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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Méthodes pour tester la perturbation endocrinienne dans le mélanogaster drosophila

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Les perturbateurs chimiques endocriniens (CED) représentent un grave problème pour les organismes et pour les milieux naturels. Drosophila melanogaster représente un modèle idéal pour étudier les effets d'EDC in vivo. Ici, nous présentons des méthodes pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d'EDC sur la fécondité, la fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche.

Abstract

Ces dernières années, il y a eu de plus en plus de preuves que tous les organismes et l'environnement sont exposés à des produits chimiques hormonaux, connus sous le nom de produits chimiques perturbateurs endocriniens (CED). Ces produits chimiques peuvent modifier l'équilibre normal des systèmes endocriniens et entraîner des effets néfastes, ainsi qu'un nombre croissant de troubles hormonaux dans la population humaine ou une croissance perturbée et une reproduction réduite chez les espèces sauvages. Pour certains EDC, il y a des effets documentés sur la santé et des restrictions sur leur utilisation. Cependant, pour la plupart d'entre eux, il n'y a toujours aucune preuve scientifique en ce sens. Afin de vérifier les effets endocriniens potentiels d'un produit chimique dans l'organisme entier, nous devons le tester dans les systèmes modèles appropriés, ainsi que dans la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Ici nous rapportons les protocoles in vivo détaillés pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d'EDC sur la fécondité/fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche. Au cours des dernières années, nous avons utilisé ces traits de vie Drosophila pour étudier les effets de l'exposition à 17-ethinylestradiol (EE2), bisphénol A (BPA), et bisphénol AF (BPA F). Au total, ces essais couvraient toutes les étapes de la vie de Drosophila et permetaient d'évaluer la perturbation endocrinienne dans tous les processus à médiation hormonale. Les tests de fécondité/fertilité et de synchronisation du développement ont été utiles pour mesurer l'impact d'EDC sur la performance reproductrice de la mouche et sur les stades de développement, respectivement. Enfin, l'exemple de durée de vie impliquait une exposition chronique d'EDC aux adultes et mesurait leur survie. Cependant, ces traits de vie peuvent également être influencés par plusieurs facteurs expérimentaux qui ont dû être soigneusement contrôlés. Donc, dans ce travail, nous suggérons une série de procédures que nous avons optimisées pour le bon résultat de ces essais. Ces méthodes permettent aux scientifiques d'établir une perturbation endocrinienne pour n'importe quelle EDC ou pour un mélange de différentes EDC dans Drosophila, bien que pour identifier le mécanisme endocrinien responsable de l'effet, d'autres essais pourraient être nécessaires.

Introduction

Les activités humaines ont libéré dans l'environnement une quantité massive de produits chimiques, qui représentent un grave problème pour les organismes et pour les écosystèmes naturels1. Parmi ces polluants, on estime qu'environ 1 000 produits chimiques différents peuvent modifier l'équilibre normal des systèmes endocriniens; selon cette propriété, ils sont classés comme produits chimiques perturbateurs endocriniens (EDC). Plus précisément, sur la base d'une définition récente de la Société endocrinienne, les EDC sont « un produit chimique exogène, ou mélange de produits chimiques, qui peut interférer avec n'importe quel aspect de l'action hormonale »2. Au cours des trois dernières décennies, il y a eu de plus en plus de preuves scientifiques que les EDC peuvent affecter la reproduction et le développement des animaux et des plantes3,4,5,6,7, 8. En outre, l'exposition à EDC a été liée à la prévalence croissante de certaines maladies humaines, y compris le cancer, l'obésité, le diabète, les maladies thyroïdiennes, et les troubles du comportement9,10,11.

Mécanismes généraux d'EDC

En raison de leurs propriétés moléculaires, les EDC se comportent comme des hormones ou des précurseurs d'hormones3,5,6,7,8,9, 10,11,12. En ce sens, ils peuvent se lier au récepteur d'une hormone et perturber les systèmes endocriniens soit en imitant l'activité hormonale ou en bloquant les hormones endogènes liant. Dans le premier cas, après la liaison au récepteur, ils peuvent l'activer comme son hormone naturelle ferait. Dans l'autre cas, la liaison de l'EDC au récepteur empêche la liaison de son hormone naturelle, de sorte que le récepteur est bloqué et ne peut plus être activé, même en présence de son hormone naturelle3. En conséquence, les EDC peuvent affecter plusieurs processus, tels que la synthèse, la sécrétion, le transport, le métabolisme, ou l'action périphérique des hormones endogènes qui sont responsables du maintien de l'homéostasie, de la reproduction, du développement, et/ou du comportement de l'organisme. La liaison des récepteurs n'est pas le seul moyen d'action décrit jusqu'à présent pour les CED. Il est maintenant clair qu'ils peuvent également agir en recrutant des coactivateurs ou des corepresseurs dans des voies enzymatiques ou en modifiant des marqueurs épigénétiques déréglementant l'expression génique10,11,12,13 ,14, avec des conséquences non seulement pour la génération actuelle, mais aussi pour la santé des générations à venir8.

Hormones drosophiles

Les effets potentiels de certains CED ont été largement étudiés, tant chez les espèces sauvages que dans plusieurs systèmes modèles où les mécanismes endocriniens sont raisonnablement bien connus. Pour les invertébrés, les systèmes endocriniens qui influencent la croissance, le développement et la reproduction ont été largement caractérisés chez les insectes pour plusieurs raisons, impliquant leur utilisation étendue dans le domaine de la recherche biologique, leur importance économique, et enfin le développement d'insecticides capables d'interférer spécifiquement avec le système hormonal des insectes nuisibles.

En particulier, chez les insectes, la mouche des fruits D. melanogaster s'est avérée être un système modèle très puissant pour évaluer les effets endocriniens potentiels des SEE. Dans D. melanogaster, ainsi que chez les vertébrés, les hormones jouent un rôle important tout au long du cycle de vie. Dans cet organisme, il ya trois principaux systèmes hormonaux, qui impliquent l'hormone stéroïde 20-hydroxyecdysone (20E)15,16, l'hormone juvénile sesquiterpenoid (JH)17, et les neuropeptides et peptide / protéines hormones18. Ce troisième groupe se compose de plusieurs peptides découverts plus récemment mais clairement impliqués dans une grande variété de processus physiologiques et comportementaux, tels que la longévité, l'homéostasie, le métabolisme, la reproduction, la mémoire et le contrôle locomoteur. 20E est homologue aux hormones stéroïdes cholestérol-dérivées telles que l'estradiol, alors que JH partage quelques similitudes avec l'acide rétinoïque ; les deux sont les hormones les plus connues dans Drosophila19,20. Leur équilibre est essentiel dans la coordination de la mue et de la métamorphose, ainsi que dans le contrôle de plusieurs processus post-développementaux, tels que la reproduction, la durée de vie et le comportement21, offrant ainsi différentes possibilités pour tester le système endocrinien perturbation dans Drosophila. En outre, les hormones ecdysteroid et les JHsont les principales cibles des insecticides dits de troisième génération, développés pour interférer avec les processus développementaux et reproducteurs médiés par le système endocrinien chez les insectes. Le mode d'action agoniste ou antagoniste de ces produits chimiques est bien connu, et donc ils peuvent servir de normes de référence pour évaluer les effets des EDC potentiels sur la croissance, la reproduction et le développement des insectes22. Par exemple, la métahoprène, qui a été largement utilisée dans la lutte contre les moustiques et autres insectes aquatiques23,24, agit comme agoniste JH et réprime la transcription des gènes induite par 20E et la métamorphose.

