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Developmental Biology

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Le sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC) rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ambienti naturali. La Drosophila melanogaster rappresenta un modello ideale per studiare gli effetti della CED in vivo. Qui, presentiamo metodi per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità, la fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita della mosca.

Abstract

Negli ultimi anni ci sono state sempre più prove che tutti gli organismi e l'ambiente sono esposti a sostanze chimiche ormonali-come, noto come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). Queste sostanze chimiche possono alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini e portare a effetti negativi, nonché un numero crescente di disturbi ormonali nella popolazione umana o una crescita disturbata e una minore riproduzione nelle specie selvatiche. Per alcuni EDC, ci sono documentati effetti sulla salute e restrizioni sul loro uso. Tuttavia, per la maggior parte di loro, non c'è ancora alcuna prova scientifica in questo senso. Al fine di verificare potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica nel tutto l'organismo, abbiamo bisogno di testarlo in sistemi modello appropriati, così come nel filo della frutta, Drosophila melanogaster. Qui riportiamo protocolli dettagliati in vivo per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità/fertilità, sui tempi di sviluppo e sulla durata della vita della mosca. Negli ultimi anni, abbiamo usato questi tratti della vita della Drosophila per studiare gli effetti dell'esposizione al 17-e-ethinylestradiol (EE2), al bisfenolo A (BPA) e al bisfenolo AF (BPA F). Complessivamente, questi saggi hanno coperto tutte le fasi della vita della Drosophila e hanno permesso di valutare la perturbazione endocrina in tutti i processi mediati dall'ormone. I saggi di fedia/fertilità e tempistica dello sviluppo sono stati utili per misurare l'impatto della CED sulle prestazioni riproduttive delle mosche e sugli stadi dello sviluppo, rispettivamente. Infine, il saggio della durata della vita ha coinvolto esposizioni croniche di EDC agli adulti e ha misurato la loro sopravvivenza. Tuttavia, questi tratti di vita possono anche essere influenzati da diversi fattori sperimentali che dovevano essere attentamente controllati. Quindi, in questo lavoro, suggeriamo una serie di procedure che abbiamo ottimizzato per il giusto risultato di questi saggi. Questi metodi consentono agli scienziati di stabilire interruzioni endocrine per qualsiasi EDC o per una miscela di diversi EDC in Drosophila, anche se per identificare il meccanismo endocrino responsabile dell'effetto, potrebbero essere necessari ulteriori saggi.

Introduction

Le attività umane hanno rilasciato nell'ambiente una massiccia quantità di sostanze chimiche, che rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ecosistemi naturali1. Di questi inquinanti, si stima che circa 1.000 sostanze chimiche diverse possano alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini; in base a questa proprietà, sono classificati come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). In particolare, sulla base di una recente definizione della Società Endocrina, i CED sono "una sostanza chimica esogena, o miscela di sostanze chimiche, che può interferire con qualsiasi aspetto dell'azione ormonale"2. Negli ultimi tre decenni, ci sono state sempre più prove scientifiche che i CED possono influenzare la riproduzione e lo sviluppo di animali e piante3,4,5,6,7, 8. Ulteriormente, l'esposizione alla CED è stata correlata alla crescente prevalenza di alcune malattie umane, tra cui il cancro, l'obesità, il diabete, le malattie della tiroide e i disturbi comportamentali9,10,11.

Meccanismi generali di EdC

A causa delle loro proprietà molecolari, gli EDC si comportano come ormoni o precursori ormonali3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In questo senso, possono legarsi al recettore di un ormone e interrompere i sistemi endocrini sia imitando l'attività ormonale o bloccando l'attacco di ormoni endogeni. Nel primo caso, dopo il legame al recettore, possono attivarlo come farebbe il suo ormone naturale. Nell'altro caso, il legame della CED al recettore impedisce il legame del suo ormone naturale, quindi il recettore è bloccato e non può più essere attivato, anche in presenza del suo ormone naturale3. Di conseguenza, gli EDC possono influenzare diversi processi, come la sintesi, la secrezione, il trasporto, il metabolismo o l'azione periferica di ormoni endogeni che sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi, della riproduzione, dello sviluppo e/o del comportamento l'organismo. L'associazione del recettore non è l'unico modo di agire descritto finora per gli EDC. Ora è chiaro che possono anche agire reclutando coattivatori o corepressor in percorsi enzimatici o modificando marcatori epigenetici che deregolamentano l'espressione genica10,11,12,13 ,14, con conseguenze non solo per la generazione attuale ma anche per la salute delle generazioni a venire8.

Ormoni della drosofilia

I potenziali effetti di EDC selezionati sono stati studiati ampiamente, sia nelle specie selvatiche che in diversi sistemi modello in cui i meccanismi endocrini sono ragionevolmente ben noti. Per gli invertebrati, i sistemi endocrini che influenzano la crescita, lo sviluppo e la riproduzione sono stati ampiamente caratterizzati negli insetti per diversi motivi, coinvolgendo il loro ampio uso nel campo della ricerca biologica, la loro importanza economica e infine lo sviluppo di insetticidi in grado di interferire specificamente con il sistema ormonale degli insetti parassiti.

In particolare, tra gli insetti, il viafrutto della frutta D. melanogaster si è dimostrato un sistema modello molto potente per valutare i potenziali effetti endocrini degli EDC. In D. melanogaster, così come nei vertebrati, gli ormoni svolgono un ruolo importante durante l'intero ciclo di vita. In questo organismo, ci sono tre principali sistemi ormonali, che coinvolgono l'ormone steroide 20-idrossiecdysone (20E)15,16, l'ormone giovanile sesprorpenoide (JH)17, e i neuropeptidi e peptidi/ proteine ormoni18. Questo terzo gruppo è costituito da diversi peptidi scoperti più di recente ma chiaramente coinvolti in una grande varietà di processi fisiologici e comportamentali, come longevità, omeostasi, metabolismo, riproduzione, memoria e controllo locomotore. 20E è omologa agli ormoni steroidei derivati dal colesterolo come estradiolo, mentre JH condivide alcune somiglianze con acido retinoico; entrambi sono gli ormoni più noti in Drosophila19,20. Il loro equilibrio è fondamentale nel coordinare la fiscie e la metamorfosi, nonché nel controllo di diversi processi post-sviluppo, come la riproduzione, la durata della vita e il comportamento21,offrendo così diverse possibilità di testare l'endocrino perturbazione nella Drosophila. Inoltre, gli ormoni ecriosteroidi e JH sono i principali bersagli dei cosiddetti insetticidi di terza generazione, sviluppati per interferire con i processi mediati endocrini dello sviluppo e riproduttivi negli insetti. La modalità d'azione agonista o antagonista di queste sostanze chimiche è ben nota, e quindi possono servire come standard di riferimento per valutare gli effetti dei potenziali EDC sulla crescita, la riproduzione e lo sviluppo degli insetti22. Ad esempio, il methoprene, che è stato ampiamente utilizzato nel controllo di zanzare e altri insetti acquatici23,24, funziona come un agonista JH e reprime la trascrizione genica e la metamorfosi indotta da 20E.

