Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

وتمثل المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء مشكلة خطيرة بالنسبة للكائنات الحية والبيئات الطبيعية. Drosophila الميلانوغاستر يمثل نموذجا مثاليا لدراسة آثار EDC في الجسم الحي. هنا، نقدم أساليب للتحقيق في اضطراب الغدد الصماء في Drosophila، ومعالجة آثار EDC على الخصوبة والخصوبة وتوقيت النمو، وعمر الذبابة.

Abstract

في السنوات الأخيرة كانت هناك أدلة متزايدة على أن جميع الكائنات الحية والبيئة تتعرض للمواد الكيميائية الشبيهة بالهرمونات، والمعروفة باسم المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs). وقد تغير هذه المواد الكيميائية التوازن الطبيعي لأنظمة الغدد الصماء وتؤدي إلى آثار ضارة، فضلا عن زيادة عدد الاضطرابات الهرمونية في السكان أو اضطراب النمو وانخفاض التكاثر في أنواع الحياة البرية. وبالنسبة لبعض مراكز إدوْن، هناك آثار صحية موثقة وقيود على استخدامها. ومع ذلك، بالنسبة لمعظمهم، لا يوجد حتى الآن أي دليل علمي بهذا المعنى. من أجل التحقق من آثار الغدد الصماء المحتملة للمادة الكيميائية في الكائن الحي الكامل، ونحن بحاجة لاختباره في نظم النموذج المناسب، وكذلك في ذبابة الفاكهة، Drosophila الميلانوجاستر. هنا نبلغ مفصلة في بروتوكولات الجسم الحي لدراسة اضطراب الغدد الصماء في Drosophila, معالجة آثار EDC على الخصوبة / الخصوبة, توقيت النمو, وعمر الذبابة. في السنوات القليلة الماضية، استخدمنا هذه الصفات الحياة Drosophila للتحقيق في آثار التعرض ل17-α-ethinylestradiol (EE2)، بيسفينول A (BPA)، وبيسفينول التركيز البؤري التلقائي (BPA F). وإجمالاً، غطت هذه الفحوصات جميع مراحل حياة دروسوفيلا وجعلت من الممكن تقييم اضطراب الغدد الصماء في جميع العمليات التي يتم بوساطتها الهرمونات. وكانت اختبارات الخصوبة/الخصوبة وأوقات النمو مفيدة لقياس تأثير التكافؤ في الأداء على الأداء التناسلي للذبابة وعلى مراحل النمو، على التوالي. وأخيراً، انطوى التقييم العمري على التعرض المزمن للكبار للأشخاص البالغين وقياس نجاتهم. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تتأثر هذه الصفات الحياة من قبل العديد من العوامل التجريبية التي كان لا بد من السيطرة عليها بعناية. لذلك، في هذا العمل، نقترح سلسلة من الإجراءات التي قمنا بتحسينها للنتيجة الصحيحة لهذه الاختبارات. وتسمح هذه الأساليب للعلماء بتحديد اضطراب الغدد الصماء لأي من مركبات نقص التغذية أو لخليط من مختلف مركبات التغذية المنسّكة في دروسسوفيلا، وإن كان من الضروري تحديد آلية الغدد الصماء المسؤولة عن هذا التأثير، إلى مزيد من المقالات.

Introduction

وقد تم إطلاق الأنشطة البشرية في البيئة كمية هائلة من المواد الكيميائية، التي تمثل مشكلة خطيرة للكائنات الحية والنظم الإيكولوجية الطبيعية1. ومن بين هذه الملوثات، يقدر أن نحو 000 1 مادة كيميائية مختلفة قد تغير التوازن الطبيعي لنظم الغدد الصماء؛ وفقا لهذه الخاصية، وهي تصنف على أنها المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs). على وجه التحديد، استنادا إلى تعريف حديث من قبل جمعية الغدد الصماء، وEDCs هي "مادة كيميائية خارجية، أو خليط من المواد الكيميائية، التي يمكن أن تتداخل مع أي جانب من جوانب العمل الهرموني"2. على مدى العقود الثلاثة الماضية، كان هناك أدلة علمية متزايدة على أن EDCs يمكن أن تؤثر على تكاثر وتطوير الحيوانات والنباتات3،4،5،6،7، 8. وعلاوة على ذلك، كان التعرض EDC يرتبط بزيادة انتشار بعض الأمراض البشرية، بما في ذلك السرطان والسمنة والسكري وأمراض الغدة الدرقية، والاضطرابات السلوكية9،10،11.

الآليات العامة لـ EDC

بسبب خصائصها الجزيئية، والممارسات غير القانونية يتصرفمثل الهرمونات أو السلائف هرمون 3،4،5،6،7،8،9، 10,11,12. في هذا المعنى, أنها يمكن ربط مستقبلات هرمون وتعطيل نظم الغدد الصماء إما عن طريق محاكاة النشاط الهرموني أو عن طريق منع الهرمونات الذاتية ملزمة. في الحالة الأولى, بعد ملزمة لمستقبلات, أنها يمكن تفعيلها كما يفعل هرمونها الطبيعي. في الحالة الأخرى، وملزمة من EDC إلى مستقبلات يمنع الربط من هرمونها الطبيعي، وبالتالي يتم حظر مستقبلات ولم يعد يمكن تفعيلها، حتى في وجود هرمونها الطبيعي3. ونتيجة لذلك، يمكن أن تؤثر على العديد من العمليات، مثل التوليف، وإفراز، والنقل، والتمثيل الغذائي، أو العمل المحيطي للهرمونات الذاتية المسؤولة عن الحفاظ على التوازن، والتكاثر، والتنمية، و / أو سلوك الكائن الحي. والربط بين المستقبلات ليس هو السبيل الوحيد للعمل الذي تم وصفه حتى الآن بالنسبة للمراكز المعنية بمكافحة الفلور والألغام. ومن الواضح الآن أنها يمكن أن تعمل أيضا عن طريق تجنيد coactivators أو corepressors في مسارات الأنزيمية أو عن طريق تعديل علامات جينية تحرير التعبير الجينيالجيني 10،11،12،13 ،14، مع عواقب ليس فقط للجيل الحالي ولكن أيضا لصحة الأجيال القادمة8.

هرمونات الدروفيلا

وقد تم دراسة الآثار المحتملة لنخبة من المركبات المنتَجة للمواد الضارة بالحيوانات البرية على نطاق واسع، سواء في أنواع الأحياء البرية أو في عدة نظم نموذجية تكون فيها آليات الغدد الصماء معروفة جيداً إلى حد معقول. أما بالنسبة لللافقاريات، فقد تم وصف نظم الغدد الصماء التي تؤثر على النمو والتنمية والتكاثر على نطاق واسع في الحشرات لعدة أسباب، بما في ذلك استخدامها على نطاق واسع في مجال البحوث البيولوجية، وأهميتها الاقتصادية، و أخيرا تطوير المبيدات الحشرية قادرة على التدخل على وجه التحديد مع نظام هرمون الآفات.