En plus des hormones, la superfamille des récepteurs nucléaires (NR) dans Drosophila est également bien connue; il se compose de 18 facteurs de transcription évolutivement conservés impliqués dans le contrôle des voies de développement hormonales dépendantes, ainsi que la reproduction et la physiologie25. Ces NR d'hormone appartiennent à chacun des six sous-types de superfamille de NR, y compris ceux impliqués dans la neurotransmission26, deux pour l'acide rétinoïque NRs, et ceux pour les NRs stéroïdes qui, dans les vertébrés, représentent l'une des cibles primaires des EDCs27.

La drosophile comme système modèle d'étude des DEC

Actuellement, sur la base de propriétés moléculaires, plusieurs agences environnementales à travers le monde attribuent le potentiel d'interférer avec les systèmes endocriniens à différents produits chimiques d'origine humaine. Étant donné que les SEE constituent un problème mondial et omniprésent pour l'environnement et les organismes, l'objectif global de la recherche dans ce domaine est de réduire leur fardeau de morbidité et de protéger les organismes vivants contre leurs effets néfastes. Afin d'approfondir la compréhension des effets endocriniens potentiels d'un produit chimique, il est nécessaire de le tester in vivo. À cette fin, D. melanogaster représente un système de modèle valide. À ce jour, la mouche des fruits a été largement utilisée comme modèle in vivo pour évaluer les effets de plusieurs SEE environnementales; il a été signalé que l'exposition à plusieurs EDC, tels que le phtalate de dibutyle (DBP)28, bisphénol A (BPA), 4-nonylphénol (4-NP), 4-tert-octylphénol (4-tert-OP)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-éthylhexyl) phtalate (DEHP)33, et 17-ethinylestradiol (EE2)34, influence le métabolisme et les fonctions endocriniennes comme dans les modèles vertébrés. Plusieurs raisons ont conduit à son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Au-delà d'une excellente connaissance de ses systèmes endocriniens, d'autres avantages incluent son cycle de vie court, son faible coût, son génome facilement manipulable, une longue histoire de recherche et plusieurs possibilités techniques (voir le site Web flyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fournit également un modèle puissant pour étudier facilement les effets transgénérationnels et les réponses des populations aux facteurs environnementaux8 et évite les questions éthiques pertinentes pour les études in vivo chez les animaux plus élevés. En outre, la mouche des fruits partage un degré élevé de conservation des gènes avec les humains, ce qui pourrait permettre à Drosophila EDC d'essayer de prédire ou de suggérer les effets potentiels de ces produits chimiques pour la santé humaine. En plus d'élargir la compréhension des effets sur la santé humaine, Drosophila peut aider à évaluer les risques d'exposition d'EDC à l'environnement, tels que la perte de biodiversité et la dégradation de l'environnement. Enfin, la mouche des fruits offre l'avantage supplémentaire d'être utilisée dans les laboratoires, où les facteurs susceptibles d'affecter son développement, sa reproduction et sa durée de vie peuvent être maîtrisés afin d'attribuer toute variation à la substance à tester.

Dans cet esprit, nous avons optimisé des tests de condition physique simples et robustes pour déterminer les effets d'EDC sur certains traits hormonaux Drosophila, tels que la fécondité/fertilité, le moment du développement et la durée de vie adulte. Ces essais ont été largement utilisés pour certains EDCs23,24,25,26,27. En particulier, nous avons utilisé les protocoles suivants pour évaluer les effets de l'exposition à l'oestrogène synthétique EE234 et au BPA et au bisphénol AF (BPA F) (données non publiées). Ces protocoles peuvent être facilement modifiés pour étudier les effets d'un EDC donné à la fois, ainsi que les effets combinés de plusieurs EDC dans D. melanogaster.

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Protocol

1. Préparation des aliments

  1. Pour l'entretien des stocks et pour la croissance larvaire, utilisez un milieu de semoule de maïs contenant 3 % de levure en poudre, 10 % de saccharose, 9 % de semoule de maïs précuite, 0,4 % d'agar, par la suite appelé maïs moyen (CM).
    1. Mettre 30 g de levure dans 100 ml d'eau du robinet, porter à ébullition et laisser bouillir pendant 15 min.
    2. Séparément, bien mélanger 90 g de semoule de maïs précuite, 100 g de sucre et 4 g d'agar dans 900 ml d'eau du robinet.
    3. Porter la solution à ébullition, baisser le feu et cuire 5 minutes en remuant continuellement.
    4. Après 5 minutes, ajouter la solution de levure chaude et laisser mijoter encore 15 minutes.
    5. Éteignez la source de chaleur et laissez la solution refroidir à environ 60 oC.
    6. Ajouter 5 mL/L de 10 % de méthyle 4-hydroxybenzoate dans l'éthanol, bien mélanger et laisser s'asseoir pendant 10 min.
      REMARQUE: Soyez prudent avec la quantité de méthyle 4-hydroxybenzoate, étant donné qu'une forte concentration de fongicide pourrait être mortelle pour les larves.
    7. Distribuer le milieu en flacons/bouteilles : 8 ml dans chaque flacon de mouche (25 mm x 95 mm), 3 ml dans chaque flacon de mouche (22 mm x 63 mm) et 60 ml dans chaque bouteille de mouche (250 ml).
    8. Couvrir les flacons de toile à fromage et les laisser sécher à température ambiante (RT) pendant 24 h avant le stockage.
    9. Calibrer expérimentalement la consistance et l'hydratation du CM en modifiant soit la quantité d'agar utilisée et/ou les temps de refroidissement/séchage.
      Remarque : les flacons débranchés, en boîte et enveloppés sont stables pendant environ 15 jours à 4 oC.
  2. Pour les adultes Drosophila, utilisez un milieu contenant 10% de levure en poudre, 10% de saccharose, 2% d'agar, par la suite appelé milieu adulte (AM).
    1. Mélanger 10 g de levure en poudre, 10 g de saccharose, 2 g d'agar dans 100 ml d'eau distillée.
    2. Porter ce mélange à ébullition deux fois, avec un intervalle de 3 minutes, ou jusqu'à ce que l'agar soit dissous, à l'aide d'un four à micro-ondes.
    3. Une fois que la solution refroidit à 60 oC, ajouter 5 mL/L de 10 % de méthyle 4-hydroxybenzoate dans l'éthanol, bien mélanger et distribuer dans des flacons (10 ml par flacon).
    4. Couvrir les flacons de toile à fromage et les laisser sécher à RT pendant 24 h avant de les ranger.
      REMARQUE : les flacons débranchés, en boîte et enveloppés sont stables pendant environ 15 jours à 4 oC.
  3. Pour l'évaluation de la fécondité et de la fertilité, utilisez le milieu de jus de tomate-maïs Drosophila.
    1. Verser 70 ml de semoule de maïs chaude dans un bécher de 100 ml et ajouter 30 ml de jus de tomate (30 % v/v).
    2. Bien mélanger avec un robot culinaire et une pipet de 3 ml dans de petites fioles.
    3. Couvrir les flacons de toile à fromage et les laisser sécher à RT pendant 24 h avant le stockage.
      REMARQUE : les flacons débranchés, en boîte et enveloppés sont stables pendant environ 15 jours à 4 oC.
  4. Pour la collecte d'embryons, utiliser des plaques d'agar, contenant 3 % d'agar, 30 % de sauce tomate et 3 % de sucre.
    REMARQUE: veillez à ne pas faire de bulles lors de la coulée du milieu dans les assiettes.

