de lentes con el núcleo de la lente en foco bajo iluminación de campo brillante con o sin óptica de DIC usando un microscopio de disección con una cámara adjunta. Imagen de un micrómetro bajo el mismo aumento para la calibración.
    1. Haga clic en el botón de vista en vivo, ajuste la configuración de exposición para visualizar el núcleo de la lente y la periferia de la lente, y tome una imagen haciendo clic en el botón de disparo a presión. Guardar como un archivo TIF.
    2. Utilice el software de procesamiento de imagen para calibrar las imágenes de lentes adquiridas. Seleccione la herramienta de línea recta y dibuje una línea de longitud conocida en la imagen del micrómetro, haga clic en analizar | escala establecida. Ingrese la distancia conocida, las unidades y seleccione la calibración "global", y haga clic la autorización.
  3. Mida la distancia del centro del núcleo del objetivo al polo anterior (a-r).
    1. Utilice la herramienta de línea recta en el software de procesamiento de imágenes para dibujar una línea a través del centro imágenes del núcleo de la lente en una orientación axial. Tome el centro de esta línea como el centro del núcleo del objetivo.
    2. Dibuja otra línea desde este punto hasta el polo anterior de la lente y selecciona ' medir ' en el menú ' analizar ' para medir la distancia (a-r), donde a es el radio de la lente y r es la distancia desde el centro de la lente hasta el centro de la Núcleo.
    3. Dibuje otra línea desde la anterior hasta los polos posteriores y mida esta distancia como el diámetro de la lente (2A). Copie estas longitudes desde la ventana "resultados" y transfiera a una hoja de cálculo o programa de estadísticas.
      Nota: Es más fácil medir con precisión desde el centro del núcleo hasta el polo anterior, que la medición desde el centro del núcleo del objetivo hasta el centro de la lente. Esta medida se convierte por la fórmula en el paso 10.3.5 para informar de la distancia del centro del núcleo del objetivo al centro de la lente. Utilice siempre el núcleo adulto para las mediciones, incluso si el núcleo embrionario es evidente.
    4. Divida el diámetro por 2, para calcular el radio de la lente, a.
    5. Calcule r/a, como Equation 1 , que es la localización normalizada del núcleo de la lente con respecto al radio de la lente.
      Nota: para un núcleo colocado más cerca del polo anterior, r/a será > 0.0, mientras que un núcleo localizado centralmente tendrá un r/a de 0,0.
  4. Graficar el tronco de la medición normalizada del núcleo axial como una función de la longitud estándar para determinar los cambios en la localización del núcleo de la lente durante el desarrollo del pez cebra.

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Representative Results

La anatomía del ojo de pez cebra adulta se asemeja mucho a la de los mamíferos (figura 1A). A pesar de algunas diferencias entre el pez cebra y los ojos de los mamíferos, como tener una zona ciliaria en lugar de un cuerpo ciliario17, diferencias en las propiedades ópticas18, y diferencias en la morfogénesis durante el desarrollo embrionario19, el el ojo de pez de zebraes un excelente modelo para el estudio del desarrollo ocular y la comprensión de la enfermedad oftálmica20,21,22. Un simple epitelio líneas el polo anterior de la lente, que en el Ecuador sufre un proceso de toda la vida de proliferación, elongación, y la diferenciación en las células de fibra, constituyendo la mayor parte de la lente. Las células maduras de fibra (figura 1B, azul claro) primero se diferencian en el embrión, carecen de orgánulos y nunca se reemplazan. Diferenciando las puntas de las células de fibra se reúnen en los polos para formar las suturas anterior y posterior. Estas células son entonces internalizadas por las células de fibra recientemente diferenciadas. Al igual que todas las lentes vertebradas, la lente de pez cebra tiene un gradiente de desarrollo con las células más antiguas ubicadas en el centro del núcleo de la lente. La placode de lente de pez cebra se forma a 16 h postfertilización (HPF), que se alarga para formar las fibras de lente primarias a 18 HPF, y las fibras secundarias forman la zona de transición a 28-36 HPF. La sutura posterior es visible a 48 HPF, que es antes de que la sutura anterior se hace visible10.