على وجه الخصوص ، بين الحشرات ، ثبت أن ذبابة الفاكهة D. melanogaster نظام نموذجي قوي جدا لتقييم الآثار المحتملة لالغدد الصماء من EDCs. في D. الميلانوجاستر, وكذلك في الفقاريات, الهرمونات تلعب دورا هاما طوال دورة الحياة بأكملها. في هذا الكائن الحي، وهناك ثلاثة نظم الهرمونية الرئيسية، والتي تنطوي على هرمون الستيرويد 20-هيدروكسيكديسون (20E)15،16، وهرمون الأحداث sesquiterpenoid (JH)17، والببتيدات العصبية والببتيد / البروتين الهرمونات18. تتكون هذه المجموعة الثالثة من العديد من الببتيدات التي تم اكتشافها في الآونة الأخيرة ولكن تشارك بوضوح في مجموعة كبيرة من العمليات الفسيولوجية والسلوكية، مثل طول العمر، التوازن، التمثيل الغذائي، والإنجاب، والذاكرة، والتحكم في الحركة. 20E هو متجانسة لهرمونات الستيرويد المشتقة من الكولسترول مثل استراديول, في حين JH تشترك في بعض أوجه التشابه مع حمض الريتينويك; كلاهما الهرمونات المعروفة في Drosophila19,20. توازنها أمر حيوي في تنسيق الصهر والتحوّل، وكذلك في السيطرة على العديد من العمليات ما بعد النمو، مثل التكاثر، والعمر، والسلوك21،وبالتالي توفير إمكانيات مختلفة لاختبار الغدد الصماء اضطراب في Drosophila. وعلاوة على ذلك، فإن هرمونات الإيكوستيرويد وJHs هي الأهداف الرئيسية لما يسمى بالمبيدات الحشرية من الجيل الثالث، والتي تم تطويرها للتدخل في العمليات التنموية والإنجابية بوساطة الغدد الصماء في الحشرات. وطريقة عمل هذه المواد الكيميائية من الناهض أو الخصم معروفة جيدا، وبالتالي يمكن أن تكون بمثابة معايير مرجعية لتقييم آثار الـ EDCs المحتملة على نمو الحشرات وتكاثرها وتطويرها22. على سبيل المثال ، الميثوبرين ، الذي تم استخدامه على نطاق واسع في السيطرة على البعوض والحشرات المائية الأخرى23،24، يعمل كناهض JH وتقوّق نسخ الجينات الناجم عن 20E والتحوّل.

بالإضافة إلى الهرمونات, مستقبلات النووية (NR) الأسرة الفائقة في Drosophila هو أيضا معروفة جيدا; وهو يتألف من 18 عوامل النسخ المحفوظة تطوريا المشاركة في السيطرة على مسارات النمو المعتمدة على هرمون، فضلا عن التكاثر وعلم وظائف الأعضاء25. هذه الهرمونات NRs تنتمي إلى جميع الأنواع الفرعية NR ستة, بما في ذلك تلك التي تشارك في الإرسال العصبي26, اثنان لحمض الريتينويك روبية, وتلك لNRs الستيرويد التي, في الفقاريات, تمثل واحدة من الأهداف الأساسية لـ EDCs27.

Drosophila كنظام نموذجي لدراسة EDCs

وفي الوقت الراهن، تقوم عدة وكالات بيئية في جميع أنحاء العالم، على أساس الخصائص الجزيئية، بإسناد إمكانية التدخل في نظم الغدد الصماء إلى مختلف المواد الكيميائية من صنع الإنسان. ونظرا لأن هذه المراكز هي مشكلة عالمية وشاملة بالنسبة للبيئة وللكائنات الحية، فإن الهدف العام للبحوث في هذا المجال هو تخفيف عبء الأمراض التي تتحملها، فضلا عن حماية الكائنات الحية من آثارها الضارة. من أجل تعميق فهم الآثار المحتملة لالغدد الصماء من مادة كيميائية، فمن الضروري لاختباره في الجسم الحي. ولهذه الغاية، يمثل د. ميلانوجاستر نظاماً نموذجياً صالحاً. وحتى الآن، استخدمت ذبابة الفاكهة على نطاق واسع في نموذج الحي الحي لتقييم آثار العديد من الـEDCs البيئية؛ وقد أفيد أن التعرض للعديد من مركبات الميتاليك الهيدرولية، مثل ثنائي بوتيل الفثالات (DBP)28، البيسفينول A (BPA)، 4-nonylphenol (4-NP)، 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29، ميثيل بارابين (MP)30، إيثيل بارابين (EP)31، 32، bis-(2-ethylhexyl) الفثالات (DEHP)33، و 17-α-ethinylestradiol (EE2)34، يؤثر على وظائف التمثيل الغذائي والغدد الصماء كما هو الحال في نماذج الفقاريات. وقد أدت عدة أسباب إلى استخدامه كنموذج في هذا المجال من البحث. بالإضافة إلى المعرفة الممتازة بنظم الغدد الصماء، تشمل المزايا الأخرى دورة حياتها القصيرة، والتكلفة المنخفضة، والجينوم القابل للنبض بسهولة، وتاريخ طويل من البحث، والعديد من الإمكانيات التقنية (انظر موقع FlyBase على الويب، http://flybase.org/). كما يوفر د. ميلانوجاستر نموذجاً قوياً لدراسة الآثار عبر الأجيال والاستجابات السكانية للعوامل البيئية8 بسهولة، ويتجنب القضايا الأخلاقية ذات الصلة بالدراسات الحية في الحيوانات الأعلى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ذبابة الفاكهة تشترك في درجة عالية من الحفاظ على الجينات مع البشر مما قد يجعل من الممكن لفحوصات Drosophila EDC للمساعدة في التنبؤ أو اقتراح الآثار المحتملة لهذه المواد الكيميائية على صحة الإنسان. وإلى جانب توسيع نطاق فهم الآثار على صحة الإنسان، يمكن أن تساعد Drosophila في تقييم مخاطر التعرض لـ EDC للبيئة، مثل فقدان التنوع البيولوجي والتدهور البيئي. وأخيراً، فإن ذبابة الفاكهة توفر ميزة إضافية تتمثل في استخدامها في المختبرات، حيث يمكن إبقاء العوامل التي يحتمل أن تؤثر على تطورها وتكاثرها وعمرها تحت السيطرة من أجل عزو أي اختلاف إلى المادة التي يتعين اختبارها.

مع هذا في الاعتبار، قمنا بتحسين اختبارات اللياقة البدنية بسيطة وقوية لتحديد آثار EDC على بعض الصفات الهرمونية Drosophila، مثل الخصوبة / الخصوبة، وتوقيت النمو، وعمر الكبار. وقد استخدمت هذه الاختبارات على نطاق واسع لبعض EDCs23،24،25،26،27. على وجه الخصوص, لقد استخدمنا البروتوكولات التالية لتقييم آثار التعرض لهرمون الاستروجين الاصطناعية EE234 وBPA وإلى التركيز البؤري التلقائي البيسفينول (BPA F) (بيانات غير منشورة). ويمكن تعديل هذه البروتوكولات بسهولة للتحقيق في آثار EDC معينة في وقت واحد، فضلا عن الآثار مجتمعة من EDCs متعددة في D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الطعام