Oltre agli ormoni, la superfamiglia del recettore nucleare (NR) nella Drosophila è anche ben nota; è costituito da 18 fattori di trascrizione evolutivamente conservati coinvolti nel controllo dei percorsi evolutivi dipendenti dall'ormone, così come la riproduzione e la fisiologia25. Questi NR ormone appartengono a tutti i sei sottotipi di superfamiglia NR, compresi quelli coinvolti nella neurotrasmissione26, due per gli acido retinoico NRs, e quelli per gli steroidi NRs che, nei vertebrati, rappresentano uno degli obiettivi primari di EDC27.

La Drosophila come sistema modello per studiare gli EDC

Attualmente, sulla base di proprietà molecolari, diverse agenzie ambientali in tutto il mondo stanno attribuendo il potenziale di interferire con i sistemi endocrini a diverse sostanze chimiche artificiali. Dato che i CED sono un problema globale e onnipresente per l'ambiente e per gli organismi, l'obiettivo generale della ricerca in questo campo è ridurre il loro onere della malattia, nonché proteggere gli organismi viventi dai loro effetti negativi. Al fine di approfondire la comprensione circa i potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica, è necessario testarlo in vivo. A tal fine, D. melanogaster rappresenta un sistema di modelli valido. Ad oggi, la mosca della frutta è stata ampiamente utilizzata come modello in vivo per valutare gli effetti di diversi EDC ambientali; è stato riferito che l'esposizione a diversi EDC, come lo ftalato diaill (DBP)28, il bisfenolo A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, metilparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31 32, bis-(2-ethylhexyl) ftalato (DEHP)33, e 17-ethinylestradiol (EE2)34, influenza il metabolismo e le funzioni endocrine come nei modelli vertebrati. Diverse ragioni hanno portato al suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. Al di là di un'ottima conoscenza dei suoi sistemi endocrini, ulteriori vantaggi includono il suo breve ciclo di vita, il basso costo, il genoma facilmente manipolabile, una lunga storia di ricerca e diverse possibilità tecniche (vedi il sito web FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fornisce anche un potente modello per studiare facilmente gli effetti transgenerazionali e le risposte della popolazione ai fattori ambientali8 ed evita le questioni etiche rilevanti per gli studi in vivo su animali superiori. Inoltre, la mosca della frutta condivide un alto grado di conservazione genica con gli esseri umani che potrebbe consentire ai saggi della Dnosophila EDC di aiutare a prevedere o suggerire potenziali effetti di queste sostanze chimiche per la salute umana. Oltre ad ampliare la comprensione degli effetti sulla salute umana, la Drosophila può contribuire a valutare i rischi di esposizione della CED all'ambiente, come la perdita di biodiversità e il degrado ambientale. Infine, la mosca della frutta offre il vantaggio aggiuntivo di essere utilizzata nei laboratori, dove i fattori che potenzialmente influenzano il suo sviluppo, la riproduzione e la durata della vita possono essere tenuti sotto controllo al fine di attribuire qualsiasi variazione alla sostanza da testare.

Con questo in mente, abbiamo ottimizzato semplici e robusti saggi di fitness per determinare gli effetti EDC su alcuni tratti ormonali della Drosophila, come la fecondità/fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita adulta. Questi saggi sono stati ampiamente utilizzati per alcuni EDC23,24,25,26,27. In particolare, abbiamo utilizzato i seguenti protocolli per valutare gli effetti dell'esposizione all'estrogeno sintetico EE234 e al BPA e al bisfenolo AF (BPA F) (dati inediti). Questi protocolli possono essere facilmente modificati per studiare gli effetti di un dato EDC alla volta, così come gli effetti combinati di più EDC in D. melanogaster.

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Protocol

1. Preparazione degli alimenti

  1. Per la manutenzione delle scorte e per la crescita larvale, utilizzare un mezzo di farina di mais contenente lievito in polvere del 3%, il 10 % di saccarosio, il 9 % di farina di mais precotta, lo 0,4% di agar, successivamente chiamato Cornmeal medium (CM).
    1. Mettere 30 g di lievito in 100 mL di acqua di rubinetto, portarla a ebollizione e far bollire per 15 min.
    2. Separatamente, mescolare bene 90 g di farina di mais precotta, 100 g di zucchero e 4 g di agar in 900 mL di acqua di rubinetto.
    3. Portare la soluzione a ebollizione, abbassare il fuoco e cuocere per 5 minuti mescolando continuamente.
    4. Dopo 5 minuti, aggiungere la soluzione di lievito caldo e cuocere a fuoco lento per altri 15 min.
    5. Spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare la soluzione a circa 60 gradi centigradi.
    6. Aggiungere 5 mL/L di 10% metil4-idrossibenzolato in etanolo, mescolare accuratamente e lasciare sofforarsi per 10 min.
      NOT: Fare attenzione con la quantità di metile 4-idrossibenzoato, dato che un'alta concentrazione di fungicidi potrebbe essere letale per le larve.
    7. Distribuisci il mezzo in fiale/bottiglie: 8 mL in ogni flacone (25 mm x 95 mm), 3 mL in ogni fiala volante (22 mm x 63 mm) e 60 mL in ogni bottiglia di mosca (250 mL).
    8. Coprire le fiale con la garza e lasciarle asciugare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore prima dello stoccaggio.
    9. Calibrare sperimentalmente la giusta consistenza e idratazione del CM modificando la quantità di agar utilizzata e/o i tempi di raffreddamento/essiccazione.
      Nota: le fiale scollegate, confezionate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 gradi centigradi.
  2. Per gli adulti di Drosophila, utilizzare un mezzo contenente 10% lievito in polvere, 10% di saccarosio, 2% agar, successivamente chiamato mezzo adulto (AM).
    1. Mescolare 10 g di lievito in polvere, 10 g di saccarosio, 2 g di agar in 100 mL di acqua distillata.
    2. Portare questa miscela a ebollizione due volte, con un intervallo di 3 minuti, o fino a quando agar è sciolto, utilizzando un forno a microonde.
    3. Una volta che la soluzione si raffredda a 60 gradi centigradi, aggiungere 5 mL/L di 10% Methyl 4-idrossibenzoate in etanolo, mescolare accuratamente e erogare in fiale (10 mL per fiala).
    4. Coprire le fiale con la garza e lasciarle asciugare a RT per 24 ore prima di conservarle.
      NOTA: le fiale scollegate, confezionate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 gradi centigradi.
  3. Per il test di fecondità/fertilità, utilizzare il mezzo di farina di succo di pomodoro Drosophila.
    1. Versare 70 mL di cibo caldo di farina di mais in un becher da 100 ml e aggiungere 30 mL di succo di pomodoro (30% v/v).
    2. Mescolare accuratamente con un robot da cucina e pipet 3 mL in piccole fiale.
    3. Coprire le fiale con la garza e lasciarle asciugare a RT per 24 ore prima dello stoccaggio.
      NOTA: le fiale scollegate, confezionate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 gradi centigradi.
  4. Per la raccolta degli embrioni, utilizzare piastre di agar, contenenti 3% agar, 30% di salsa di pomodoro e 3% di zucchero.
    NOTA: fare attenzione a non fare bolle quando si versa il mezzo nelle piastre.