El desarrollo y mantenimiento precisos de la arquitectura de lentes regulares es esencial para su óptica. Aquí describimos métodos para el análisis de la morfología de la célula de lente de pez cebra in vitro e in vivo, incluyendo ventajas y limitaciones, que desarrollamos para analizar fenotipos resultantes de la pérdida de mutantes de función de dos Aqp0s de pez cebra, Aqp0a y Aqp0b1. Para la evaluación de la morfología de la lente adulta in vitro, las lentes se diseccionaron (figura 2) y se corrigen inmediatamente. La evaluación embrionaria se llevó a cabo en embriones fijos enteros (figura 3) y en comparación con los embriones transgénicos vivos (figura 4). Las lentes para adultos diseccionadas y fijas (figura 5) se compararon con lentes adultas transgénicas en vivo (figura 6). Se resumen las diferencias en la detección y visualización de partes específicas de la lente utilizando estos métodos (tabla 1).

Phalloidin fue encontrado para ser superior para el etiquetado de membranas celulares de fibra de lente en pez cebra en comparación con el germen de trigo aglutinina (WGA). WGA es una lectina que se une a N-acetil-D-glucosamina y ácido siálico, y WGA conjugada a fluoróforos se utiliza típicamente para etiquetar las membranas celulares de fibra de lente en humanos23, bovino24, ovino25, ratón26, rata27 y pez cebra28,29. Aquí usamos Phalloidin en lentes de pez cebra enteras (figura 3, figura 5).

Las larvas embrionarias y larvales de pez cebra de hasta 7 DPF son lo suficientemente pequeñas y permeables como para permitir la penetración de la falloidin en la corteza exterior de la lente. Por 3 DPF el núcleo de la lente es compacto y carente de orgánulos, las suturas anterior se forman en el polo anterior (figura 3a,B), y la Phalloidin se excluye del núcleo de la lente en un plano óptico Ecuatorial (Figura 3C,D). Es probable que la Phalloidin esté excluida del núcleo debido a la alta compactación de las membranas de las células de fibra, consistente con los estudios previos28. Sin embargo, la corteza exterior se visualiza con gran detalle con esta mancha (Figura 3C-F). En la sección transversal, las células de fibra toman una forma hexagonal aplanada, con lados anchos más largos y lados estrechos más cortos. Phalloidin etiqueta fuertemente las membranas estrechas y anchas de la célula de fibra (figura 3E-F) destacando la compactación de las células de fibra cortical entre los lados anchos. Esta organización no se ve afectada en gran medida por los mutantes dobles aqp0a/b (figura 3B, D, F y H).

La expresión de mosaico del transgén (mApple atada a la membrana celular por el motivo CAAX impulsado por una región promotora de 300 BP del promotor de cristulina βB1 humano) se expresa fuertemente en lentes a partir de 2 DPF. El transgén se integra aleatoriamente en el genoma, resultando en una expresión heterogénea de mApple. Mostramos ejemplos de una lente de 3 DPF con fuerte expresión en la corteza (figura 4) y expresión en partes del núcleo (Figura 4D). El marcador de membrana no está limitado por la permeabilidad como la Phalloidin, por lo que etiqueta el núcleo del objetivo. Los mosaicos (figura 4) generados por las inyecciones de ADN que solo se expresan en un pequeño subconjunto de células son útiles para analizar las morfologías celulares individuales en comparación con las líneas estables, que etiquetan cada célula que expresa la Cristulina βB1 (figura 6). En los mosaicos TG (βB1cry: mAppleCAAX) la morfología de la sutura anterior se puede visualizar en las proyecciones z tomadas en el polo anterior (figura 4a,B). Tenga en cuenta que la morfología de las membranas celulares difiere de las lentes fijas etiquetadas con Phalloidin (figura 3a,B), y la presencia de subdominios en las membranas celulares anchas (figura 4a' flechas blancas) previamente identificadas en lentes de otros especie30 es visible. Sin embargo, el etiquetado más débil de las membranas de las células de fibra estrecha resulta en una incapacidad para ver la sorprendente convergencia de las células en la sutura anterior (figura 4a, flechab ) vista en lentes fijas etiquetadas con Phalloidin (figura 3a,b flechas).