  1. لمخزون صيانة وليرقات حالة نموّ, إستعمال [كرنميل] متوسّطة يحتوي 3% مسحوق خميرة, 10% [سكروس], 9% [بركوكد] دقيق الذرة, 0.4% [أغر], بعد ذلك يدعى [كورنميل] وسط ([كم]).
    1. ضع 30 غرام من الخميرة في 100 مل من ماء الصنبور، واتركه يغلي لمدة 15 دقيقة.
    2. بشكل منفصل، اخلطي جيداً 90 غرام من دقيق الذرة المطبوخ مسبقاً، و100 غرام من السكر، و4 غ من الغار في 900 مل من مياه الصنبور.
    3. يُغلى الحل ويُخفّف الحرارة ويُطهى لمدة 5 دقائق مع التحريك باستمرار.
    4. بعد 5 دقائق، أضف محلول الخميرة الساخنة واتركه على نار هادئة لمدة 15 دقيقة أخرى.
    5. إيقاف مصدر الحرارة والسماح للحل لتبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية.
    6. إضافة 5 مل / لتر من 10٪ الميثيل 4-هيدروكسي بنزوات في الإيثانول، وتخلط جيدا والسماح لها الجلوس لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: كن حذرا مع كمية الميثيل 4-هيدروكسيبنزوات، نظرا لأن تركيز عال من مبيد الفطريات يمكن أن تكون قاتلة لليرقات.
    7. توزيع المتوسط في قارورة / زجاجات: 8 مل في كل قارورة ذبابة (25 مم × 95 ملم)، 3 مل في كل قارورة ذبابة (22 مم × 63 ملم) و 60 مل في كل زجاجة ذبابة (250 مل).
    8. تُغطّى القنينات بقماش الجبن وتُترك لتجف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 24 ساعة قبل التخزين.
    9. معايرة التناسق الصحيح والترطيب من قبل الأشعة الفوق ية (CM) عن طريق تعديل كمية الأجار المستخدمة و/أو أوقات التبريد/التجفيف.
      ملاحظة: قوارير غير موصولة ومحاصرة وملفوفة مستقرة لمدة 15 يوماً عند 4 درجات مئوية.
  2. للبالغين Drosophila، استخدم وسيطيحتوي على 10% خميرة مسحوقة، 10% سكروس، 2% أجار، وتسمى بعد ذلك متوسطة الكبار (AM).
    1. اخلط يُخلط 10 غ من الخميرة المسحوقة، 10 غ من السكروز، 2 غ من الغار إلى 100 مل من الماء المقطر.
    2. يُغلى هذا المزيج مرتين، مع فاصل زمني مدته 3 دقائق، أو حتى يذوب الغار، باستخدام الميكروويف.
    3. مرة واحدة يبرد الحل إلى 60 درجة مئوية، إضافة 5 مل / لتر من 10٪ الميثيل 4-هيدروكسي بنزوات في الإيثانول، وتخلط جيدا والاستغناء في قارورة (10 مل لكل قارورة).
    4. تُغطّى القنينات بقماش الجبن وتُترك لتجف في RT لمدة 24 ساعة قبل تخزينها.
      ملاحظة: قوارير غير موصولة ومحاصرة وملفوفة مستقرة لمدة 15 يوماً عند 4 درجة مئوية.
  3. للخصوبة / الخصوبة اختبار، استخدم Drosophila عصير الطماطم والذرة المتوسطة.
    1. صب قبالة 70 مل من الطعام دقيق الذرة الدافئة في كوب 100 مل وإضافة 30 مل من عصير الطماطم (30٪ v /v).
    2. اخلطي جيداً مع محضر الطعام وأنبوب 3 مل في قنينات صغيرة.
    3. تُغطّى القنينات بقماش الجبن وتُترك لتجف في RT لمدة 24 ساعة قبل التخزين.
      ملاحظة: قوارير غير موصولة ومحاصرة وملفوفة مستقرة لمدة 15 يوماً عند 4 درجة مئوية.
  4. لجمع الأجنة، استخدم لوحات أجار، التي تحتوي على 3% أجار، صلصة طماطم 30%، و3% سكر.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم جعل فقاعات عند صب المتوسطة في لوحات.

2. Drosophila EDC الدوس

  1. إعداد حل الأسهم المناسبة حل EDC المحدد في المذيب المناسب. لEE2 (الوزن الجزيئي 296.403)، تذوب 1.48 غرام في 10 مل من 100٪ الإيثانول لجعل 0.5 M حل المخزون وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    تحذير: وتعتبر هذه الملوثات ملوثة بيئياً وينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة في التعامل معها.
  2. تملي محلول مخزون EE2 في 10% من الإيثانول في الماء (v/v) من أجل الحصول على محلول 100 mM. قم بالتخفيفات التالية (0.1 m، 0.5 mM و 1 mM) في CM الغذاء، بدءا من تركيز أقل واستخدام التركيز النهائي نفسه من المذيبات لكل مجموعة العلاج. للقنينات السيطرة استخدام نفس حجم المذيب وحده.
    ملاحظة: يوصى بإبقاء التركيز النهائي للمذي بأدنى مستوى ممكن، مع الأخذ في الاعتبار أن التركيز النهائي للإيثانول يجب ألا يتجاوز 2% في طعام الذبابة.
  3. إضافة الحل الذي يحتوي على التخفيف الأيمن من EDC مختارة إلى الغذاء القائم على دقيق الذرة قبل التصلب، وتخلط جيدا مع محضر الطعام، الاستغناء 10 مل في قارورة، وتغطي مع الشاش القطن والسماح الجافة في RT لمدة 16 ساعة قبل استخدام.
    ملاحظة: استخدام هذه الوسيلة مباشرة بعد إعداده.
  4. لتربية الكبار، إعداد حلول EE2 العمل المختلفة (10 mM، 50 mM و 100 mM، على التوالي) في 10٪ الإيثانول في الماء (v /v) و100 ميكرولتر من كل على سطح AM، من أجل الحصول على التركيز المطلوب من EE2 (0.1 mM ، 0.5 m و 1 mM). للتحكم استخدام نفس حجم المذيب وحده.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، أضف الحل الذي يحتوي على التخفيف الصحيح من EDC المحدد إلى كمية صغيرة من AM في أنبوب مخروطي 50 مل، دوامة بدقة وتصنيف 1 مل منه على سطح قارورة AM.
    1. تغطية قارورة مع الشاش القطن، والسماح التجفيف في RT لمدة 12-16 ساعة تحت الهياج لطيف واستخدامها على الفور.
      ملاحظة: يجب تعديل عملية التجفيف تجريبياً لأن ذلك يتوقف على الرطوبة المحيطة.
  5. لتغذية اختبار، إضافة كل من الحل الذي يحتوي على التخفيف الصحيح من EDC مختارة (EE2 0.1 MM، 0.5 mM و 1 mM) والغذاء التلوين (على سبيل المثال، صبغة حمراء رقم 40 في 1 ملغ / مل)35 إلى CM قبل التصلب، وتخلط بقوة مع محضر الطعام ثم الاستغناء ه إلى قارورة.

3. تربية الذباب

  1. استخدام سلالة قوية من الأيوجينية، مثل R أوريغون، التي تحتفظ بها عدة أجيال في المختبر.
  2. حافظ على الذباب في حاضنة رطبة يتم التحكم في درجة حرارتها، مع ضوء طبيعي 12 ساعة: 12 ساعة فترة ضوئية داكنة عند 25 درجة مئوية في قارورة تحتوي على طعام CM.
  3. في كل تقييم، استخدم قوارير في RT.

4. التغذية بالقياس

ملاحظة: ويوصى بإجراء هذا الفحص لاختبار ما إذا كان وجود الـ EDC المحدد في الوسط قد يؤثر على تغذية الذباب.

  1. وضع 15 الذباب الشباب في قارورة تحتوي على CM تستكمل مع تركيزات مختلفة من EDC مختارة وتلوين الغذاء. السماح الذباب للتغذية على وسائل الإعلام لمدة 1 يوم.
    ملاحظة:على سبيل المثال، استخدم صبغة حمراء رقم 4035 (1 ملغ/مل).
  2. وضع 15 الذباب الشباب في قارورة تحتوي على CM تستكمل مع المذيب وحدها والغذاء التلوين للسيطرة. السماح الذباب للتغذية على وسائل الإعلام لمدة 1 يوم.
  3. التخدير بشكل فردي كل مجموعة من الذباب مع الأثير.
    1. نقل الذباب من كل مجموعة إلى حاوية زجاجية أسطوانية (الإيثر) مع قمع إدراجها في نهاية مفتوحة، عكس القارورة على القمع والتنصت بلطف على الحاويات اثنين معا لجعل الذباب تقع في الأثير.
      ملاحظة:  سوف يمنعهم القمع من الخروج من الإيثريزر.
    2. تدق الذباب إلى أسفل عن طريق النقر بلطف الإيثرعلى سطح لينة، مثل لوحة الماوس، واستبدال قمع بسرعة مع القطن غارقة في الأثير والمكونات الشاش.
    3. انتظر حوالي 1 دقيقة حتى يسقط الذباب إلى أسفل وتوقف عن التحرك.
      ملاحظة: لا تتجاوز الوقت أو الذباب سوف يموت.
  4. وضع الذباب المعطل تحت المجهر الاستريو ومقارنة التلوين البطني لكل مجموعة علاج فيما يتعلق بمجموعة التحكم.