2. Dosare dedco EDC

  1. Preparare una soluzione di stock appropriata sciogliendo l'EDC selezionato nel solvente adatto. Per l'EE2 (peso molecolare 296.403), sciogliere 1,48 g in 10 mL di 100% etanolo per fare una soluzione di magazzino di 0,5 M e conservare a -80 gradi centigradi.
    ATTENZIONE: Gli EDC sono considerati inquinanti ambientali e devono essere prese precauzioni nella loro gestione.
  2. Diluire la soluzione di stock EE2 in 10% etanolo in acqua (v/v) per ottenere una soluzione di 100 mM. Effettuare le prossime diluizioni (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) negli alimenti CM, iniziando con la concentrazione più bassa e utilizzando la stessa concentrazione finale di solvente per ciascun gruppo di trattamento. Per le fiale di controllo utilizzare lo stesso volume del solvente da solo.
    Nota: si raccomanda di mantenere la concentrazione finale del solvente il più basso possibile, tenendo presente che la concentrazione finale di etanolo non deve superare il 2% nel cibo a mosca.
  3. Aggiungere la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato al cibo a base di farina di mais prima della solidificazione, mescolare accuratamente con un robot da cucina, erogare 10 mL in fiale, coprire con garza di cotone e lasciare asciugare a RT per 16 h prima dell'uso.
    NOTA: utilizzare questo supporto immediatamente dopo la sua preparazione.
  4. Per l'allevamento degli adulti, preparare diverse soluzioni EE2 funzionanti (rispettivamente 10 mM, 50 mM e 100 mM) nel 10% di etanolo in acqua (v/v) e nello strato 100 - L di ciascuna sulla superficie dell'AM, al fine di ottenere la concentrazione desiderata dell'EE2 (0,1 mM) 0,5 mM e 1 mM). Per il controllo utilizzare solo lo stesso volume del solvente.
    NOTA: in alternativa, aggiungere la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato a una piccola quantità di AM in un tubo conico da 50 mL, vortice accuratamente e stratifi1l1 mL di esso sulla superficie delle fiale AM.
    1. Coprire le fiale con una garza di cotone, lasciare asciugare a RT per 12-16 h in leggera agitazione e utilizzarle immediatamente.
      NOTA: il processo di essiccazione deve essere regolato sperimentalmente perché dipende dall'umidità ambiente.
  5. Per nutrire il test, aggiungere sia la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato (EE2 0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) sia un alimento da colorare (ad esempio, il colorante rosso n. 40 a 1 mg/mL)35 al CM prima della solidificazione, mescolare fortemente con un robot da cucina e quindi erogare e nelle fiale.

3. Volare

  1. Utilizzare un robusto ceppo isogenico, come Oregon R, mantenuto da più generazioni in laboratorio.
  2. Tenere le mosche in un'incubatrice umidificata e a temperatura controllata, con una luce naturale di 12 h: fotoperiodo scuro di 12 h a 25 gradi centigradi in fiale contenenti cibo CM.
  3. In ogni saggio, utilizzare fiale a RT.

4. Nutrire Assay

NOT: Questo test è consigliato per verificare se la presenza dell'EDC selezionato nel mezzo potrebbe influenzare l'alimentazione delle mosche.

  1. Mettere 15 mosche giovani in fiale contenenti CM integrato con diverse concentrazioni della CED selezionata e un alimento da colorare. Lasciare che le mosche si nutrono dei supporti per 1 giorno.
    NOTA:ad esempio, utilizzare il tintura rossa n. 4035 (1 mg/mL).
  2. Mettere 15 giovani mosche in fiale contenenti CM integrato con il solvente da solo e un alimento da colorare per il controllo. Lasciare che le mosche si nutrono dei supporti per 1 giorno.
  3. Anestesizza individualmente ogni gruppo di mosche con etere.
    1. Trasferire le mosche di ogni gruppo in un contenitore di vetro cilindrico (etherizer) con un imbuto inserito nell'estremità aperta, invertendo la fiala sopra l'imbuto e toccando delicatamente i due contenitori insieme per far cadere le mosche nell'eteratore.
      NOT:  L'imbuto impedirà loro di uscire dall'eterizza.
    2. Knock vola verso il basso toccando delicatamente l'eteratore su una superficie morbida, come un mouse-pad, e rapidamente sostituire l'imbuto con un cotone imbevuto di etere e tappo di garza.
    3. Attendere circa 1 min fino a quando le mosche cadono verso il basso e smettere di muoversi.
      NOTA: non superare il tempo o le mosche moriranno.
  4. Mettere mosche immobilizzate sotto uno stereo-microscopio e confrontare la colorazione addominale di ogni gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo.