Curiosamente, las rodajas ópticas tomadas en el Ecuador de la lente también revelan un patrón de etiquetado diferente, con interrupciones obvias en el volumen de la célula en los mutantes dobles aqp0a/b en comparación con WT (figura 4C-F). Esto es probable porque las etiquetas transgénicas amplias membranas de células de fibra más eficazmente que la Phalloidin. Pudimos obtener proyecciones z a través del polo posterior para analizar la integridad de la sutura posterior con el uso de corrección Z, que aumentó la potencia del láser con profundidad en el tejido. Análisis claro de la sutura posterior (figura 4G,H) en el pescado intacto se limitó a los primeros 5 DPF, y después de que la lente era demasiado densa, lo que resulta en la pérdida de señal en la parte posterior de la lente.

Las lentes para adultos diseccionadas fijas etiquetadas con Phalloidin revelaron detalles llamativos en la arquitectura altamente ordenada de filas de células de fibra convergentes para formar suturas anterior (figura 5A, flecha) y morfología de la corteza (figura 5C-H), debido al etiquetado muy fuerte de las membranas de células de fibra estrecha por Phalloidin. Las proyecciones Z máximas del polo anterior revelaron la pérdida de una sutura anterior ajustada en lentes mutantes dobles aqp0a/b (figura 5b, flecha), en comparación con WT (figura 5A, flecha), que se evidencia como una masa de membranas y núcleos celulares en óptica rodajas de 30 μm del polo anterior (Figura 5D). En sectores ópticos más profundos, el etiquetado de Phalloidin se excluyó de la corteza de lente más profunda y del núcleo (figura 5e,F). La organización general de las filas de células de fibra en la corteza externa fue algo afectada por la falta de una sutura anterior apretada en lentes mutantes dobles aqp0a/b , lo que hace imposible colocar las lentes exactamente perpendiculares al plano de imagen (figura 5F ) en comparación con los objetivos WT (figura 5e). Sin embargo, las imágenes de alta potencia de las filas de células de fibra tomadas en el plano ecuatorial revelaron que las células de la corteza exterior todavía formaban filas ordenadas, visibles debido al fuerte etiquetado estrecho de las células de fibra (figura 5g,H). Era imposible discernir membranas anchas de células de fibra individuales debido a una combinación de su compactación ajustada, y la señal débil. Dado que estas lentes se diseccionaron, podían montarse con el lado posterior orientado hacia el objetivo, lo que permitía proyecciones z de las suturas posteriores, que no mostraban diferencias entre los genotipos, ya que las puntas de las células de fibra posteriores formaban suturas apretadas (figura 5I,J flechas).

Z-proyecciones de lentes de peces estables adultos anestesiados TG (βB1cry: mAppleCAAX) revelan la morfología de la membrana cortical en la corteza anterior (figura 6A,a '), así como la extensión de la convergencia celular en el polo anterior ( Figura 6B). Era más difícil montar el pez con suturas de lente perpendiculares al plano de imagen, en comparación con las lentes diseccionadas fijas. Líneas estables que transportan el transgénico expreso mApple en el núcleo de la lente (Figura 6C,D). Las rebanadas ópticas en el Ecuador revelaron una señal fuerte que indica una amplia compactación del núcleo cuando se imagina con la misma potencia láser que la corteza anterior (Figura 6C). Curiosamente, ninguna resolución celular de la corteza externa era evidente en los adultos, a diferencia de los embriones. Esto es probablemente debido al iris bloqueando una señal clara de la periferia de la lente. Es posible obtener una señal cortical de lente más fuerte por dilatación de la pupila antes de la toma de imágenes. Con una potencia de láser reducida, era posible distinguir algunas capas celulares en el núcleo de la lente (figura 6D). La lente de pez cebra adulta es muy densa, y era imposible obtener la señal del poste posterior in vivo.