5. اختبار الخصوبة/الخصوبة

  1. لكل تركيز EDC، وإعداد 3 قوارير من الذباب، وتسمى بعد ذلك قارورة الوالدين، مع 8 الإناث و 4 الذكور في 10 مل CM / EDC الغذاء؛ للسيطرة إعداد 6 قارورة من الذباب مع 8 الإناث و 4 الذكور في 10 مل CM الغذاء المكمل مع المذيبات. الذباب الخلفي في حاضنة في 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب اليرقات الاكتظاظ أثناء تطورها ومحاولة استخدام كثافة اليرقات متسقة عبر العلاجات.
  2. بعد 4 أيام، قم بإزالة الآباء واعادة القنينات إلى الحاضنة لمدة 5 أيام أخرى.
  3. في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم 9، وإزالة جميع الذباب حديثا من قارورة ووضع قوارير في حاضنة في 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا الإزالة بعناية فائقة، والتحقق من سطح البئر المتوسطة.
    1. في صباح اليوم العاشر، لكل مجموعة علاج، جمع الإناث العذراء والذكور الشباب في مجموعتين، تحت التخدير الخفيف 2 CO. تقسيم عشوائيا كل مجموعة من الذباب في مجموعات فرعية صغيرة (10 إناث و 20 الذكور في قارورة) في قنينات مستقلة مليئة CM المقابلة الطازجة.
      1. كرر الخطوة 5.3.1 مع الحرص على إزالة كل الذباب بعناية من القنينات 8-10 ساعة قبل جمع وترك قوارير في 18 درجة مئوية، حتى الحصول على ما لا يقل عن 30 الإناث العذراء و 30 الذكور لكل تركيزات EDC وما لا يقل عن 90 الإناث العذراء و 90 الذكور للسيطرة.
    2. بيت هذه المجموعات من الذباب في 25 درجة مئوية حتى أعمارهم 4 أيام بعد إكلوسيون، ونقلها إلى قارورة جديدة تحتوي على المتوسط المقابلة الطازجة كل يومين.
      ملاحظة: 4 أيام هو الوقت الكافي للذباب لتصبح ناضجة الكبار، لكنه بعيد جدا عن بداية الشيخوخة.
    3. بعد يومين تأكد من عدم وجود يرقات في قارورة من الإناث. إذا فعلوا ذلك، فإن الذباب غير قابل للاستخدام لأنهم ليسوا عذارى ويجب التخلص منه.
  4. استخدم 20 ذبابة واحدة لكل جنس لكل مجموعة علاجية لإعداد 20 صلبان مفردة في قوارير صغيرة تحتوي على متوسطة الطماطم الطازجة بدون EDC، كما هو موضح أدناه.
    1. إلى كلّ معالجة يعيّن مجموعة [سري] مختلفة من أرقام متتابعة, أيّ بشكل فريد يعيّن هو ويعيّن القارورة شخصيّة; مثلاً المجموعة 1 (المذيب وحده) من المجموعة 2 إلى 1 إلى 20 (تركيز EDC x) من 20 إلى 40، وهكذا.
    2. جعل جدول بيانات الخصوبة لتسجيل سلسلة مختلفة، كل المقابلة لمجموعة العلاج.
    3. لكل جنس التخدير جميع الذباب التي تنتمي إلى كل مجموعة العلاج تحت ضوء ثاني2 ونقلها عشوائيا على النحو التالي.
      1. نقل واحدة من الإناث المعالجة بالمذيبات في قارورة صغيرة تحتوي على المتوسطة الطازجة CM-الطماطم دون EDC وإضافة واحد من الذكور المعالجة بالمذيبات للتحكم الصليب.
        ملاحظة: يجب إضافة عصير الطماطم إلى الوسط أثناء إعداده لأن الوسط الداكن يزيد من التباين مع الأجنة البيضاء.
      2. نقل واحدة EDC معاملة أنثى في قارورة صغيرة تحتوي على الطازجة CM-الطماطم دون EDC وإضافة واحد من الذكور المعالجة بالمذيبات لكل علاج.
      3. نقل واحد EDC معاملة الذكور في قارورة صغيرة تحتوي على المتوسطة الطازجة CM-الطماطم دون EDC وإضافة واحدة من الإناث المعالجة بالمذيبات لكل علاج.
    4. بيت كل هذه الصلبان واحدة في 25 درجة مئوية.
  5. نقل كل زوج التزاوج في قارورة الطماطم CM الطازجة دون EDC كل يوم لمدة عشرة أيام لاحقة. تسمية قوارير المنسوخة من كل سلسلة بشكل متسلسل; على سبيل المثال 1-أ، 1ب، 1ج...... 20a، 20b، 20c والإبلاغ عن هذا الرقم على جدول الخصوبة.
  6. فحص بصريا كل قارورة كل يوم للبيض والإبلاغ عن عددهم على جدول بيانات الخصوبة.
  7. حفظ كل قارورة، وعندما يبدأ الذباب حديثا في الظهور، وتسجيل أيضا العدد اليومي من progenies الكبار على مدى فترة 10 أيام. بعد 10 أيام من التزاوج الأولي، قم بإزالة الآباء.
    ملاحظة: التخلص من القارورة التي توفي فيها أحد الوالدين أو كليهما؛ في حالة هروب أحد الوالدين أو كليهما، تدرج في التحليل جميع البيانات حتى اليوم الذي فقدت فيه.
  8. مجموع العدد اليومي من البيض والعدد اليومي من progenies الكبار من كل مجموعة العلاج، للحصول على الخصوبة الكلية / الخصوبة، ومتوسط إنتاج البيض وذرية الكبار من ذبابة لمدة عشرة أيام، ونسبة السلف الإجمالي إلى العدد الإجمالي للبيض وضعت. حساب الفروق في النسبة المئوية لكل قيم المعالجة فيما يتعلق بعنصر التحكم.
  9. إجراء ثلاث تجارب مستقلة لكل مجموعة من الذباب، وذلك باستخدام ما لا يقل عن 10 ذباب لكل مجموعة علاجية.
  10. إجراء تحليل إحصائي لمقارنة المجموعات المختلفة.

6. توقيت التطور

ملاحظة: في البروتوكولين البديلين التاليين يتم تقييم توقيت النمو من خلال عد كل من عدد الجراء التي تشكل كل يوم وعدد ذرية الكبار eclosing في اليوم الواحد.