5. Saggio di fecondità/fertilità

  1. Per ogni concentrazione di EDC, preparare 3 fiale di mosche, successivamente chiamate fiale parentali, con 8 femmine e 4 maschi in cibo CM/EDC da 10 mL; per il controllo preparare 6 fiale di mosche con 8 femmine e 4 maschi in 10 mL cibo integrato con solvente. La parte posteriore vola in un'incubatrice a 25 gradi centigradi.
    NOTA: evitare larve di sovraffollamento durante il loro sviluppo e cercare di utilizzare densità larve coerenti tra i trattamenti.
  2. Dopo 4 giorni, rimuovere i genitori e restituire le fiale nell'incubatrice per altri 5 giorni.
  3. Nel tardo pomeriggio del giorno 9, togliere tutte le nuove mosche dalle fiale e mettere le fiale in un'incubatrice a 18 gradi durante la notte.
    NOT: Questa rimozione deve essere fatta con molta attenzione, controllando la superficie del pozzo medio.
    1. La mattina del giorno 10, per ogni gruppo di trattamento, raccogliere le femmine vergini e giovani maschi in due gruppi, sotto l'anestesizzazione leggeradi CO 2. Suddivisione casuale di ogni gruppo di mosche in piccoli sottogruppi (10 femmine e 20 maschi per fiala) in fiale indipendenti piene di CM fresco corrispondente.
      1. Ripetere il passaggio 5.3.1 avendo cura sia per rimuovere con attenzione tutte le mosche dalle fiale 8-10 h prima della raccolta e lasciare le fiale a 18 gradi centigradi, fino ad ottenere almeno 30 femmine vergini e 30 maschi per ogni concentrazione di EDC e almeno 90 femmine vergini e 90 maschi per il controllo.
    2. Ospitano questi gruppi di mosche a 25 gradi centigradi fino a quando non sono invecchiati 4 giorni dopo l'eclosione, trasferendoli in nuove fiale contenenti mezzo fresco corrispondente ogni due giorni.
      Nota: 4 giorni è tempo sufficiente per le mosche a diventare adulti maturi, ma è molto lontano dall'inizio della senescenza.
    3. Dopo due giorni assicurarsi che non ci siano larve nelle fiale delle femmine. Se lo fanno, le mosche non sono utilizzabili perché non sono vergini e devono essere scartate.
  4. Utilizzare 20 mosche singole di ogni sesso per ogni gruppo di trattamento per impostare 20 singole croci in piccole fiale contenenti un mezzo CM-pomodoro fresco senza EDC, come descritto di seguito.
    1. Ad ogni gruppo di trattamento assegnare una serie diversa di numeri sequenziali, che lo identifica in modo univoco ed etichettano le rispettive fiale; ad esempio, group1 (solo solvente) da 1 a 20, gruppo 2 (concentrazione EDC x) da 20 a 40 e così via.
    2. Fare un foglio di calcolo della fertilità per registrare le diverse serie, ognuna corrispondente a un gruppo di trattamento.
    3. Per ogni sesso anestesizzare tutte le mosche appartenenti a ciascun gruppo di trattamento sotto luce CO2 e trasferirle casualmente come segue.
      1. Trasferire una femmina trattata con solvente in una piccola fiala contenente un mezzo CM-tomato fresco senza EDC e aggiungere un maschio trattato con solvente per la croce di controllo.
        Nota: il succo di pomodoro deve essere aggiunto al mezzo durante la sua preparazione perché il mezzo scuro aumenta il contrasto con gli embrioni bianchi.
      2. Trasferire una femmina trattata con EDC in una piccola fiala contenente CM-pomodoro fresco senza EDC e aggiungere un maschio trattato con solvente per ogni trattamento.
      3. Trasferire un maschio trattato con EDC in una piccola fiala contenente un mezzo CM-tomato fresco senza EDC e aggiungere una femmina trattata con solvente per ogni trattamento.
    4. Casa tutte queste croci singole a 25 gradi centigradi.
  5. Trasferire ogni coppia di accoppiamento in fresche fiale CM-pomodoro senza EDC ogni giorno per i successivi dieci giorni. Etichettare le fiale replicate di ogni serie in sequenza; ad esempio 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c e riferire questi numeri sul foglio di calcolo della fertilità.
  6. Ispezionare visivamente ogni fiala ogni giorno per le uova e segnalare il loro numero sul foglio di calcolo della fertilità.
  7. Salva ogni fiala e, quando le mosche appena iniziano ad emergere, registra anche il numero giornaliero di progenie adulte nel periodo di 10 giorni. Dopo 10 giorni dall'accoppiamento iniziale, rimuovere i genitori.
    NOTA: scartare la fiala in cui uno o entrambi i genitori sono morti; in caso di fuga di uno o entrambi i genitori, includere nell'analisi tutti i dati fino al giorno in cui sono stati persi.
  8. Sommare il numero giornaliero di uova e il numero giornaliero di progenie adulte da ciascun gruppo di trattamento, per ottenere la fecondità/fertilità totale, la produzione media di uova e progenie adulte con una mosca per dieci giorni e il rapporto tra progenie totale e numero totale di uova deposte. Calcolare le differenze in percentuale di ogni valore di trattamento rispetto al controllo.
  9. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di mosche, utilizzando un minimo di 10 mosche per ogni gruppo di trattamento.
  10. Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi.

6. Tempi di sviluppo

NOT: Nei due protocolli alternativi seguenti la tempistica dello sviluppo viene valutata contando sia il numero di pupe che si formano al giorno sia il numero di eclosing di progenie adulte al giorno.