Hemos demostrado que el núcleo de la lente de pez cebra se mueve en el eje óptico desde una posición anterior inicial en lentes larvales hasta una posición central en adultos1. Estos movimientos están resaltados en secciones de lentes axiales, ya que la faloidin y la WGA están excluidas del núcleo de la lente (figura 7A-C). Hemos demostrado que Aqp0a es necesario para este proceso de centralización1, pero este mecanismo es probable que se vea afectado por otras proteínas. La localización del centro del núcleo de la lente en relación con su posición a lo largo del eje anterior-posterior se midió colocando lentes enteras diseccionadas en su orientación axial e imagen bajo iluminación DIC, destacando así ligeras diferencias en propiedades refractivas (figura 7E). Las suturas generalmente tienen un índice de refracción diferente que la corteza circundante, por lo que se puede utilizar como una guía para la orientación. Las lentes larvales jóvenes tienen suturas más obvias (suturas posteriores en lentes muy jóvenes), y los núcleos de lentes, que tienen un índice de refracción diferente, son obviamente asimétricos, lo que facilita la orientación de las lentes en estas etapas. La distancia relativa del centro del núcleo del objetivo desde el centro de la lente (r) se normaliza en el radio de la lente (a). A continuación, se graea con relación al desarrollo del pez cebra, para el cual se utiliza la medición de longitud estándar13. En WT, el núcleo del objetivo comienza más cerca del polo Equation 2 de la lente anterior, y luego Equation 3 se centraliza en la edad adulta (figura 7F).

Figure 1
Figura 1 : Ojo adulto de zebrafish y diagrama de lentes. Anterior se toma como donde la luz entra en el ojo, que en el pez cebra es en realidad lateral. (A) la lente de pez cebra junto con la luz de foco corneal en la retina. En los animales acuáticos, la córnea desempeña un papel menor en la refracción de la luz, pero en su lugar, el objetivo tiene un índice de refractividad18más alto. La lente separa la cámara anterior llena de humor acuoso y la cámara posterior llena de humor vítreo. (B) la lente de pez cebra es más esférica que las lentes de mamífero. Las puntas de las células de fibra se encuentran en puntos o suturas umbilicales8 en los polos anterior y posterior. La diferenciación de las células de fibra en la corteza del cristalino tiene núcleos y organelos, mientras que las células de fibra madura en el núcleo del cristalino (azul claro) carecen de orgánulos y núcleos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.    