2. Dosing Drosophila EDC

  1. Préparer une solution de stock appropriée pour dissoudre l'EDC sélectionnée dans le solvant approprié. Pour l'EE2 (poids moléculaire 296.403), dissoudre 1,48 g dans 10 ml d'éthanol 100% pour faire une solution de stock de 0,5 M et stocker à -80 oC.
    MISE EN GARDE: Les SEE sont considérés comme des polluants environnementaux et des précautions doivent être prises pour les manipuler.
  2. Diluer la solution de stock EE2 dans 10% d'éthanol dans l'eau (v/v) afin d'obtenir une solution de 100 mM. Faire les dilutions suivantes (0,1 mM, 0,5 mm et 1 mm) dans les aliments CM, en commençant par la plus faible concentration et en utilisant la même concentration finale de solvant pour chaque groupe de traitement. Pour les flacons de commande utiliser le même volume du solvant seul.
    Remarque : il est recommandé de maintenir la concentration finale du solvant aussi bas que possible, en gardant à l'esprit que la concentration finale d'éthanol ne doit pas dépasser 2 % dans les aliments à la mouche.
  3. Ajouter la solution contenant la bonne dilution de l'EDC sélectionné à l'aliment à base de semoule de maïs avant la solidification, bien mélanger avec un robot culinaire, distribuer 10 ml en flacons, couvrir de gaze de coton et laisser sécher à RT pendant 16 h avant de l'utiliser.
    REMARQUE : utilisez ce support immédiatement après sa préparation.
  4. Pour l'élevage adulte, préparer différentes solutions EE2 de travail (10 mM, 50 mm et 100 mM, respectivement) dans 10 % d'éthanol dans l'eau (v/v) et une couche de 100 l de chacune sur la surface de l'AM, afin d'obtenir la concentration souhaitée de l'EE2 (0,1 mM) , 0,5 mM et 1 mm). Pour l'utilisation de commande même volume du solvant seul.
    REMARQUE : Ajoutez également la solution contenant la bonne dilution de l'EDC sélectionnée à une petite quantité d'AM dans un tube conique de 50 ml, vortex ezinez complètement et stratiez 1 ml de celui-ci sur la surface des flacons AM.
    1. Couvrir les flacons de gaze de coton, laisser sécher à RT pendant 12-16 h sous une douce agitation et les utiliser immédiatement.
      REMARQUE : le processus de séchage doit être ajusté expérimentalement parce qu'il dépend de l'humidité ambiante.
  5. Pour l'alimentation, ajouter à la fois la solution contenant la bonne dilution de l'EDC sélectionnée (EE2 0,1 mM, 0,5 mm et 1 mm) et un colorant (p. ex., le colorant rouge no 40 à 1 mg/mL)35 au CM avant la solidification, mélanger fortement avec un robot culinaire, puis se départir e en flacons.

3. L'élevage des mouches

  1. Utilisez une souche isogénique robuste, comme l'Oregon R, maintenue par plusieurs générations en laboratoire.
  2. Gardez les mouches dans un incubateur humidifié à température contrôlée, avec une lumière naturelle de 12 h : 12 h photopériode foncée à 25 oC dans des flacons contenant de la nourriture CM.
  3. Dans chaque jeu d'enfant, utilisez des flacons à RT.

4. Nourrir l'assay

REMARQUE: Cet essai est recommandé pour vérifier si la présence de la SEE sélectionnée dans le milieu pourrait affecter l'alimentation des mouches.

  1. Mettez 15 jeunes mouches dans des flacons contenant cm complété avec différentes concentrations de l'EDC sélectionné et un aliment colorant. Laissez les mouches se nourrir sur les médias pendant 1 jour.
    REMARQUE :par exemple, utilisez un colorant rouge no 4035 (1 mg/mL).
  2. Mettez 15 jeunes mouches dans des flacons contenant CM complété avec le solvant seul et un colorant alimentaire pour le contrôle. Laissez les mouches se nourrir sur les médias pendant 1 jour.
  3. Anesthésiez individuellement chaque groupe de mouches à l'éther.
    1. Transférer les mouches de chaque groupe dans un récipient en verre cylindrique (éherisateur) avec un entonnoir inséré dans l'extrémité ouverte, inverser le flacon sur l'entonnoir et en tapant doucement les deux récipients ensemble pour faire tomber les mouches dans l'étheriseur.
      REMARQUE:  L'entonnoir les empêchera de sortir de l'étherisateur.
    2. Knock vole vers le bas en tapant doucement l'éthéisseur sur une surface molle, comme un tapis de souris, et remplacez rapidement l'entonnoir par un coton imbibé d'éther et bouchon de gaze.
    3. Attendez environ 1 min jusqu'à ce que les mouches tombent au fond et cessent de bouger.
      REMARQUE : ne dépassez pas le temps ou les mouches mourront.
  4. Placez les mouches immobilisées sous un microscope stéréo et comparez la coloration abdominale de chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin.