  1. Eclosione analisi protocollo 1
    1. Per ogni gruppo di trattamento, allestire 10 fiale di mosche giovani (<2 giorni), mosche sane, ognuna con 6 femmine e 3 maschi in cibo da 10 mL senza CED.
    2. Lasciate che vola sul cibo per 24 h, e lasciarli accoppiare.
    3. Preparare 10 fiale parallele per gruppo di trattamento con 10 mL ciascuno di alimenti freschi di farina di mais integrati con diverse concentrazioni di EDC o il solvente da solo per il controllo. Trasferire mosche accoppiate a queste nuove fiale.
      NOTA: per ogni gruppo di trattamento assegnare una serie diversa di numeri sequenziali, che lo identifica in modo univoco ed etichettare le rispettive fiale.
    4. Crea un foglio di calcolo per lo sviluppo per registrare le diverse serie.
    5. Lasciare che le mosche depongano le uova per 16 h. Quindi rimuovere i genitori dalle fiale.
      NOT: Le mosche dei genitori possono essere utilizzate per ripetere il passaggio 6.1.5, trasferendole ad altre fiale corrispondenti.
    6. Incubare fiale per 3-4 giorni a 25 gradi centigradi, o fino a quando non si forma più pupae. Ogni giorno conta il numero di nuove pupe in ogni fiala e segnalale sul foglio di calcolo dello sviluppo. Per evitare di contare due volte la stessa pupa, scrivere un numero in sequenza ad ogni pupa con un marcatore permanente all'esterno della fiala.
    7. A partire dal giorno 9, conta ogni giorno il numero di adulti emergenti fino a quando non sono emersi più adulti e segnalalo sul foglio di calcolo dello sviluppo.
    8. Da questi dati grezzi, calcolare il periodo larvale medio, il periodo pupa medio, così come le differenze di percentuale di ogni trattamento rispetto al controllo.
    9. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di mosche, utilizzando un minimo di 5 fiale per ogni gruppo di trattamento.
    10. Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi.
  2. Eclosion saggio saggio protocollo 2
    1. La donna femmina giovane e sana (circa 150) e il maschio (circa 50) vola su una gabbia di raccolta (Tabella dei materiali) con mezzo agar-tomato integrato con pasta di lievito fresco (3 g di lievito di panettiere in 5 mL di acqua), successivamente chiamato vassoio di posa, per 2 giorni a 25 gradi centigradi.
    2. Durante questi 2 giorni, lasciare che le mosche si acclimati alla gabbia in un luogo buio e tranquillo, prima di iniziare la raccolta delle uova, e cambiare il vassoio di deposizione due volte al giorno.
    3. Il terzo giorno, cambiare il vassoio di posa la mattina presto. Dopo 1 h, sostituire il vassoio di posa, scartando queste uova deposte.
    4. Lasciare le mosche a deporre le uova per 2 h e sostituire con vassoio di posa fresco.
      NOT: Entro il giorno 3, un buon vassoio di posa dovrebbe produrre 100-200 uova in 2 h.
    5. Per ogni gruppo di trattamento, preparare una serie di tre piatti da 60 mm contenenti cibo di farina di mais di pomodoro integrato con la corrispondente concentrazione di EDC o con solvente da solo e segnalare ogni serie nella tempistica del foglio di calcolo dello sviluppo. In alternativa, se lo si preferisce, utilizzare fiale invece di piatti.
    6. Raccogliere delicatamente le uova al microscopio utilizzando un pennello o una sonda e trasferirle nella parte superiore del mezzo in ogni piatto / fiala. Al fine di facilitare il conteggio, sul vassoio di posa, disporre le uova in 5 gruppi di 10 ciascuno e trasferirle una alla volta.
      NOT: Ripetere il passaggio 6.2.4 tutte le volte che è necessario per ottenere un numero sufficiente di embrioni.
    7. Casa tutti questi piatti / fiale a 25 gradi centigradi. Conservare anche ogni vassoio di posa a 25 gradi centigradi e contare il numero totale di uova deposte.
    8. Dopo 24-30 h, controllare ogni piatto / fiala sotto uno stereomicroscopio e contare sia il numero di ovuli bianchi non fecondati che il numero di embrioni morti scuri.
    9. Sottrarre il numero di ovuli bianchi non fecondati dal valore di 50 ovuli trasferiti per ottenere il valore "embrioni totali" per piatto/fiala. Il numero di embrioni morti scuri può essere utilizzato per determinare potenziali effetti tossici della CED durante l'embriogenesi.
    10. Ripetere i passaggi 6.1.6-6.1.10 del protocollo Eclosion assay 1.

7. Protocollo Lifespan

  1. Impostare 20 fiale di mosche con 8 femmine e 4 maschi e casa a 25 gradi c in CM (10 mL ciascuno).
  2. Dopo 4 giorni scartare mosche e mettere fiale di nuovo in incubatrice.
    NOTA: queste mosche possono essere utilizzate per ricominciare per ottenere altre coorti sincronizzate in base all'età delle mosche.
  3. Nel tardo pomeriggio della giornata 9, rimuovere tutte le nuove mosche dalle fiale e tornare fiale all'incubatrice.
    Nota: alcuni adulti dovrebbero iniziare a chiudere già il nono giorno; scartare queste mosche permette di raccogliere un numero massimo di mosche sincronizzate, evitando l'incurante selezione dei primi emergenti.
  4. 16-24 h più tardi, trasferire le mosche adulte (1 giorno di età) di entrambi i sessi in quattro gruppi di bottiglie da 250 mL contenenti alimenti AM integrati con tre diverse concentrazioni di CED e uno con il solo solvente. Se necessario, raccogliere un altro batch il giorno successivo.
  5. Mantenere le mosche a 25 gradi centigradi per 2-3 giorni per permettere loro di accoppiarsi.
    NOTA: il giorno del trasferimento alle fiale alimentari AM corrisponde al primo giorno di età adulta.
  6. Dopo due-tre giorni, ordinare ogni coorte di mosche per sesso in due gruppi sotto anestesizzazione leggeradi CO 2. Suddivisione casuale di ogni sesso in cinque fiale per trattamento ad una densità di 20 individui per fiala, fino a quando non ci sono tre repliche di 5 fiale parallele per ogni genere per ogni trattamento.
    NOT: Lavorare con piccoli gruppi di mosche al fine di prevenire possibili problemi di salute di lunga durata a causa di lungo tempo di esposizione a CO2.
  7. Preparare un foglio di calcolo della durata della vita in cui il numero di mosche morte viene sottratto dal numero di mosche sopravvissute al trasferimento precedente, in modo da ottenere automaticamente il numero di sopravvissuti ad ogni trasferimento.
  8. Trasferimento vola in nuove fiale contenenti il cibo corrispondente ogni 3 giorni allo stesso tempo e controllare la morte.
    NOTA: il trasferimento deve avvenire senza anestesia che potrebbe avere un effetto negativo a lungo termine sulla longevità del volo.
    1. Ad ogni trasferimento, registra l'età delle mosche e il numero di mosche morte.
      NOTA: il numero di mosche sopravvissute viene calcolato automaticamente nel foglio di calcolo, ma si consiglia di controllarlo visivamente. Le mosche che accidentalmente fuggono o muoiono durante il trasferimento non devono essere considerate. Fare attenzione a non contare due volte le mosche morte trasportate alla nuova fiala che riporta questa nota nel foglio di calcolo.
    2. Ripetere i passaggi 7.8 e 7.8.1 fino a morire tutte le mosche.
  9. Per ogni gruppo di trattamento, creare una curva di sopravvivenza come illustrato nella Figura 6, al fine di visualizzare la probabilità di sopravvivenza di una mosca in un determinato momento.
  10. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di trattamento delle mosche, utilizzando 100 mosche appena echiuse per ogni esperimento.
  11. Preparare una tabella in cui segnalare la durata media della vita (giorni di sopravvivenza medi di tutte le mosche per ogni gruppo), la mezza età (periodo di tempo in giorni necessari per raggiungere il 50% di mortalità) e la durata massima della vita (quantità massima di giorni necessari per raggiungere il 90% di mortalità).
  12. Calcolare le differenze di percentuale tra ogni gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo.
  13. Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi di trattamento.