  1. بروتوكول تقييم الإكلوسيون 1
    1. لكل مجموعة علاج، إعداد 10 قارورة من الشباب (<2 أيام)، والذباب صحية، مع كل 6 الإناث و 3 الذكور في 10 مل الذرة الغذاء دون EDC.
    2. السماح الذباب على الطعام لمدة 24 ساعة، والسماح لهم أن يتزاوج.
    3. إعداد 10 قوارير متوازية لكل مجموعة علاج مع 10 مل كل من دقيق الذرة الطازجة الغذائية تكملها تركيزات EDC مختلفة أو المذيب وحدها للسيطرة. نقل الذباب تزاوج إلى هذه القنينات الجديدة.
      ملاحظة: لكل مجموعة معالجة تعيين سلسلة مختلفة من الأرقام التسلسلية، الذي يحدد بشكل فريد وتسمية قوارير كل منها.
    4. إنشاء جدول بيانات تطويري لتسجيل السلسلة المختلفة.
    5. السماح الذباب لوضع البيض لمدة 16 ساعة. ثم إزالة الآباء من القنينات.
      ملاحظة: يمكن استخدام الذباب الأصل لتكرار الخطوة 6.1.5، عن طريق نقلها إلى قارورة المقابلة الأخرى.
    6. تحضن قوارير لمدة 3-4 أيام في 25 درجة مئوية، أو حتى لا مزيد من شكل الجراء. كل يوم عد عدد الجراء حديثا في كل قارورة والإبلاغ عنها على جدول البيانات التنمية. لتجنب عد نفس الجراء مرتين، اكتب رقما في تسلسل في كل بوبا مع علامة دائمة على الجزء الخارجي من القارورة.
    7. بدءا من اليوم 9، عد يوميا عدد البالغين الناشئة حتى لا يظهر المزيد من البالغين، والإبلاغ عن ذلك على جدول التنمية.
    8. من هذه البيانات الخام، حساب متوسط فترة اليرقات، ومتوسط الفترة الجرو، فضلا عن الاختلافات في النسبة المئوية لكل معاملة فيما يتعلق بالسيطرة.
    9. إجراء ثلاث تجارب مستقلة لكل مجموعة من الذباب، وذلك باستخدام ما لا يقل عن 5 قوارير لكل مجموعة علاج.
    10. إجراء تحليل إحصائي لمقارنة المجموعات المختلفة.
  2. بروتوكول تقييم الإكلوسيون 2
    1. الخلفية الشابة وصحية الإناث (حوالي 150) والذكور (حوالي50) الذباب على قفص جمع (جدول المواد) مع أجار الطماطم المتوسطة مع عجينة الخميرة الطازجة (3 غرام من الخميرة الخباز في 5 مل من الماء)، ودعا بعد ذلك وضع صينية، لمدة 2 أيام عند 25 درجة مئوية.
    2. خلال هذين اليومين، تسمح الذباب إلى التكيف مع القفص في مكان مظلم وهادئ، قبل بدء جمع البيض، وتغيير صينية وضع مرتين في اليوم.
    3. في اليوم الثالث، قم بتغيير صينية وضع في الصباح الباكر. بعد 1 ساعة، استبدال صينية زرع، وتجاهل هذه البيض وضعت.
    4. السماح الذباب لوضع البيض لمدة 2 ساعة واستبدال مع صينية وضع الطازجة.
      ملاحظة: بحلول اليوم 3، يجب أن صينية جيدة زرع إنتاج 100-200 البيض في 2 ح.
    5. لكل مجموعة علاج، إعداد سلسلة من ثلاثة أطباق 60 ملم تحتوي على الطماطم الذرة دقيق الغذاء تكملها تركيز EDC المقابلة أو مع المذيبات وحدها والإبلاغ عن كل سلسلة في جدول توقيت التنمية. بدلا من ذلك، إذا كان يفضل، واستخدام قارورة بدلا من الأطباق.
    6. التقط البيض بلطف تحت المجهر باستخدام فرشاة الطلاء أو مسبار ونقلها إلى أعلى الوسط في كل طبق / قارورة. من أجل تسهيل العد، على صينية زرع، وترتيب البيض في 5 مجموعات من 10 كل ونقلها واحد في وقت واحد.
      ملاحظة: كرر الخطوة 6.2.4 عدة مرات كما هو ضروري للحصول على ما يكفي من الأجنة.
    7. بيت كل هذه الأطباق / قارورة في 25 درجة مئوية. تخزين أيضا كل صينية زرع في 25 درجة مئوية، وحساب العدد الإجمالي للبيض وضعت.
    8. بعد 24-30 ساعة، تحقق من كل طبق / قنينة تحت stereomicroscope وحساب كل من عدد البيض الأبيض، غير المخصب وعدد من الأجنة الميتة المظلمة.
    9. طرح عدد البيض الأبيض غير المخصب من قيمة 50 بيضة محولة من أجل الحصول على قيمة "إجمالي الأجنة" لكل طبق/قارورة. يمكن استخدام عدد الأجنة الميتة الداكنة لتحديد الآثار السامة المحتملة EDC أثناء تكوين الأجنة.
    10. كرر الخطوات 6.1.6 6.1.10 من "بروتوكول التقييم Eclosion 1".

7. بروتوكول العمر

  1. إعداد 20 قارورة من الذباب مع 8 الإناث و 4 الذكور ومنزل في 25 درجة مئوية في CM (10 مل لكل منهما).
  2. بعد 4 أيام التخلص من الذباب ووضع قارورة مرة أخرى في الحاضنة.
    ملاحظة: يمكن استخدام هذه الذباب لبدء مرة أخرى للحصول على المجموعات الأخرى متزامنة مع العمر من الذباب.
  3. في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم 9، وإزالة جميع الذباب حديثا من قارورة وقارورة العودة إلى الحاضنة.
    ملاحظة: ينبغي أن تبدأ بضعة أشخاص بالغين في الإغلاق في وقت مبكر من اليوم التاسع؛ تجاهل هذه الذباب يسمح لجمع الحد الأقصى لعدد الذباب متزامنة، وتجنب اختيار الإهمال من الناشئة في وقت مبكر.
  4. 16-24 ح في وقت لاحق، نقل الذباب الكبار (1 يوم قديم) من كلا الجنسين إلى أربع مجموعات من 250 مل زجاجات تحتوي على الغذاء AM تستكمل مع ثلاثة تركيزات EDC مختلفة واحدة مع المذيب وحدها. إذا لزم الأمر، قم بجمع دفعة أخرى في اليوم التالي.
  5. الحفاظ على الذباب في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للسماح لهم أن يتزاوجوا.
    ملاحظة: يوم نقل إلى قارورة الغذاء AM يتوافق مع اليوم الأول من مرحلة البلوغ.
  6. بعد يومين إلى ثلاثة أيام، قم بفرز كل مجموعة من الذباب حسب الجنس إلى مجموعتين تحت التخدير الخفيف CO 2. تقسيم كل جنس عشوائياً إلى خمس قنينات لكل علاج بكثافة 20 فرداً لكل قنينة، إلى أن يتم تكرار ثلاث قوارير متوازية لكل نوع من الجنسين لكل علاج.
    ملاحظة: العمل مع مجموعات صغيرة من الذباب من أجل منع المشاكل الصحية المحتملة طويلة الأمد بسبب التعرض الطويل لثاني أكسيد الكربون2.
  7. إعداد جدول بيانات العمر الذي يتم فيه طرح عدد الذباب الميت من عدد الذباب الباقي على قيد الحياة إلى النقل السابق، بطريقة تمكن من الحصول تلقائياً على عدد الناجين في كل عملية نقل.
  8. نقل الذباب إلى قارورة جديدة تحتوي على الطعام المقابلة كل 3 أيام في نفس الوقت والتحقق من وجود وفاة.
    ملاحظة: يجب أن يتم نقل دون تخدير يمكن أن يكون لها تأثير سلبي طويل الأجل على طول العمر يطير.
    1. في كل نقل، تسجيل عمر الذباب وعدد الذباب الميت.
      ملاحظة: يتم حساب عدد الذباب الباقي على قيد الحياة تلقائياً في جدول البيانات ولكن من المستحسن للتحقق منه بصرياً. الذباب الذي يهرب بطريق الخطأ أو يموت أثناء النقل لا ينبغي النظر فيها. يجب الحرص على عدم حساب الذباب الميت مرتين التي حملت إلى قارورة جديدة الإبلاغ عن هذه المذكرة في جدول البيانات.
    2. كرر الخطوتين 7.8 و 7.8.1 حتى يموت كل الذباب.
  9. لكل مجموعة علاج، إنشاء منحنى البقاء على قيد الحياة كما هو موضح في الشكل6، من أجل عرض احتمال البقاء على قيد الحياة من ذبابة في أي وقت معين.
  10. إجراء ثلاث تجارب مستقلة لكل مجموعة علاج الذباب، وذلك باستخدام 100 الذباب المغلقة حديثا لكل تجربة.
  11. إعداد جدول للإبلاغ عن متوسط العمر (متوسط أيام البقاء على قيد الحياة لجميع الذباب لكل مجموعة)، ونصف وقت الوفاة (فترة الوقت في الأيام اللازمة للوصول إلى 50% الوفيات) والحد الأقصى للعمر (الحد الأقصى للأيام اللازمة للوصول إلى 90% من الوفيات).
  12. حساب الفروق في النسبة المئوية بين كل مجموعة علاج فيما يتعلق بمجموعة التحكم.
  13. إجراء تحليل إحصائي لمقارنة مجموعات العلاج المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا القسم، يتم الإبلاغ عن الخطوات الرئيسية للبروتوكولات المذكورة أعلاه في شكل مخططات مبسطة. وبالنظر إلى أن الذباب تميل إلى تجنب المركبات غير مستساغة, أول شيء القيام به هو أن نحسب طعم EDC مختارة. ويمكن القيام بذلك عن طريق خلط تلوين الطعام (على سبيل المثال، أحمر الغذاء صبغ رقم 40)35 مع الغذاء تستكمل مع EDC مختارة في جرعات مختلفة أو مع المذيب وحده. يتم فحص الذباب التي تتغذى على هذه الوسائط تحت المجهر الاستريووي ويقدر تناول الطعام من خلال التلوين البطن (الشكل 1). وتظهر الحالة المرغوبة النموذجية في الشكل 1 مع اثنين من الإناث البالغة: واحدة تتغذى على متوسط تحتوي على EDC مختارة وواحدة على متوسط لا تحتوي على EDC، وكلاهما تقديم نفس التلوين في بطونهم.