Figure 2
Figura 2 : Disección de lentes de pez zebrafish. (A) los ojos se diseccionan del pescado anestesiado y se colocan en el lado posterior hacia arriba (B). (C) los ojos son inmovilizados por fórceps a través del disco óptico (OD) y se realizan de dos a tres incisiones radiales en la retina y la esclerótica desde el disco óptico a los zonules. (D) doblar las aletas para revelar la lente. (E) gire el ojo para enfrentar la córnea hacia arriba, inmovilizar la lente indirectamente a través de la córnea y tire hacia fuera de la esclerótica-retina. (F) recortar la retina restante y la zona ciliaria/zonules de la lente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Morfología de las lentes embrionarias in vitro. Los embriones fijos y permeabilizados etiquetados con Phalloidin (rojo) y núcleos celulares con DAPI (azul) revelan la morfología de la membrana y la integridad de la sutura en los polos. Las proyecciones Z revelan que las lentes dobles mutantes WT y aqp0/b exhiben una disposición de células de fibra muy regular que se encuentran en una sutura anterior muy apretada (flechas) a 3 DPF (a, b). Las rodajas ópticas tomadas en el Ecuador revelan filas estrechas de células de fibra hexagonal empaquetadas en la corteza externa en ambos genotipos (C-F). Ambos, lados estrechos y anchos de las membranas de las células de fibra se etiquetan como se muestra en (E). Las suturas posteriores (flechas) están formadas y ajustadas en ambos genotipos (G, H). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Morfología de lentes embrionarias in vivo. Imágenes en vivo de 3 DPF en mosaico F0 inyectado TG (βB1cry: mAppleCAAX) lentes revelan suturas anterior (flechas) en z-proyecciones (A, B). (a ') Los subdominios de membrana son evidentes como puntos (flechas blancas) en las membranas de células de fibra ancha. Las membranas de las células de fibra estrecha también son evidentes (flechas negras). Las lentes WT revelan células de fibra cortical de lente estrechamente empaquetadas (C, E), en comparación con la corteza interrumpida de mutantes dobles aqp0a/b , con células hinchadas evidentes (D, F). El enfoque en las suturas (g, h) posteriores (flechas) no revela ninguna diferencia entre los genotipos (g, h). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Morfología de la lente adulta in vitro. Las lentes excised, fijas y permeabilizadas de peces de más de 23 mm de longitud estándar fueron etiquetadas con Phalloidin (rojo) y DAPI (azul). 150 μm Z-proyección en el polo anterior revelar la disposición estricta de las puntas de las células de fibra convergentes en una sutura apretada (flecha) en WT (a), pero no aqp0a/b dobles mutantes (flecha), que en su lugar tienen una masa de membranas y núcleos (b). Una rebanada óptica tomada 42 μm del polo anterior revelan células ordenadas convergiendo en el centro en WT (C), pero una masa de núcleos donde la sutura debe estar en lentes mutantes (D). Las rebanadas ópticas a través del Ecuador de la lente, a 130 μm del polo anterior revelan hileras de células de fibra estrechamente embaladas en WT (E, G) y mutantes (F, H). Las suturas posteriores (flechas) están formadas y ajustadas en ambos genotipos (I, J). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 Morfología de lente adulta in vivo. Imágenes en vivo de lentes de peso estable para adultos anestesiados TG (βB1cry: mAppleCAAX) WT. Las proyecciones Z en la corteza anterior revelan la morfología cortical (a, a '), y la sutura anterior (flecha), con células convergentes a un punto en un solo trozo óptico (B, flecha). La corteza se puede visualizar a una potencia láser más alta en una rebanada óptica a través del Ecuador (C), en comparación con la señal más fuerte de la forma del núcleo del objetivo (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Centralización del núcleo de la lente de pez zebrafish. Los embriones fijos y crioprotegidos (a) y los lentes (B, C) fueron crioseccionados axialmente y etiquetados con Phalloidin-546 (rojo en a, b), DAPI (azul en a, b) o WGA-594 (rojo en C). El núcleo de la lente está desprovisto de núcleos celulares, y se coloca más cerca de la lente anterior (a) a 3 DPF (a), y en lentes de 1 mes de edad (B), en comparación con ser colocado centralmente en lentes adultas (C). Las lentes diseccionadas de un pez cebra de 1 mes de edad de 4,1 mm de longitud estándar se orientaron ecuatorialmente (D), o axialmente (E). La localización relativa del núcleo de la lente en el eje se calculó utilizando la siguiente estrategia: (E) la distancia del centro (*) del núcleo de la lente (línea punteada blanca) se midió al polo anterior, ya que esto es más práctico que medir el distancia (r) al centro de la lente (más). Esto se normalizó al radio de la lente (a), que se midió inicialmente como el diámetro de la lente axial (Ant.-pos.). El tronco de la localización del núcleo axial normalizado se grafió como una función del desarrollo del pez cebra, medido por la longitud estándar (F). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Característica El embrión de IHC TG embrión Lente para adultos IHC completa TG Adult
Vivir N Y N Y
Sutura anterior Y Algo Y Algo
Sutura posterior Y Y Y N
Detalle celular cortical Algo Y Y Anterior algo
Detalle del núcleo del objetivo N Y (estable) N Y (estable)
Etiqueta secundaria Los anticuerpos Y Vive sólo con TG Los anticuerpos Y Vive sólo con TG
Etiqueta de fibra ancha/estrecha Ambos Amplio La mayoría estrechas Amplio