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Representative Results

In questa sezione, i passaggi chiave dei protocolli di cui sopra sono riportati sotto forma di schemi semplificati. Dato che le mosche tendono ad evitare composti sgradevoli, la prima cosa da fare è quello di testare il gusto della CED selezionata. Questo può essere fatto mescolando una colorazione alimentare (ad esempio, colorante alimentare rosso n. 40)35 con il cibo integrato con l'EDC selezionato a varie dosi o con il solvente da solo. Le mosche alimentate su questi mezzi di comunicazione sono esaminate sotto uno stereoscopio e l'assunzione di cibo è stimata dalla loro colorazione addominale (Figura 1). Una tipica situazione desiderata è illustrata nella Figura 1 con due femmine adulte: una alimentata su un mezzo contenente la CED selezionata e una su media che non contiene la CED, che presentano entrambe la stessa colorazione nell'addome.

È stato ampiamente accettato che gli EDC, come gli ormoni naturali, hanno effetti a dosi estremamente basse e che non esiste una relazione semplice e lineare tra dose ed effetto29, con dosi più elevate non necessariamente con un effetto più grande36, 37. Quindi, piuttosto che un approccio dose-risposta, al fine di valutare appieno il loro impatto, si consiglia di utilizzare più dosi, a partire da concentrazioni rilevanti per l'ambiente o per altri organismi. In ogni caso, è importante esaminare il gusto della CED ad ogni concentrazione utilizzata per assicurarsi che le mosche digeriscano quantità comparabili di CED in ciascun gruppo di trattamento (Figura 2).

La perturbazione endocrina colpisce molti tratti importanti della fisiologia animale come la fertilità, la longevità e lo sviluppo che, pertanto, sono endpoint utili per testare gli EDC. Per i protocolli di cui sopra, che abbiamo ottimizzato per misurare gli effetti EDC su questi tratti di vita della Drosophila, considerazioni primarie sono che è imperativo usare mosche giovani e sane che dovrebbero essere manipolate correttamente prima del test. Con questo in mente, grande attenzione deve essere prestata alla produzione, alla movimentazione e allo stoccaggio degli alimenti usati. Inoltre, occorre prestare attenzione all'utilizzo del miglior solvente per la CED selezionata a concentrazioni finali appropriate (cioè meno dell'1% per il soltossido di dimetile [DMSO] e inferiore al 2% per l'etanolo)30.

La fedizietà e la fertilità sono state utilizzate per valutare il successo riproduttivo in D. melanogaster. Figura 3 Mostra uno schema del protocollo utilizzato. La fecondità è misurata sperimentalmente come il numero totale di uova deposte, mentre la fertilità viene misurata come prole adulta totale. Sulla base della considerazione che la produzione di uova nei primi 10 giorni di vita adulta è un buon riferimento per l'intera produzione di uova/progenie di vita adulta di un organismo38,39, test di fertilità e fecondità possono essere effettuati per 10 giorni da usando 4 mosche di un giorno che si sono schiuse dalle larve esposte. È importante cercare di ottenere valori simili nelle fiale parallele di ogni gruppo; in caso contrario, sarebbe difficile immaginare quale tubo rimuovere dall'analisi. Quindi, si consiglia di esaminare quotidianamente ogni fiala replicata per evitare un ambiente stressante, come il cibo essiccato o liquefatto; a partire da 20 croci singole, si consiglia di ottenere almeno 10 fiale in buone condizioni in cui entrambi i genitori erano vivi per 10 giorni. Il numero di uova e progenie adulte, raccolte giornalmente, deve essere riportato su una tabella come mostrato nella Figura 3 e utilizzato per calcolare la produzione di progenie di uova medie e adulti di una mosca per 10 giorni. Quindi, si può ottenere la percentuale di fecondità/fertilità delle mosche trattate con EDC rispetto alle mosche di controllo, applicando la seguente formula: fecondità/cambiamento di fertilità % : [(controllo - trattamento) / controllo] x 100. È necessario ottenere almeno tre repliche indipendenti per ciascun gruppo.

Gli ormoni svolgono un ruolo essenziale nelle transizioni di sviluppo nella vita di D. melanogaster40, per i quali è probabile che queste fasi di crescita siano particolarmente vulnerabili agli effetti negativi dei CED. A 25 gradi centigradi, sia la crescita larvale che lo stadio pupale si estendono ciascuno di circa 4 giorni. Dopo l'esposizione al CED, la durata media di queste fasi può essere influenzata41. Sulla base di questa considerazione, i protocolli di temporizzazione dello sviluppo sono stati ottimizzati per determinare la percentuale e il tempo di transizione dalle larve alle pupe e dalle pupe agli adulti che seguono l'esposizione alla CED rispetto alle mosche non trattate. Due protocolli alternativi potrebbero eseguire questo saggio. Entrambi erano validi e basati sull'esposizione cronica della CED alle larve per un periodo di 4 giorni. Sulla base di questo trattamento larvale, il primo protocollo non ha preso in considerazione l'età degli embrioni, che sono stati raccolti in un periodo di 16-18 h (durante la notte). La conseguente variabilità dell'età tra le larve dovrebbe, tuttavia, essere presente in tutte le fiale di ogni trattamento, aumentando così la varianza all'interno del trattamento, ma senza influenzare in modo significativo le stime dei tempi di sviluppo attraverso i trattamenti. Invece, il secondo protocollo ha utilizzato un numero fisso di embrioni precoci sincroni, consentendo di valutare anche i potenziali effetti dell'EDC selezionato durante l'embriogenesi42,43. Inoltre, ridurre al minimo le differenze di età tra le larve ha ridotto la varianza all'interno del trattamento e aumentato la capacità di stimare le differenze reali tra i trattamenti. Figura 4 riporta uno schema del saggio di eclosione. In entrambi i protocolli, le piastre/fiale dovevano essere controllate giornalmente, e il numero delle pupe e degli adulti provenienti da quelli esposti e non esposti alla CED dovevano essere riportati separatamente su una tabella come nella Figura 4. Tutte le pupe e le mosche adulte formate dovevano essere contate, sia vive che vive. Quindi, questi dati grezzi sono stati utilizzati per calcolare percentuali e tempi di transizione dalle larve alle pupe e dalle pupe agli adulti e per calcolare la percentuale di variazione di questi valori delle mosche trattate con EDC rispetto alle mosche di controllo. In seguito all'esposizione alla CED, era prevedibile un avanzamento o un ritardo generale dello sviluppo rispetto alle mosche di controllo. Il protocollo scelto doveva essere eseguito in triplice copia per ogni gruppo di mosche. È stato consigliabile che, per il protocollo 2 di analisi dell'eclosione, ogni serie di una replica per una determinata concentrazione di EDC venisse seminata con embrioni provenienti dalla stessa pista di posa al fine di mantenere l'affidabilità e l'accuratezza nella messa in scena degli embrioni in tutte le concentrazioni di EDC.