وقد تم على نطاق واسع أن يكون على نطاق واسع أن EDCs, مثل الهرمونات الطبيعية, لها آثار في جرعات منخفضة للغاية وأنه ليس هناك, علاقة خطية بسيطة بين الجرعة وتأثير29,مع جرعات أعلى ليس بالضرورة وجود تأثير أكبر36, 37. لذلك، بدلا من نهج الجرعة والاستجابة، من أجل تقييم آثارها تقييما كاملا، فمن المستحسن استخدام المزيد من الجرعات، بدءا من تركيزات ذات الصلة للبيئة أو للكائنات الحية الأخرى. وعلى أية حال، من المهم أن نحسب طعم EDC في كل تركيز مستخدم للتأكد من أنالذباب يهضم كميات مماثلة من EDC في كل مجموعة علاجية (الشكل 2).

يؤثر اضطراب الغدد الصماء على العديد من السمات الهامة لعلم وظائف الأعضاء الحيواني مثل الخصوبة وطول العمر والتنمية التي، لذلك، هي نقاط نهاية مفيدة لاختبار EDCs. بالنسبة للبروتوكولات المذكورة أعلاه، التي قمنا بتحسينها لقياس آثار EDC على هذه الصفات الحياة Drosophila، الاعتبارات الأساسية هي أنه من الضروري استخدام الذباب الشباب وصحية التي ينبغي التلاعب بها بشكل صحيح قبل الاختبار. مع هذا في الاعتبار، يجب إيلاء اهتمام كبير لإنتاج، والتعامل، وتخزين المواد الغذائية المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي توخي الحذر في استخدام أفضل المذيبات في الخلاطات المعينة المختارة بتركيزات نهائية مناسبة (أي أقل من 1 في المائة بالنسبة لثاني ميثيل سولفسيد [DMSO] وأقل من 2 في المائة بالنسبة للإيثانول)30.

وقد استخدمت الخصوبة والخصوبة لتقييم النجاح الإنجابي في D. الميلانوغاستر. ويبين الشكل 3 مخطط البروتوكول المستخدم. وتقاس التكافؤ تجريبيا ً على أنه العدد الإجمالي للبيض المنصوص عليه، في حين تقاس الخصوبة بأنها مجموع النسل البالغ. استنادا إلى اعتبار أن إنتاج البيض في الأيام ال10 الأولى من حياة الكبار هو مرجع جيد لكامل العمر البالغ البيض / إنتاج السلف من كائن حي38،39، يمكن إجراء اختبارات الخصوبة والخصوبة لمدة 10 أيام من قبل باستخدام الذباب 4 أيام من العمر فقست من اليرقات المكشوفة. ومن المهم محاولة الحصول على قيم مماثلة في قوارير متوازية لكل مجموعة؛ خلاف ذلك، سيكون من الصعب أن نتصور أي أنبوب لإزالة من التحليل. لذلك، فمن المستحسن أن تدرس يوميا كل قنينة تكرار لتجنب بيئة مرهقة، مثل الأغذية المجففة أو المسيلة. بدءا من 20 صلبان واحدة، فمن المستحسن الحصول على ما لا يقل عن 10 قارورة في ظروف جيدة التي كان كلا الوالدين على قيد الحياة لمدة 10 أيام. يجب الإبلاغ عن أعداد البيض وذرية البالغين، التي يتم جمعها يوميًا، على جدول كما هو موضح في الشكل 3 واستخدامها لحساب متوسط إنتاج البويضة وذرية البالغين من ذبابة لمدة 10 أيام. ثم، يمكن الحصول على نسبة التغير الخصوبة/ الخصوبة من الذباب EDC المعالجة مقارنة الذباب السيطرة تطبيق الصيغة التالية: الخصوبة / تغير الخصوبة ٪ = [(السيطرة - العلاج) / السيطرة] × 100. يجب الحصول على ثلاث نسخ مستقلة على الأقل لكل مجموعة.

الهرمونات تلعب أدوارا ً أساسية في التحولات التنموية في حياة D. الميلانوغاستر40, التي من المرجح أن هذه المراحل من النمو تكون عرضة بشكل خاص للآثار السلبية للاضطرابات الاقتصادية. في 25 درجة مئوية، كل من نمو اليرقات ومرحلة الجرو كل تمتد حوالي 4 أيام. وبعد التعرض لـ EDC، يمكن أن يتأثر متوسط مدة هذه المراحل41. وبناء على هذا الاعتبار، تم تحسين بروتوكولات توقيت النمو لتحديد النسبة المئوية ووقت الانتقال من اليرقات إلى الجراء ومن الجراء إلى البالغين بعد التعرض لـ EDC فيما يتعلق بالذباب غير المعالج. ويمكن أن يقوم بروتوكولان بديلان بإجراء هذا الاسهاب. وكان كلاهما صالحاً واستندا إلى التعرض المزمن لليرقات في اليرقات على مدى فترة 4 أيام. استناداً إلى هذا العلاج اليرقات، لم يأخذ البروتوكول الأول في الاعتبار عمر الأجنة، التي تم جمعها على مدى فترة 16-18 ساعة (بين عشية وضحاها). ومع ذلك، ينبغي أن يكون التغير العمري المترتب على ذلك بين اليرقات موجوداً في جميع قوارير كل علاج، مما يزيد من التباين داخل العلاج ولكن دون أن يؤثر بشكل كبير على تقديرات توقيت النمو من خلال العلاجات. بدلا من ذلك، استخدم البروتوكول الثاني عدد ثابت من الأجنة المبكرة متزامن، مما يجعل من الممكن لتقييم الآثار المحتملة أيضا من EDC مختارة أثناء تكوين الأجنة42،43. وعلاوة على ذلك، فإن التقليل إلى أدنى حد من الاختلافات العمرية بين اليرقات يقلل من الفرق داخل العلاج ويزيد من القدرة على تقدير الاختلافات الحقيقية بين العلاجات. ويفيد الشكل 4 بمخطط للتقييم في حالة الإكلوسيون. وفي كلا البروتوكولين، كان لا بد من فحص الصفائح/القنينات يومياً، وكان يتعين الإبلاغ عن أعداد كل من الجراء والبالغين من أولئك المعرضين وغير المعرضين للاتفاقية بشكل منفصل على جدول كما هو الحال في الشكل 4. كلّ يشكّل [بوب] وبالغ ذبابات اضطرّ كنت عدّت, ما إذا ميّتة أو حيّة. ثم استخدمت هذه البيانات الأولية لحساب النسب المئوية وأوقات الانتقال من اليرقات إلى الجراء ومن الجراء إلى البالغين ولحساب النسبة المئوية للتغير في هذه القيم من الذباب المعالجة بـ EDC مقارنة بالذباب المسيطر. وبعد التعرض لـ EDC، كان من المتوقع حدوث تقدم أو تأخير في النمو الإجمالي فيما يتعلق بالذباب المسيطر. وكان لا بد من تنفيذ البروتوكول المختار في ثلاث مجموعات من الذباب. وبالنسبة لبروتوكول التقييم الثاني للإكلوسيون، فإن كل سلسلة من الاختبارات التي يتم تكرارها لتركيز معين من مادة الشدّة التحتيّة قد تم زرعها بأجنة من نفس مسار الإرساء من أجل الحفاظ على الموثوقية والدقة في عملية تنظيم الأجنة في جميع مراحل تركيزات الخلايا المنتَجة.