Tabla 1: Resumen de la comparación de los métodos in vivo vs in vitro para el análisis de la morfología del cristalino en el pez cebra. Y = sí, N = no

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Discussion

El análisis de la morfología de las lentes de pez cebra es el paso inicial en la comprensión de los fenotipos en los mutantes, o los efectos de las intervenciones farmacológicas destinadas a estudiar la biología de la lente ocular. Describimos métodos para analizar suturas de lentes, morfología de células de fibra cortical y aspectos del núcleo de la lente. Estos enfoques son una combinación de in vitro e in vivo (comparado en el cuadro 1). Los métodos in vitro permiten un mayor detalle de la morfología de la célula cortical externa, así como el acceso a la sutura posterior en lentes adultas.

El análisis in vivo es posible con el uso de marcadores transgénicos. El transgén que introducimos aquí es específico de la membrana de la lente, en comparación con la línea existente de los peces Q01 , que al etiquetar las membranas de la lente también etiqueta otros tipos celulares en el ojo, incluyendo células amacrinas, complicando la interpretación11 . La señal in vivo está limitada por el epitelio pigmentado del ojo, que se forma durante el segundo día de la embriogénesis, por lo que los embriones deben ser tratados con PTU para su análisis en esta y etapas posteriores. En los adultos, el iris oscurece el análisis claro de la corteza del cristalino, pero permite el análisis in vivo de la corteza de la lente anterior. La imagen en vivo de las lentes de pescado permite estudios longitudinales de la morfología de la lente en el mismo animal. Esto puede ser una herramienta muy útil para estudiar los efectos sobre los procesos dinámicos, como la interrupción del volumen celular en respuesta a perturbaciones osmóticas o farmacológicas. Un hallazgo inesperado es que podemos visualizar claramente los subdominios de membrana en las membranas de células de fibra ancha en los transgénicos larvales vivos, pero no en lentes fijas. Esto pone de relieve la diferencia en el etiquetado por el transgén y la faloidin, así como el hecho de que estos subdominios pueden verse afectados por el proceso de fijación.

El análisis de los mecanismos moleculares de la centralización del núcleo de la lente utilizando los métodos que describimos puede revelar mecanismos esenciales para el desarrollo de las propiedades ópticas de la lente. Aunque, hasta la fecha, la asimetría del núcleo de la lente axial sólo se ha reportado en el pez cebra, al estudiar este proceso es probable que ganemos conocimiento de los mecanismos requeridos para el desarrollo de la óptica de la lente en otras especies. En el futuro, los animales transgénicos pueden utilizarse en combinación con otras aplicaciones, como los estudios de sobreexpresión, con el uso de un marcador de transgénesis verde. Estos podrían ser utilizados para estudiar los efectos de la sobreexpresión de una proteína específica en la lente, o para el rescate de fenotipos en mutantes existentes.

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Disclosures

No tenemos divulgaciones.

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer nuestra fuente de financiación: NIH r01 EY05661 a j. e. h., Inés Gehring para ayudar con la generación de los aqp0a/b dobles mutantes y la cría de pez cebra, el Dr. Daniel Dranow para las discusiones que conducen a la generación de la transgénica, Dr. Bruce Los laboratorios de Blumberg y Ken cho para el uso de sus microscopios de disección, y la Dra. Megan Smith para obtener ayuda con el análisis estadístico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

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References

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Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

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