Infine, Figura 5 mostra i passaggi chiave per misurare la durata. Per questo protocollo, era essenziale che tutte le mosche in fase di analisi fossero sincrone per età e sesso, accoppiate e mantenute ad una densità abbastanza bassa da consentire la libera circolazione. È importante effettuare esperimenti di durata della vita in entrambi i sessi separatamente perché è ben noto che ci sono differenze significative nella durata della vita tra maschi e femmine44.

Il cibo doveva essere cambiato ogni 3 giorni per mantenere una popolazione sana, e la mortalità doveva essere valutata anche ogni 3 giorni. In un foglio di calcolo della durata della vita, come illustrato nella Figura5, il numero di mosche morte è stato segnalato e tale numero verrebbe automaticamente sottratto dal numero di mosche sopravvissute dal trasferimento precedente. Per ogni concentrazione di EDC e per il solo solvente, la sopravvivenza cumulativa rispetto ai giorni trascorsi è stata tracciata per ottenere curve di durata della vita. Una tipica curva di sopravvivenza è riportata nella figura 6; dopo un lungo periodo iniziale in cui la curva di sopravvivenza è rimasta relativamente alta, è diminuita esponenzialmente dopo circa 60 giorni. In seguito all'esposizione alla CED, la curva di sopravvivenza delle mosche trattate potrebbe essere influenzata in modo significativo. Al fine di determinare se questo effetto è dovuto all'EDC selezionato, è stato consigliabile effettuare almeno due, o meglio ancora, tre indipendenti, non contemporanei esperimenti di replica.

In ciascuno dei protocolli di cui sopra, è stato possibile avere fiale anomale (ad esempio, senza ovuli o morti anomale); queste fiale potrebbero essere state originate da cause diverse, come la scarsa qualità degli alimenti o l'infezione, e potrebbero alterare significativamente i valori delle misure. Il modo migliore per gestire queste situazioni anomale era evitarle attraverso buone pratiche sperimentali. Va quindi sottolineato che, per tutti i protocolli di cui sopra, è stato necessario un grande e attento lavoro nella replica delle fiale, nel mantenere le mosche sane, e nella manipolazione delle mosche che, una volta esposte a un CED, potrebbero diventare delicate, aumentando così il rischio di morte quando Manipolato.

Figure 1
Figura 1: Saggio di alimentazione. Le mosche adulte in fiale contenenti CM/dye integrate con un EDC (in alto) o un solvente selezionato da solo (in basso) vengono lasciate da sfamare per 24 h. Due mosche alimentate su un mezzo integrato con un EDC (in alto) o solvente da solo (in basso) mostrano una colorazione simile sul loro addome. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: dosing EDC. Schematico della somministrazione della CED alla Drosophila dalla dieta. Le mosche adulte di uno stock isogenico sono esposte a diverse concentrazioni di un CED (in alto) o di un solvente da solo (in basso). N - la concentrazione di riferimento della CED. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Saggio di fertilità. Schematico del protocollo, che raffigura i passi dalla crescita della mosca nei media appropriati alla raccolta vergine e fino a singole croci. Fase 1: Gli adulti (10 fiale con otto femmine e quattro maschi ciascuno) da un ceppo isogenico vengono trasferiti su fiale con CM/EDC (superiore) o CM/solvente da solo (in basso). (Si noti che lo schema, per semplicità, si riferisce solo a una delle tre fiale.) Fase 2: Dopo 4 giorni, gli adulti vengono scartati e le uova deposte vengono lasciate a svilupparsi per 9 giorni fino alla fase adulta. Fase 3: gli adulti appena selezionati vengono ordinati per sesso e raccolti in fiale (max. 20 maschi/fiala e 10 femmine vergine/fiala). Fase 4: Gli adulti vengono lasciati invecchiare per 4 giorni sul mezzo corrispondente della crescita larvale. Fase 5: impostazione di 40 croci singole per mosche trattate con EDC in mezzo CM-tomato senza EDC, 20 volte un maschio trattato con EDC con una femmina di controllo e 20 volte uno maschio di controllo con una femmina trattata con EDC (in alto); impostazione di 20 croci singole per le mosche di controllo, 20x uno controllo maschio con una femmina di controllo (in basso). Il mezzo giallo è un CM integrato con un EDC (superiore) o un solvente come controllo (inferiore), e mezzo rosso è un pomodoro/CM senza EDC o solvente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Tempidi di sviluppo(protocollo dianalisi dell'eclosione 2). A sinistra, questa figura mostra uno schema della gabbia di raccolta in cui gli adulti (circa 150 femmine e 50 maschi) sono messi ad acclimatarsi e accoppiarsi al buio prima della fase di deposizione (vedi protocollo). Dopo 2 giorni, il vecchio vassoio scorrevole viene sostituito con uno con cibo fresco e le uova deposte nelle successive 1 h vengono scartate perché sono asincrone. Successivamente, le uova vengono raccolte ogni 2 h su un nuovo vassoio scorrevole, contate e poste su piatti contenenti pomodoro/CM integrati con un EDC o con solvente da solo. I dati (uova deposte totali, uova non chiuse, pupe e adulti chiusi) sono riportati su una serie di fogli di calcolo per la tempistica dello sviluppo (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Saggio della durata della vita. Un giorno le mosche sincronizzate vengono trasferite in una bottiglia da 250 mL con cibo per adulti (AM) integrata con un EDC (in alto) o un solvente (in basso) come controllo, per consentire l'alimentazione (a sinistra nello schema). Dopo 2-3 giorni, le mosche vengono ordinate per sesso e trasferite a cinque fiale (contenenti il mezzo corrispondente della bottiglia di partenza) per ogni sesso, in gruppi di 20 individui/flac. Ogni 3 giorni, gli adulti vengono trasferiti in fiale fresche fino a quando non è più necessario (parte centrale del regime). Sulla destra c'è uno schema della tabella in cui i dati vengono registrati per ogni giorno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Curve di durata. A sinistra, viene riportata una tabella rappresentativa in cui è stato registrato il numero di mosche morte ogni 3 giorni, sia per il gruppo di trattamento (medio : EDC [0,05 mM EE2]) sia per il gruppo di controllo (medio e solvibile), per tutto il periodo sperimentale. La durata media di ogni gruppo è stata calcolata utilizzando la SOMMA MATRIX. PRODOTTO; gruppo trattato ha ridotto la durata media rispetto al gruppo di controllo. Sulla destra, viene mostrata una tipica curva di sopravvivenza di mosche maschili alimentate con mezzo contenente EE2 (0,05 mM) o solo etanolo per il controllo. La curva di sopravvivenza è diminuita più rapidamente per le mosche trattate che per il gruppo di controllo, con un punto di svolta precedente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il fly d. melanogaster è stato ampiamente impiegato come sistema modello in vivo per studiare i potenziali effetti di EDC ambientali come DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33ed EE234. Diverse ragioni hanno portato il suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. A parte i suoi indiscussi vantaggi come sistema modello, la Drosophila condivide un alto grado di conservazione del gene con gli esseri umani, per il quale i saggi della Dcdiophila possono aiutare a prevedere o suggerire potenziali effetti per la salute umana. Inoltre, la Drosophila appartiene agli invertebrati, che sono ampiamente rappresentati in tutti gli ecosistemi e richiedono maggiori misure di protezione contro gli effetti dannosi dei CED. Gli invertebrati si trovano alla base della catena alimentare ed svolgono funzioni molto importanti per gli ambienti in cui vivono. È stato riferito che diversi EDC rilasciati nell'ambiente possono avere un'influenza dannosa sullo sviluppo e la riproduzione di diverse specie animali. La Drosophila offre il vantaggio aggiuntivo di essere utilizzato in laboratorio, dove i fattori che potenzialmente influenzano lo sviluppo, la riproduzione e la durata della vita possono essere tenuti sotto controllo al fine di attribuire qualsiasi variazione alla sostanza da testare.