5. Défaut de travail/Test de fertilité

  1. Pour chaque concentration d'EDC, préparez 3 flacons de mouches, appelés flacons parentaux par la suite, avec 8 femelles et 4 mâles dans des aliments CM/EDC de 10 mL; pour le contrôle préparer 6 flacons de mouches avec 8 femelles et 4 mâles dans 10 mL CM aliments complétés avec solvant. L'arrière vole dans un incubateur à 25 oC.
    REMARQUE : évitez la surpopulation des larves pendant leur développement et essayez d'utiliser des densités larvaires constantes entre les traitements.
  2. Après 4 jours, retirez les parents et retournez les flacons dans l'incubateur pendant 5 jours de plus.
  3. En fin d'après-midi 9, retirer toutes les mouches nouvellement des flacons et mettre les flacons dans un incubateur à 18 oC pendant la nuit.
    REMARQUE: Cette suppression doit être faite très soigneusement, en vérifiant la surface du puits moyen.
    1. Le matin du jour 10, pour chaque groupe de traitement, recueillir les femelles vierges et les jeunes mâles en deux groupes, sous anesthésie légère co 2. Subdiviser au hasard chaque groupe de mouches en petits sous-groupes (10 femelles et 20 mâles par flacon) en flacons indépendants remplis de CM correspondant frais.
      1. Répétez l'étape 5.3.1 en prenant soin à la fois d'enlever soigneusement toutes les mouches des flacons 8-10 h avant la collecte et laisser les flacons à 18 oC, jusqu'à obtenir au moins 30 femelles vierges et 30 mâles pour chaque concentrations edC et au moins 90 femelles vierges et 90 mâles pour le contrôle.
    2. Loger ces groupes de mouches à 25 oC jusqu'à ce qu'ils soient âgés de 4 jours après l'éclosion, en les transférant dans de nouvelles flacons contenant un milieu correspondant frais tous les deux jours.
      Note: 4 jours est suffisant pour que les mouches deviennent des adultes matures, mais il est très loin du début de la sénescence.
    3. Après deux jours, assurez-vous qu'il n'y a pas de larves dans les flacons des femelles. Si c'est le cas, les mouches ne sont pas utilisables parce qu'elles ne sont pas vierges et doivent être jetées.
  4. Utilisez 20 mouches simples de chaque sexe pour chaque groupe de traitement pour mettre en place 20 croisements simples en petites fioles contenant du milieu cm-tomate frais sans EDC, comme décrit ci-dessous.
    1. À chaque groupe de traitement, attribuer une série différente de nombres séquentiels, qui l'identifie de façon unique et étiquette les flacons respectifs; p. ex., groupe1 (solvant seul) de 1 à 20, groupe 2 (concentration d'EDC x) de 20 à 40, et ainsi de suite.
    2. Faire une feuille de calcul de fertilité pour enregistrer les différentes séries, chacune correspondant à un groupe de traitement.
    3. Pour chaque sexe anesthésiez toutes les mouches appartenant à chaque groupe de traitement sous la lumière CO2 et les transférer au hasard comme suit.
      1. Transférer une femelle traitée par solvant dans une petite fiole contenant du milieu frais de CM-tomate sans EDC et ajouter un mâle traité par solvant pour la croix témoin.
        Remarque : le jus de tomate doit être ajouté au milieu pendant sa préparation parce que le milieu foncé augmente le contraste avec les embryons blancs.
      2. Transférer une femelle traitée par EDC dans une petite fiole contenant de la tomate CM fraîche sans EDC et ajouter un mâle traité par solvant pour chaque traitement.
      3. Transférer un mâle traité par EDC dans un petit flacon contenant du milieu frais de CM-tomate sans EDC et ajouter une femelle traitée par solvant pour chaque traitement.
    4. Abritez toutes ces croix simples à 25oC.
  5. Transférer chaque paire d'accouplement dans des flacons de CM-tomates fraîches sans EDC tous les jours pendant les dix jours suivants. Étiqueter les flacons répliqués de chaque série de façon séquentielle; p. ex. 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c et rapportez ces nombres sur la feuille de calcul de fertilité.
  6. Inspectez visuellement chaque flacon chaque jour pour les œufs et rapportez leur numéro sur la feuille de calcul de fertilité.
  7. Enregistrez chaque flacon et, lorsque de nouvelles mouches commencent à émerger, enregistrez également le nombre quotidien de descendants adultes au cours de la période de 10 jours. Après 10 jours à partir de l'accouplement initial, retirez les parents.
    REMARQUE : jetez la fiole dans laquelle l'un ou les deux parents sont morts; en cas d'évasion de l'un ou des deux parents, inclure dans l'analyse toutes les données jusqu'au jour où ils ont été perdus.
  8. Sommez le nombre quotidien d'œufs et le nombre quotidien de descendants adultes de chaque groupe de traitement, pour obtenir la fécondité/fertilité totale, la production moyenne d'ovules et de descendants adultes par une mouche pendant dix jours, et le rapport entre la descendance totale et le nombre total d'œufs pondus. Calculer les différences en pourcentage de chaque valeur de traitement par rapport au contrôle.
  9. Effectuez trois expériences indépendantes pour chaque groupe de mouches, en utilisant un minimum de 10 mouches pour chaque groupe de traitement.
  10. Effectuer une analyse statistique pour comparer les différents groupes.

6. Calendrier de développement

REMARQUE: Dans les deux protocoles alternatifs suivants, le moment du développement est évalué en comptant à la fois le nombre de pupas souper qui se forment par jour et le nombre de descendants adultes qui s'élit par jour.