وأخيراً، يظهر الشكل 5 الخطوات الرئيسية لقياس العمر الافتراضي. وبالنسبة لهذا البروتوكول، كان من الضروري أن تكون جميع الذباب ة قيد التحليل متزامنة حسب العمر والجنس، إلى جانب الإبقاء على كثافة منخفضة بما يكفي للسماح بالتداول الحر. من المهم إجراء تجارب العمر في كلا الجنسين بشكل منفصل لأنه من المعروف جيدا أن هناك اختلافات كبيرة في العمر بين الذكور والإناث44.

ويكون من الضرورة تغيير الأغذية كل ثلاثة أيام للحفاظ على صحة السكان، كما يتعين تقييم معدل الوفيات كل ثلاثة أيام. في جدول بيانات العمر، كما في الشكل5، تم الإبلاغ عن عدد الذباب الميت، وسيتم طرح هذا العدد تلقائيا من عدد الذباب الباقي على قيد الحياة من النقل السابق. وبالنسبة لكل تركيز من تركيز EDC وللمذيب وحده، تم رسم الباقين على قيد الحياة التراكمي مقابل الأيام المنقضية للحصول على منحنيات عمر. يتم الإبلاغ عن منحنى نموذجي للنجاة في الشكل 6؛ بعد فترة أولى طويلة في أيّ ال [نيجونشيب] منحنى بقي نسبيّا عال, انخفض هو أسّيّا بعد حوالي 60 أيام. وبعد التعرض للذباب التحتي، يمكن أن يتأثر منحنى البقاء على قيد الحياة في الذباب المعالج تأثراً كبيراً. من أجل تحديد ما إذا كان هذا التأثير يرجع إلى EDC مختارة، كان من المستحسن لتنفيذ اثنين على الأقل، أو أفضل من ذلك، ثلاث تجارب تكرار مستقلة، غير contemporaneous.

وفي كل من البروتوكولات المذكورة أعلاه، كان من الممكن الحصول على قنينات شاذة (على سبيل المثال، بدون بيض أو وفيات شاذة)؛ ويمكن أن تنشأ هذه القنينات لأسباب مختلفة، مثل رداءة نوعية الغذاء أو العدوى، ويمكن أن تغير إلى حد كبير قيم التدابير. وأفضل طريقة لإدارة هذه الحالات الشاذة هي تجنبها من خلال الممارسة التجريبية الجيدة. لذلك، يجب التأكيد على أنه بالنسبة لجميع البروتوكولات المذكورة أعلاه، كان مطلوبا عمل كبير ودقيق في تكرار القنينات، والحفاظ على الذباب صحية، وفي التعامل مع الذباب التي، مرة واحدة يتعرض لEDC، قد تصبح حساسة، وبالتالي زيادة خطر الموت عندما التلاعب.

Figure 1
الشكل 1: التغذية بالقياس. الذباب الكبار في قارورة تحتوي على CM / صبغ تستكمل مع EDC مختارة (أعلى) أو المذيبات وحدها (أسفل) تترك لتغذية لمدة 24 ساعة. ذبابتين تتغذى على المتوسطة تكملها EDC (أعلى) أو المذيبات وحدها (أسفل) تظهر التلوين مماثلة على بطونهم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الدوس على الـ EDC. التخطيطية لإدارة EDC إلى Drosophila عن طريق النظام الغذائي. يتعرض الذباب البالغ من مخزون من الأيوجينية لتركيزات مختلفة من EDC (أعلى) أو مذيب وحده (أسفل). N = التركيز المرجعي للـEDC. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم الخصوبة. مخطط ةيلابة ةيبسنلا ةيلابة ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلابةةةةةةةةةبةةبةةةةبةةةةةاب ةيلافة الخطوة 1: البالغين (10 قارورة مع ثماني إناث وأربعة ذكور لكل منهما) من سلالة أيوجينيك يتم نقلها إلى قارورة مع CM / EDC (أعلى) أو سم / المذيبات وحدها (أسفل). (لاحظ أن النظام، للبساطة، يشير إلى واحد فقط من القنينات الثلاث.) الخطوة 2: بعد 4 أيام، يتم التخلص من البالغين، ويتم ترك البيض وضعت لتطوير لمدة 9 أيام حتى مرحلة الكبار. الخطوة 3: يتم فرز البالغين المغلقة حديثا حسب الجنس وجمعها في قارورة (بحد أقصى 20 الذكور / القنينة و 10 عذراء الإناث / قارورة). الخطوة 4: يتم ترك البالغين إلى سن 4 أيام على المتوسط المقابلة لنمو اليرقات. الخطوة 5: إعداد 40 صلبان مفردة للذباب EDC المعالجة في وسط CM-tomato بدون EDC، 20x واحد EDC معاملة الذكور مع سيطرة واحدة الإناث و 20X واحد الذكور السيطرة مع واحدة EDC الإناث المعالجة (أعلى)؛ إعداد 20 صلبان واحدة للتحكم الذباب، 20x واحد الذكور السيطرة مع واحدة الإناث السيطرة (أسفل). الأصفر المتوسطة هي سم تستكمل مع EDC (أعلى) أو المذيبات كتحكم (أسفل)، والأحمر المتوسطة هي الطماطم / CM دون EDC أو المذيبات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توقيت النمو(بروتوكول تقييم الاختلاج2). على اليسار، يظهر هذا الرقم مخطط قفص الجمع الذي يتم فيه وضع البالغين (حوالي 150 أنثى و 50 ذكراً) في حالة تأقلم وتزاوج في الظلام قبل خطوة الترسب (انظر البروتوكول). بعد 2 أيام، يتم استبدال صينية انزلاق القديمة مع واحد مع الطعام الطازج، ويتم التخلص من البيض في 1 ساعة المقبل لأنها غير متزامنة. الآخرة، يتم جمع البيض كل 2 ساعة على صينية منزلقة جديدة، ويتم عدها، ووضعها على الأطباق التي تحتوي على الطماطم / CM تستكمل مع EDC أو مع المذيبات وحدها. يتم الإبلاغ عن البيانات (مجموع البيض المنصوص عليها، والبيض غير المكشوف عنه، الجراء، والبالغين eclosed) على سلسلة من جداول جداول توقيت النمو (يمين). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تقييم العمر. يتم نقل الذباب المتزامن ليوم واحد إلى زجاجة 250 مل مع الطعام الكبار (AM) تكملها EDC (أعلى) أو المذيبات (أسفل) كتحكم، للسماح التغذية (يسار في المخطط). بعد 2-3 أيام، يتم فرز الذباب حسب الجنس ونقلها إلى خمس قوارير (تحتوي على وسيلة المقابلة من زجاجة البداية) لكل جنس، في مجموعات من 20 فردا / قارورة. كل 3 أيام، يتم نقل البالغين إلى قنينات جديدة حتى لا تعد ضرورية (الجزء المركزي من المخطط). على اليمين هو مخطط من الجدول الذي يتم تسجيل البيانات عن كل يوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: منحنيات العمر. على اليسار، يتم الإبلاغ عن جدول تمثيلي حيث تم تسجيل عدد الذباب الميت كل 3 أيام، سواء بالنسبة لمجموعة المعالجة (متوسطة + EDC [0.05 mM EE2]) ولمجموعة التحكم (متوسطة + مذيب)، طوال الفترة التجريبية بأكملها. تم حساب متوسط عمر كل مجموعة باستخدام مبلغ MATRIX. المنتج; المجموعة المعالجة تقصير متوسط عمر مقارنة بمجموعة التحكم. على اليمين، يظهر منحنى بقاء نموذجي من الذباب الذكور تغذية مع متوسط يحتوي على EE2 (0.05 mM) أو الإيثانول فقط للسيطرة. انخفض منحنى الناجين بسرعة أكبر للذباب المعالج من مجموعة التحكم، مع نقطة انخفاض تحول في وقت سابق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدمت ذبابة الفاكهة D. melanogaster على نطاق واسع كنظام نموذج في الجسم الحي للتحقيق في الآثار المحتملة للنظم البيئية مثل DBP28،BPA، 4-NP، 4-tert-OP29،MP30،EP31، 32،DEHP33،وEE234. وقد أدت عدة أسباب استخدامه كنموذج في هذا المجال من البحث. وبصرف النظر عن مزاياه لا جدال فيها كنظام نموذجي، Drosophila تشترك في درجة عالية من الحفاظ على الجينات مع البشر، والتي Drosophila EDC الاختبارات قد تساعد في التنبؤ أو اقتراح الآثار المحتملة على صحة الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن Drosophila تنتمي إلى اللافقاريات، التي هي ممثلة على نطاق واسع في جميع النظم الإيكولوجية وتتطلب تدابير حماية أكبر ضد الآثار الضارة للمراكز المعنية بالقضاء على جميع أشكال الإرهاب. تقع اللافقاريات في قاعدة السلسلة الغذائية وتؤدي وظائف هامة جدا ً في البيئات التي تعيش فيها. وقد أفيد بأن العديد من الـدَرْكَبُ اتَّـماعفية في البيئة قد يكون لها تأثير ضار على تطور وتكاثر عدة أنواع من الحيوانات. Drosophila يقدم ميزة إضافية من استخدامها في المختبر، حيث يمكن إبقاء العوامل التي يحتمل أن تؤثر على التنمية والتكاثر، وعمر تحت السيطرة من أجل عزو أي اختلاف إلى المادة لاختبارها.