Qui forniamo protocolli dettagliati per studiare gli effetti dell'esposizione alla CED in questo sistema modello sui tratti di vita regolati ormonali come la fecondità/fertilità, il tasso di sviluppo e la durata della vita. Abbiamo ottimizzato questi protocolli che hanno permesso di studiare gli effetti dell'esposizione eE234, BPA e BPAF (dati inediti), ma possono essere facilmente adattati per studiare gli effetti di altri EDC. In particolare, questi saggi possono essere utilizzati per studiare sia gli EDC puri che le combinazioni di diversi EDC, riproducendo più da vicino ciò che accade in natura. Anche se a quanto pare, possono sembrare semplici saggi di crescita, è importante lavorare secondo le linee guida appropriate, garantendo l'accuratezza e la riproducibilità45. È ben noto che la fertilità, i tempi di sviluppo e la longevità in D. melanogaster possono essere influenzati da fattori esterni e interni. Questi fattori critici, tra cui fotoperiodo, temperatura, umidità, nutrizione, densità di popolazione, struttura genetica ed età, devono essere attentamente controllati per l'esito dei protocolli riportati. Al fine di ridurre al minimo il componente della variabilità genetica, dovrebbe essere utilizzato un ceppo isogenico. Questo ceppo deve essere allevato con cura in un'incubatrice umidificata a temperatura controllata, con un fotoperiodo naturale di 12 h luce:12 h scuro a 25 gradi centigradi.

Oltre al mantenimento di un ambiente controllato, è necessario evitare il sovraffollamento larvale e di volo. È stato riferito che il sovraffollamento larvale può influenzare i tempi di sviluppo e indurre l'espressione di diversi geni, tra cui shock termico o geni correlati all'immunità, che influenzano la forma fisica totale delle mosche adulte46. Inoltre, le mosche adulte devono essere mantenute ad una densità abbastanza bassa da consentire la libera circolazione al fine di ridurre al minimo lo stress degli adulti. Inoltre, è importante assicurarsi che le mosche consumino quantità comparabili della CED in ogni gruppo di trattamento, tenendo conto del gusto del composto a diverse concentrazioni, perché le mosche tendono ad evitare cibi sgradevoli. Un altro aspetto importante di questi protocolli è la qualità degli alimenti; il cibo deve anche guardare bene, privo di bolle, crepe batteriche, e così via47,48. Inoltre, è necessario tenere a mente la sincronizzazione, lo stato di accoppiamento e la convivenza di genere per le mosche da testare. In tutti i protocolli riportati, è importante che le fiale parallele in fase di analisi devono essere molto simili; in caso contrario, sarebbe difficile capire quale scartare in modo che siano necessarie la massima attenzione e una buona pratica sperimentale. Infine, utilizzando questi protocolli per valutare gli effetti endocrini di DETERMINATI EDC, è importante tenere conto delle possibili interazioni con altri EDC presenti nel mezzo, come il metil4-idrossibenzoate o il BPA delle fiale di plastica. In questo senso, potrebbe essere utile cambiare l'agente antimicotico, usare fiale di vetro o eseguire saggi pilota sia con che senza possibili contaminanti.

I test di indice della Drosophila riportati possono essere molto efficaci per la valutazione di qualsiasi sostanza chimica o miscela di sostanze chimiche, come gli EDC, valutando i potenziali effetti sui tratti della vita regolati ormonali, come la riproduzione, lo sviluppo e la durata della vita. Tuttavia, questi saggi non possono servire a identificare chiaramente il meccanismo endocrino responsabile degli effetti negativi della CED. Per superare questa limitazione, è possibile eseguire gli stessi protocolli utilizzando EDC di riferimento che evocano risposte rappresentative di una certa modalità di azione sul sistema endocrino degli insetti (ad esempio, insetticidi di terza generazione che lavorano come JH o ecdysteroide agonista/antagonista)22. In alternativa, è anche possibile utilizzare endpoint molecolari, effettuando analisi molecolari su geni specifici che sono regolati ormonali e che sono considerati biomarcatori predittivi e specifici per la perturbazione endocrina34.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Orsolina Petillo per il supporto tecnico. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Mariarosaria Aletta (CNR) per il supporto bibliografico. Gli autori ringraziano il Dr. Gustavo Damiano Mita per averli introdotti nel mondo EDC. Gli autori ringraziano Leica Microsystems e Pasquale Romano per il loro aiuto. Questa ricerca è stata supportata dal progetto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Zzie Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Progetto PO FESR Campania 2007-2013 "NANO PERTECNOLOGIE O SOLAVOLTAO VOLTA E MOLECOLE BIO-ATTIVE NANO".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

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References

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Biologia dello sviluppo numero 149 Drosophila melanogaster sostanze chimiche interferenti endocrine fecondità fertilità sviluppo durata della vita
Metodi per testare la disgregazione endocrina nella <em>Drosophila melanogaster</em>
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Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

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