  1. Protocole d'eclosion 1
    1. Pour chaque groupe de traitement, mettre en place 10 flacons de jeunes (2 jours), des mouches en bonne santé, chacune avec 6 femelles et 3 mâles dans des aliments de 10 ml de semoule de maïs sans EDC.
    2. Laissez les mouches sur la nourriture pendant 24 h, et laissez-les s'accoupler.
    3. Préparer 10 flacons parallèles par groupe de traitement avec 10 ml chacun d'aliments frais de semoule de maïs complétés par différentes concentrations d'EDC ou le solvant seul pour le contrôle. Transfert des mouches accouplées à ces nouvelles fioles.
      REMARQUE : pour chaque groupe de traitement, assignez une série différente de nombres séquentiels, qui l'identifie de façon unique et étiquete les flacons respectifs.
    4. Faites une feuille de calcul de développement pour enregistrer les différentes séries.
    5. Laisser les mouches pondre pendant 16 h. Ensuite, retirez les parents des flacons.
      REMARQUE: Les mouches parentes peuvent être utilisées pour répéter l'étape 6.1.5, en les transférant à d'autres flacons correspondants.
    6. Incuber les flacons pendant 3-4 jours à 25 oC, ou jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de forme de chiots. Chaque jour, comptez le nombre de jeunes chiots dans chaque flacon et signalez-le sur la feuille de calcul du développement. Pour éviter de compter deux fois la même chiot, écrivez un numéro en séquence à chaque chiot avec un marqueur permanent à l'extérieur de la fiole.
    7. À partir du jour 9, comptez quotidiennement le nombre d'adultes émergents jusqu'à ce qu'aucun adulte n'émerge plus, et signalez-le sur la feuille de calcul du développement.
    8. À partir de ces données brutes, calculez la période larvaire moyenne, la période pupale moyenne, ainsi que les différences en pourcentage de chaque traitement par rapport au contrôle.
    9. Effectuez trois expériences indépendantes pour chaque groupe de mouches, en utilisant un minimum de 5 flacons pour chaque groupe de traitement.
    10. Effectuer une analyse statistique pour comparer les différents groupes.
  2. Protocole d'eclosion d'assay 2
    1. Les femelles jeunes et en bonne santé (environ 150) et mâle (environ 50) vole sur une cage de collecte (Tableau des matériaux) avec le milieu d'agar-tomate complété avec la pâte fraîche de levure de boulanger (3 g de levure de boulanger dans 5 ml d'eau), par la suite appelé plateau de pose, pendant 2 jours à 25 oC.
    2. Pendant ces 2 jours, permettre aux mouches de s'acclimater à la cage dans un endroit sombre et calme, avant de commencer la collecte des œufs, et changer le plateau de ponte deux fois par jour.
    3. Le troisième jour, changer le plateau de pose tôt le matin. Après 1 h, remplacer le plateau de ponte, en jetant ces œufs pondus.
    4. Laisser les mouches pondre pendant 2 h et remplacer par un plateau de ponte frais.
      REMARQUE: Au jour 3, un bon plateau de ponte devrait produire 100-200 œufs en 2 h.
    5. Pour chaque groupe de traitement, préparez une série de trois plats de 60 mm contenant des aliments de semoule de maïs tomate complétés par la concentration correspondante d'EDC ou avec du solvant seul et rapportez chaque série dans la feuille de calcul du calendrier de développement. Alternativement, si vous préférez, utilisez des flacons au lieu de plats.
    6. Ramassez délicatement les œufs au microscope à l'aide d'un pinceau ou d'une sonde et transférez-les vers le haut du milieu dans chaque plat/flacon. Afin de faciliter le comptage, sur le plateau de ponte, disposer les œufs en 5 groupes de 10 chacun et les transférer un à la fois.
      REMARQUE: Répétez l'étape 6.2.4 autant de fois que nécessaire pour obtenir suffisamment d'embryons.
    7. Loger tous ces plats/flacons à 25 oC. Entreposez également chaque plateau de pontàe à 25 oC et comptez le nombre total d'œufs pondus.
    8. Après 24-30 h, vérifiez chaque plat/vial sous un stéréomicroscope et comptez à la fois le nombre d'œufs blancs non fécondés et le nombre d'embryons morts foncés.
    9. Soustrayez le nombre d'œufs blancs non fécondés de la valeur des 50 œufs transférés afin d'obtenir la valeur « embryons totales » par plat/vial. Le nombre d'embryons morts foncés peut être utilisé pour déterminer les effets toxiques potentiels d'EDC pendant l'embryogenèse.
    10. Répéter les étapes 6.1.6-6.1.10 du Protocole d'eclosion 1.

7. Protocole sur la durée de vie

  1. Mettre en place 20 flacons de mouches avec 8 femelles et 4 mâles et loger à 25 oC en CM (10 ml chacun).
  2. Après 4 jours, jetez les mouches et placez les flacons dans l'incubateur.
    REMARQUE : ces mouches peuvent être utilisées pour recommencer à obtenir d'autres cohortes synchronisées selon l'âge des mouches.
  3. En fin d'après-midi du jour 9, retirez toutes les mouches nouvellement des flacons et retournez les flacons à l'incubateur.
    Remarque : quelques adultes devraient commencer à se refermer dès le neuvième jour; jeter ces mouches permet de recueillir un nombre maximum de mouches synchronisées, en évitant la sélection négligente de l'émergence précoce.
  4. 16-24 h plus tard, transférer les mouches adultes (1 jour) des deux sexes en quatre groupes de bouteilles de 250 ml contenant des aliments AM complétés par trois concentrations différentes d'EDC et un avec le solvant seul. Si nécessaire, collectez un autre lot le lendemain.
  5. Maintenir les mouches à 25 oC pendant 2 à 3 jours pour leur permettre de s'accoupler.
    REMARQUE : le jour du transfert aux flacons de nourriture AM correspond au premier jour de l'âge adulte.
  6. Après deux-trois jours, trier chaque cohorte de mouches par sexe en deux groupes sous anesthésie légère de CO 2. Subdiviser aléatoirement chaque sexe en cinq flacons par traitement à une densité de 20 individus par flacon, jusqu'à ce qu'il y ait trois répliques de 5 flacons parallèles pour chaque sexe par traitement.
    REMARQUE: Travailler avec de petits groupes de mouches afin d'éviter d'éventuels problèmes de santé durables en raison du temps d'exposition long au CO2.
  7. Préparer une feuille de calcul de durée de vie dans laquelle le nombre de mouches mortes est soustrait du nombre de mouches survivantes au transfert précédent, de manière à obtenir automatiquement le nombre de survivants à chaque transfert.
  8. Transférer les mouches dans de nouvelles fioles contenant la nourriture correspondante tous les 3 jours en même temps et vérifier la mort.
    REMARQUE: le transfert doit avoir lieu sans anesthésie qui pourrait avoir un effet négatif à long terme sur la longévité de la mouche.
    1. À chaque transfert, enregistrez l'âge des mouches et le nombre de mouches mortes.
      REMARQUE : le nombre de mouches survivantes est automatiquement calculé dans la feuille de calcul, mais il est recommandé de le vérifier visuellement. Les mouches qui s'échappent accidentellement ou meurent pendant le transfert ne doivent pas être prises en considération. Veillez à ne pas compter deux mouches mortes transportées au nouveau flacon signalant cette note dans la feuille de calcul.
    2. Répétez les étapes 7.8 et 7.8.1 jusqu'à ce que toutes les mouches meurent.
  9. Pour chaque groupe de traitement, créez une courbe de survie comme le montre la figure6, afin d'afficher la probabilité de survie d'une mouche à un moment donné.
  10. Effectuez trois expériences indépendantes pour chaque groupe de mouches de traitement, en utilisant 100 mouches nouvellement fermées pour chaque expérience.
  11. Préparer un tableau dans lequel déclarer la durée de vie moyenne (jours de survie moyen de toutes les mouches pour chaque groupe), la demi-temps de la mort (période de temps en jours nécessaire pour atteindre 50% de mortalité) et la durée de vie maximale (quantité maximale de jours nécessaires pour atteindre 90% de mortalité).
  12. Calculer les différences de pourcentage entre chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin.
  13. Effectuer une analyse statistique pour comparer les différents groupes de traitement.

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Representative Results

Dans cette section, les étapes clés des protocoles ci-dessus sont signalées sous la forme de schémas simplifiés. Étant donné que les mouches ont tendance à éviter les composés désagréables, la première chose à faire est d'essayer le goût de la EDC sélectionnée. Cela peut être fait en mélangeant un colorant alimentaire (par exemple, colorant alimentaire rouge no 40)35 avec l'aliment complété avec l'EDC sélectionné à diverses doses ou avec le solvant seul. Les mouches nourries sur ces supports sont examinées au microscope stéréomicroscope et l'apport alimentaire est estimé par leur coloration abdominale (figure 1). Une situation typique désirée est montrée dans la figure 1 avec deux femelles adultes : une alimentée sur le milieu contenant l'EDC choisi et une sur le milieu ne contenant pas l'EDC, présentant toutes deux la même coloration dans leur abdomen.

Il a été largement admis que les EDC, comme les hormones naturelles, ont des effets à des doses extrêmement faibles et qu'il n'y a pas une relation simple et linéaire entre la dose et l'effet29, avec des doses plus élevées n'ayant pas nécessairement un effet plus important36, 37. Ainsi, plutôt qu'une approche dose-réponse, afin d'évaluer pleinement leurs impacts, il est conseillé d'utiliser plus de doses, à partir de concentrations pertinentes pour l'environnement ou pour d'autres organismes. Quoi qu'il en soit, il est important d'établir le goût d'EDC à chaque concentration utilisée pour s'assurer que les mouches digèrent des quantités comparables d'EDC dans chaque groupe de traitement (figure 2).

La perturbation endocrinienne affecte de nombreux traits importants de la physiologie animale tels que la fertilité, la longévité et le développement qui, par conséquent, sont des critères d'évaluation utiles pour tester les CED. Pour les protocoles ci-dessus, que nous avons optimisés pour mesurer les effets d'EDC sur ces traits de vie Drosophila, les considérations primaires sont qu'il est impératif d'utiliser des mouches jeunes et saines qui devraient être correctement manipulées avant l'essai. Dans cet esprit, une grande attention doit être accordée à la production, la manutention et le stockage de la nourriture utilisée. En outre, il faut veiller à utiliser le meilleur solvant pour la CED sélectionnée à des concentrations finales appropriées (c.-à-d. moins de 1 % pour le sulfoxide de diméthyle [DMSO] et moins de 2 % pour l'éthanol)30.

La fécondité et la fertilité ont été utilisées pour évaluer le succès reproducteur chez D. melanogaster. La figure 3 montre un schéma du protocole utilisé. La fécondité est mesurée expérimentalement comme le nombre total d'œufs pondus, tandis que la fertilité est mesurée comme la progéniture adulte totale. Basé sur la considération que la production d'oeufs dans les 10 premiers jours de la vie adulte est une bonne référence pour la production d'oeufs/progéniture de vie adulte entière d'un organisme38,39, la fertilité et les essais de fécondité peuvent être effectués pendant 10 jours par à l'aide de 4 mouches d'un jour éclos à partir des larves exposées. Il est important d'essayer d'obtenir des valeurs similaires dans les flacons parallèles de chaque groupe; autrement, il serait difficile d'imaginer quel tube retirer de l'analyse. Il est donc conseillé d'examiner quotidiennement chaque flacon de réplique pour éviter un environnement stressant, comme les aliments secs ou liquéfiés; à partir de 20 croisements simples, il est recommandé d'obtenir au moins 10 flacons dans de bonnes conditions dans lesquelles les deux parents ont été en vie pendant 10 jours. Les nombres d'œufs et de descendance adulte, recueillis quotidiennement, doivent être indiqués sur un tableau comme le montre la figure 3 et utilisés pour calculer la production moyenne d'œufs et de descendants adultes d'une mouche pendant 10 jours. Ensuite, le pourcentage de variation de fécondité/fertilité des mouches traitées par EDC par rapport aux mouches témoins peut être obtenu en appliquant la formule suivante : changement de fécondité/fertilité % - [contrôle - traitement)/contrôle] x 100. Au moins trois répliques indépendantes doivent être obtenues pour chaque groupe.

Les hormones jouent un rôle essentiel dans les transitions développementales dans la vie de D. melanogaster40, pour lequel il est probable que ces phases de croissance soient particulièrement vulnérables aux effets néfastes des SEE. À 25 oC, la croissance larvaire et le stade pupal s'étendent chacun sur environ 4 jours. Après l'exposition à EDC, la durée moyenne de ces étapes peut être affectée41. Sur la base de cette considération, les protocoles de calendrier de développement ont été optimisés pour déterminer le pourcentage et le temps de transition des larves aux jeunes et des chiots aux adultes après l'exposition à EDC en ce qui concerne les mouches non traitées. Deux protocoles alternatifs pourraient effectuer cet exemple. Tous deux étaient valides et fondés sur l'exposition chronique d'EDC aux larves sur une période de 4 jours. Sur la base de ce traitement larvaire, le premier protocole ne tient pas compte de l'âge des embryons, qui ont été recueillis sur une période de 16-18 h (nuit). La variabilité de l'âge qui en résulte parmi les larves devrait cependant être présente dans tous les flacons de chaque traitement, augmentant ainsi la variance à l'intérieur du traitement, mais sans affecter de manière significative les estimations du moment de développement par le biais des traitements. Au lieu de cela, le deuxième protocole a utilisé un nombre fixe d'embryons précoces synchrones, ce qui permet d'évaluer également les effets potentiels de l'EDC sélectionné au cours de l'embryogenèse42,43. De plus, la réduction des différences d'âge entre les larves a réduit la variance à l'intérieur du traitement et a augmenté la capacité d'estimer les différences vraies entre les traitements. La figure 4 fait état d'un schéma d'eclosion. Dans les deux protocoles, les plaques/fioles devaient être vérifiées quotidiennement, et les nombres de la pétuinet et des adultes des personnes exposées et non exposées à la SEE devaient être indiqués séparément sur un tableau comme à la figure 4. Toutes les femelles formées et les mouches adultes devaient être comptées, qu'elles soient mortes ou vivantes. Ensuite, ces données brutes ont été utilisées pour calculer les pourcentages et les périodes de transition des larves aux jeunes et des pupae aux adultes et pour calculer le pourcentage de variation de ces valeurs des mouches traitées par EDC par rapport aux mouches témoins. À la suite de l'exposition à EDC, il fallait s'attendre à une avance ou à un retard de développement global en ce qui concerne les mouches témoins. Le protocole choisi devait être exécuté en triplepour chaque groupe de mouches. Il était recommandé que, pour le protocole d'eclosion 2, chaque série de répliques pour une concentration donnée d'EDC soit ensemencée avec des embryons provenant de la même traînée de ponte afin de maintenir la fiabilité et l'exactitude de la mise en scène des embryons dans l'ensemble des concentrations d'EDC.

Enfin, la figure 5 montre les étapes clés pour mesurer la durée de vie. Pour ce protocole, il était essentiel que toutes les mouches analysées soient synchrones selon l'âge et le sexe, couplées, et maintenues à une densité suffisamment basse pour permettre la libre circulation. Il est important de mener des expériences sur la durée de vie chez les deux sexes séparément parce qu'il est bien connu qu'il existe des différences significatives dans la durée de vie entre les mâles et les femelles44.

Les aliments devaient être changés tous les 3 jours pour maintenir une population en bonne santé, et la mortalité devait également être évaluée tous les 3 jours. Sur une feuille de calcul de durée de vie, comme à la figure 5, le nombre de mouches mortes a été signalé, et ce nombre serait automatiquement soustrait du nombre de mouches survivantes du transfert précédent. Pour chaque concentration d'EDC et pour le solvant seul, la survie cumulative par rapport aux jours écoulés a été tracée pour obtenir des courbes de durée de vie. Une courbe de survie typique est rapportée à la figure6; après une longue période initiale au cours de laquelle la courbe de survie est demeurée relativement élevée, elle a diminué de façon exponentielle après environ 60 jours. Après l'exposition d'EDC, la courbe de survie des mouches traitées pourrait être affectée de façon significative. Afin de déterminer si cet effet est dû à la CED sélectionnée, il était conseillé d'effectuer au moins deux expériences de repli indépendantes et non contemporaines, ou mieux encore.

Dans chacun des protocoles ci-dessus, il était possible d'avoir des flacons anormal (par exemple, sans ovules ni décès anormalement); ces flacons pourraient avoir été créés par différentes causes, telles que la mauvaise qualité des aliments ou l'infection, et pourraient modifier considérablement les valeurs des mesures. La meilleure façon de gérer ces situations anormale était de les éviter par de bonnes pratiques expérimentales. Il faut donc souligner que, pour tous les protocoles ci-dessus, un travail important et minutieux a été nécessaire pour reproduire les flacons, maintenir les mouches en bonne santé et manipuler les mouches qui, une fois exposées à une EDC, pourraient devenir délicates, augmentant ainsi le risque de décès lorsque Manipulé.

Figure 1
Figure 1 : L'alimentation de l'astoe. Les mouches adultes dans des flacons contenant cm/colorant complété par un EDC sélectionné (en haut) ou un solvant seul (en bas) sont laissés à nourrir pendant 24 h. Deux mouches nourries sur le milieu complété par un EDC (en haut) ou solvant seul (en bas) montrent une coloration similaire sur leur abdomen. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : dosage d'EDC. Schéma de l'administration EDC à Drosophila par régime. Les mouches adultes d'un stock isogénique sont exposées à différentes concentrations d'UN EDC (en haut) ou d'un solvant seul (en bas). N - la concentration de référence de la CED. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Test de fertilité. Schéma du protocole, illustrant les étapes de la croissance de la mouche dans les médias appropriés à la collection vierge et jusqu'à des croix simples. Étape 1 : Les adultes (10 flacons avec huit femelles et quatre mâles chacun) d'une souche isogénique sont transférés à des flacons avec CM/EDC (en haut) ou CM/solvant seul (en bas). (Remarquez que le schéma, par souci de simplicité, ne fait référence qu'à l'une des trois fioles.) Étape 2 : Après 4 jours, les adultes sont jetés et les œufs pondus sont laissés à se développer pendant 9 jours jusqu'au stade adulte. Étape 3 : Les adultes nouvellement fermés sont triés selon le sexe et recueillis dans des flacons (max. 20 mâles/flacons et 10 femelles vierges/flacons). Étape 4 : Les adultes sont laissés à l'âge pendant 4 jours sur le milieu correspondant de la croissance larvaire. Étape 5 : Configuration de 40 croisements simples pour les mouches traitées par EDC dans le milieu CM-tomate sans EDC, 20 x 20 fois un mâle traité par EDC avec une femelle témoin et 20 x un mâle témoin avec une femelle traitée par EDC (en haut); configuration de 20 croisements simples pour les mouches témoins, 20 fois un mâle témoin avec une femelle témoin (en bas). Le milieu jaune est un CM complété par un EDC (en haut) ou un solvant comme contrôle (en bas), et le milieu rouge est une tomate/CM sans EDC ou solvant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Calendrier de développement(protocole d'évaluation de l'éclosion2). Sur la gauche, ce chiffre montre un schéma de la cage de collecte dans laquelle les adultes (environ 150 femelles et 50 mâles) sont placés pour s'acclimater et s'accoupler dans l'obscurité avant l'étape de dépôt (voir protocole). Après 2 jours, l'ancien plateau coulissant est remplacé par un avec des aliments frais, et les œufs déposés dans le prochain 1 h sont jetés parce qu'ils sont asynchrones. Par la suite, les œufs sont recueillis toutes les 2 h sur un nouveau plateau coulissant, comptés, et placés sur des plats contenant de la tomate/CM complétées par une EDC ou avec un solvant seul. Les données (œufs pondus totaux, œufs non divulgués, chiots et adultes fermés) sont rapportées sur une série de feuilles de calcul du calendrier de développement (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : L'exemple de durée de vie. Un jour, les mouches synchronisées sont transférées dans une bouteille de 250 ml avec de la nourriture pour adultes (AM) complétée par un EDC (en haut) ou un solvant (en bas) comme contrôle, pour permettre l'alimentation (à gauche dans le schéma). Après 2-3 jours, les mouches sont triées par sexe et transférées à cinq flacons (contenant le milieu correspondant de la bouteille de départ) pour chaque sexe, en groupes de 20 individus/flacons. Tous les 3 jours, les adultes sont transférés vers des flacons frais jusqu'à ce qu'ils ne soient plus nécessaires (partie centrale du régime). Sur la droite est un schéma de la table dans laquelle les données sont enregistrées pour chaque jour. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Courbes de durée de vie. Sur la gauche, une table représentative est signalée dans laquelle le nombre de mouches mortes a été enregistré tous les 3 jours, à la fois pour le groupe de traitement (moyen - EDC [0,05 mM EE2]) et pour le groupe témoin (moyenne et solvant), tout au long de la période expérimentale. La durée de vie moyenne de chaque groupe a été calculée à l'aide du MATRIX SUM. PRODUIT; le groupe traité a raccourci la durée de vie moyenne par rapport au groupe témoin. Sur la droite, une courbe de survie typique est montrée des mouches mâles alimentées avec le milieu contenant EE2 (0.05 mM) ou seulement l'éthanol pour le contrôle. La courbe de survie a diminué plus rapidement pour les mouches traitées que pour le groupe témoin, avec un point de chute plus tôt. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La mouche des fruits D. melanogaster a été largement utilisé comme un système de modèle in vivo pour étudier les effets potentiels des EDC environnementales telles que DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33, et EE234. Plusieurs raisons ont conduit son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Outre ses avantages incontestés en tant que système modèle, Drosophila partage un degré élevé de conservation des gènes avec l'homme, pour lequel les tests d'EDC de Drosophila peuvent aider à prédire ou à suggérer des effets potentiels pour la santé humaine. En outre, la drosophile appartient aux invertébrés, qui sont largement représentés dans tous les écosystèmes et nécessitent des mesures de protection plus importantes contre les effets néfastes des SEE. Les invertébrés sont situés à la base de la chaîne alimentaire et remplissent des fonctions très importantes pour les environnements dans lesquels ils vivent. Il a été signalé que plusieurs DEC rejetées dans l'environnement pourraient avoir une influence néfaste sur le développement et la reproduction de plusieurs espèces animales. Drosophila offre l'avantage supplémentaire d'être utilisé en laboratoire, où les facteurs susceptibles d'affecter le développement, la reproduction et la durée de vie peuvent être gardés sous contrôle afin d'attribuer toute variation à la substance à tester.

Nous fournissons ici des protocoles détaillés pour étudier les effets de l'exposition à edC dans ce système modèle sur les traits de vie hormonaux réglementés tels que la fécondité/fertilité, le taux de développement et la durée de vie. Nous avons optimisé ces protocoles qui ont permis d'étudier les effets de l'exposition eE234,BPA et BPAF (données non publiées), mais ils peuvent être facilement adaptés pour étudier les effets d'autres EDC. En particulier, ces essais peuvent être utilisés pour étudier à la fois les DEC purs et les combinaisons de différents DEC, reproduisant plus étroitement ce qui se produit dans la nature. Bien qu'apparemment, ils peuvent sembler comme des essais de croissance simples, il est important de travailler selon les lignes directrices appropriées, en assurant l'exactitude et la reproductibilité45. Il est bien connu que la fertilité, le moment de développement, et la longévité dans D. melanogaster peuvent être affectés par des facteurs externes et internes. Ces facteurs critiques, y compris la photopériode, la température, l'humidité, la nutrition, la densité de population, la structure génétique et l'âge, doivent être soigneusement contrôlés pour les résultats des protocoles rapportés. Afin de minimiser la composante de la variabilité génétique, une souche isogénique doit être utilisée. Cette souche doit être soigneusement élevée dans un incubateur humidifié à température contrôlée, avec une lumière naturelle de 12 h : 12 h de photopériode foncée à 25 oC.

En plus de l'entretien d'un environnement contrôlé, la surpopulation larvaire et la surpopulation de mouches doit être évitée. Il a été rapporté que le surpeuplement larvaire peut affecter le moment du développement et induire l'expression de plusieurs gènes, y compris le choc thermique ou les gènes liés à l'immunité, qui influencent la condition physique totale des mouches adultes46. En outre, les mouches adultes doivent être maintenues à une densité suffisante pour permettre la libre circulation afin de minimiser le stress chez les adultes. De plus, il est important de s'assurer que les mouches consomment des quantités comparables de la SEE dans chaque groupe de traitement, en tenant compte du goût du composé à des concentrations différentes, parce que les mouches ont tendance à éviter les aliments désagréables. Un autre aspect important de ces protocoles est la qualité des aliments; la nourriture doit également sembler bonne, dépourvue de bulles, fissures de bactéries, et ainsi de suite47,48. En outre, il est nécessaire de garder à l'esprit la synchronisation, le statut d'accouplement et la cohabitation entre les sexes pour que les mouches soient testées. Dans tous les protocoles signalés, il est important que les flacons parallèles en cours d'analyse soient très semblables; autrement, il serait difficile de comprendre lequel jeter de sorte qu'une attention maximale et de bonnes pratiques expérimentales soient nécessaires. Enfin, en utilisant ces protocoles pour évaluer les effets endocriniens de certains EDC, il est important de tenir compte des interactions possibles avec d'autres EDC présents dans le milieu, comme le méthyle 4-hydroxybenzoate ou le BPA des flacons de plastique. En ce sens, il pourrait être utile de changer l'agent antifongique, d'utiliser des flacons de verre ou d'effectuer des essais pilotes avec et sans contaminants possibles.

Les tests de Drosophila signalés peuvent être très efficaces pour l'évaluation de tout produit chimique ou mélange de produits chimiques, tels que les EDC, en évaluant les effets potentiels sur les traits de vie hormonaux réglementés, tels que la reproduction, le développement et la durée de vie. Cependant, ces essais ne peuvent pas servir à identifier clairement le mécanisme endocrinien responsable des effets indésirables d'EDC. Pour surmonter cette limitation, il est possible d'effectuer les mêmes protocoles en utilisant des EDC de référence qui évoquent des réponses représentatives d'un certain mode d'action sur le système endocrinien des insectes (p. ex., les insecticides de troisième génération fonctionnant comme JH ou ecdysteroid agoniste/antagoniste)22. Alternativement, il est également possible d'utiliser des critères d'évaluation moléculaire, en effectuant une analyse moléculaire sur des gènes spécifiques qui sont hormonalement réglementés et qui sont considérés comme prédictifs et des biomarqueurs spécifiques pour la perturbation endocrinienne34.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Orsolina Petillo pour son soutien technique. Les auteurs remercient le Dr Mariarosaria Aletta (CNR) pour son soutien bibliographique. Les auteurs remercient le Dr Gustavo Damiano Mita de les avoir introduits dans le monde d'EDC. Les auteurs remercient Leica Microsystems et Pasquale Romano pour leur aide. Cette recherche a été appuyée par le projet PON03PE-00110-1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projet PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

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Biologie du développement Numéro 149 Drosophila melanogaster perturbateurs endocriniens chimiques fécondité fertilité développement durée de vie
Méthodes pour tester la perturbation endocrinienne dans <em>le mélanogaster drosophila</em>
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Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

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