هنا نقدم بروتوكولات مفصلة لدراسة آثار التعرض EDC في هذا النظام النموذجي على سمات الحياة التي تنظمهرمونية مثل الخصوبة / الخصوبة، ومعدل النمو، وعمر. لقد قمنا بتحسين هذه البروتوكولات التي جعلت من الممكن التحقيق في آثار EE234،BPA، وBPAF (بيانات غير منشورة) التعرض، ولكن يمكن تكييفها بسهولة لدراسة آثار EDCs أخرى. وعلى وجه الخصوص، يمكن استخدام هذه الاختبارات للتحقيق في كل من مراكز إدوية الصرفة وتركيبات من مختلف مراكز إدوية، مع استنساخ ما يحدث في الطبيعة بشكل أوثق. على الرغم من أنها على ما يبدو، قد تبدو وكأنها اختبارات النمو بسيطة، من المهم أن تعمل وفقا للمبادئ التوجيهية المناسبة، وضمان الدقة واستنساخ45. ومن المعروف جيدا أن الخصوبة, توقيت النمو, وطول العمر في D. الميلانوجاستر يمكن أن تتأثر بالعوامل الخارجية والداخلية. هذه العوامل الحاسمة، بما في ذلك الفترة الضوئية، ودرجة الحرارة، والرطوبة، والتغذية، والكثافة السكانية، والبنية الوراثية، والعمر، يجب أن يتم التحكم فيها بعناية من أجل نتائج البروتوكولات المبلغ عنها. وبغية تقليل عنصر التغير الجيني إلى أدنى حد، ينبغي استخدام سلالة من الأيوجينية. يجب أن يتم تربية هذه السلالة بعناية في حاضنة رطبة، يتم التحكم في درجة حرارتها، مع ضوء طبيعي 12 ساعة: 12 ساعة فترة ضوئية داكنة عند 25 درجة مئوية.

وبالإضافة إلى صيانة بيئة خاضعة للمراقبة، لا بد من تجنب اكتظاظ اليرقات والطيران. وقد أفيد أن اكتظاظ اليرقات يمكن أن يؤثر على توقيت النمو ويحفز على التعبير عن العديد من الجينات، بما في ذلك صدمة الحرارة أو الجينات ذات الصلة بالحصانة، التي تؤثر على اللياقة البدنية الكاملة للذباب البالغ46. أيضا، الذباب الكبار يجب أن يتم الحفاظ عليها في كثافة منخفضة بما فيه الكفاية للسماح بحرية الحركة من أجل تقليل الإجهاد الكبار. وعلاوة على ذلك، من المهم التأكد من أن الذباب تستهلك كميات مماثلة من EDC في كل مجموعة العلاج، مع الأخذ في الاعتبار طعم المركب في تركيزات مختلفة، لأن الذباب تميل إلى تجنب الطعام غير مستساغ. ومن الجوانب الهامة الأخرى لهذه البروتوكولات نوعية الأغذية؛ يجب أن الغذاء أيضا تبدو جيدة، خالية من فقاعات، والبكتيريا الشقوق، وهلم جرا47،48. وعلاوة على ذلك، من الضروري أن نضع في اعتبارنا التزامن، وحالة التزاوج، والتعايش بين الجنسين للذباب لاختبارها. وفي جميع البروتوكولات المبلغ عنها، من المهم أن تكون القنينات الموازية التي يجري تحليلها متشابهة جدا؛ وإلا، سيكون من الصعب فهم أي لتجاهل ذلك أن الحد الأقصى من الاهتمام والممارسة التجريبية الجيدة مطلوبة. وأخيراً، من المهم، باستخدام هذه البروتوكولات لتقييم آثار الغدد الصماء في مجموعات مختارة من مركبات الإنخصازات المنتقلة إلى الـ EDCs، أن تؤخذ في الاعتبار التفاعلات الممكنة مع مراكز إدوية أخرى موجودة في الوسط، مثل ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات أو BPA للقنينات البلاستيكية. في هذا المعنى، يمكن أن يكون من المفيد تغيير عامل مضاد للفطريات، واستخدام قارورة زجاجية، أو إجراء اختبارات تجريبية سواء مع وبدون الملوثات المحتملة.

يمكن أن تكون فحوصات Drosophila المبلغ عنها فعالة للغاية لتقييم أي مواد كيميائية أو خليط من المواد الكيميائية، مثل EDCs، من خلال تقييم الآثار المحتملة على سمات الحياة التي تخضع للتنظيم الهرموني، مثل التكاثر، والتنمية، والعمر. ومع ذلك، لا يمكن لهذه الاختبارات أن تعمل على تحديد آلية الغدد الصماء المسؤولة عن الآثار الضارة EDC بوضوح. للتغلب على هذا القصور، من الممكن تنفيذ نفس البروتوكولات باستخدام إشارات الإسناد الإلكتروني المرجعية التي تستحضر استجابات تمثل طريقة معينة للعمل على نظام الغدد الصماء الحشرية (مثل المبيدات الحشرية من الجيل الثالث التي تعمل كJH أو ecdysteroid ناهض / خصم)22. بدلا من ذلك، فمن الممكن أيضا استخدام نقاط النهاية الجزيئية، وإجراء التحليل الجزيئي على الجينات المحددة التي يتم تنظيمها هرمونيا والتي تعتبر المؤشرات الحيوية التنبؤية والمحددة لتعطيل الغدد الصماء34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفون أوسورسولينا بيتيلو على الدعم التقني. ويشكر المؤلفان الدكتورة مارياروساريا أليتا (CNR) على الدعم الببليوغرافي. ويشكر المؤلفون الدكتور غوستافو داميانو ميتا على تقديمهم إلى عالم مركز إدو. ويشكر المؤلفان لايكا ميكروسيستمز وباسكوال رومانو على مساعدتهما. تم دعم هذا البحث من قبل مشروع PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; الالتزام: PO FESR 2014-2020 كامبانيا; مشروع PO FESR كامبانيا 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE بير IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE النانوتكنولوجي الحيوي ATTIVE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 149، الميلانوجاستر،المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء، الخصوبة، التنمية، العمر
طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في <em>الميلانوجاستر Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter