Summary
Wir zeigen die einzellige Kultur von Bakterien in riesigen Vesikeln (GVs). GVs, die Bakterienzellen enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode hergestellt und auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat zur direkten Beobachtung des Bakterienwachstums immobilisiert. Dieser Ansatz kann auch an andere Zellen angepasst werden.
Abstract
Wir haben eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzelliger Ebene in Riesigen Vesikeln (GVs) entwickelt. Bakterielle Zellkultur ist wichtig für das Verständnis der Funktion von Bakterienzellen in der natürlichen Umgebung. Aufgrund des technologischen Fortschritts können verschiedene bakterielle Zellfunktionen auf einzelzeller Ebene auf engstem Raum aufgedeckt werden. GVs sind kugelförmige mikrogroße Kompartimente, die aus amphiphilen Lipidmolekülen bestehen und verschiedene Materialien, einschließlich Zellen, aufnehmen können. In dieser Studie wurde eine einzelne Bakterienzelle durch die Tröpfchenübertragungsmethode in 10–30 m GVs eingekapselt und die GVs, die Bakterienzellen enthielten, auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat immobilisiert. Unsere Methode ist nützlich, um das Echtzeitwachstum einzelner Bakterien in GVs zu beobachten. Wir kultivierten Escherichia coli (E. coli) Zellen als Modell innerhalb von GVs, aber diese Methode kann an andere Zelltypen angepasst werden. Unsere Methode kann in den Bereichen Mikrobiologie, Biologie, Biotechnologie und Synthetische Biologie eingesetzt werden.
Introduction
Die Kultur der Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene hat zunehmend Beachtung gefunden. Die Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb eines begrenzten Raumes kann bakterielle Funktionen wie phänotypische Variabilität1,2,3,4, Zellverhalten5, 6 , 7 , 8 , 9und Antibiotikaresistenz10,11. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in Kulturtechniken kann die Kultur einzelner Bakterien auf engstem Raum erreicht werden, z. B. in einem Well-Chip4,7,8, Geltröpfchen12,13 , und Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen5,11. Um das Verständnis oder die Nutzung einzelner Bakterienzellen zu fördern, sind weitere technische Entwicklungen der Kultivierungstechniken erforderlich.
Vesikel, die die biologische Zellmembran imitieren, sind kugelförmige Kompartimente, die aus amphiphilen Molekülen bestehen und verschiedene Materialien aufnehmen können. Vesikel werden nach Größe klassifiziert und umfassen kleine Vesikel (SVs, Durchmesser < 100 nm), große Vesikel (LVs, <1 m) und Riesenbläschen (GVs, >1 m). SVs oder LVs werden aufgrund ihrer Affinität zur biologischen Zellmembran14häufig als Arzneimittelträger eingesetzt. GVs wurden auch als Reaktorsystem für den Bau von Protozellen15 oder künstlicheZellen16verwendet. Die Verkapselung biologischer Zellen inGVs wurde 17,18berichtet, und somit zeigen GVs in Kombination mit dem Reaktorsystem Potenzial als Zellkultursystem.
Hier beschreiben wir zusammen mit einem Video von experimentellen Verfahren, wie VVs als neuartige Zellkulturgefäße verwendet werden können19. GVs, die Bakterien enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode20 hergestellt und dann auf einer unterstützten Membran auf einem Deckglas immobilisiert. Wir nutzten dieses System, um das Bakterienwachstum auf einzelzelliger Ebene in GVs in Echtzeit zu beobachten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, nach der Tröpfchenübertragungsmethode
- Bereiten Sie Lipid-Lagerlösungen von 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 ml) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) in Chloroform/ Methanollösung (2/1, v/v) und lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C.
- Herstellung einer lipidhaltigen Öllösung
- Gießen Sie 20 l der POPC-Lösung und 4 l der Biotin-PEG-DSPE-Lösung in ein Glasrohr (Abbildung1b i)).
- Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom zu einem Lipidfilm und legen Sie den Film 1 h in einen Trockenbauort, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen (Abbildung 1b (ii)).
HINWEIS: Es ist notwendig, das organische Lösungsmittel in einer Dunstabzugshaube zu verdampfen. - Fügen Sie der Glasdurchstechflasche 200 l Mineralöl (0,84 g/ml, Materialtabelle)hinzu (Abbildung 1b (iii)).
- Den Eröffnungsteil der Glasdurchstechflasche mit Folie umwickeln und in einem Ultraschallbad (120 W) mindestens 1 h beschallen (Abbildung1b (iii)). Die Endkonzentrationen von POPC und Biotin-PEG-DSPE betragen 1 mM bzw. 0,002 mM.
- Vorkultur von Bakterienzellen
- E. coli in 1x LB Medium (1 g Hefeextrakt, 2 g Bacto Trypton und 2 g Natriumchlorid in 200 ml entionisiertem Wasser) aus einer LB-Platte impfen und bei 37 °C für 12–14 h (über Nacht) inkubieren.
- Nach der Inkubation 20 l der Kulturlösung sammeln und auf 1,98 ml frisches 1x LB-Medium übertragen und die Zellen für 2 h wieder kulturieren.
- Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) Wert der Vorkulturlösung (vorbereitet in Schritt 1.3.2). Es sollte eine vorkulturelle Lösung von OD600 = 1.0–1.5 verwendet werden.
- Vorbereitung der äußeren und inneren wässrigen Lösungen von GVs
- Glukose in 1x LB-Medium auflösen, um eine äußere wässrige Lösung von GVs vorzubereiten. Bereiten Sie 20 ml einer Glukoselösung (500 mM) vor.
- Verdünnen Sie die Glukoselösung mit 1x LB medium bis 200 mM (Tabelle 1).
- Sucrose in 1x LB Medium auflösen, um eine innere wässrige Lösung von GVs vorzubereiten. Bereiten Sie 20 ml einer Saccharoselösung (500 mM) vor.
- Mischen Sie die Vorkulturlösung (OD600 = 1,0–1,5), die Saccharoselösung (500 mM) und 1x LB medium (Tabelle 1). Der endgültige OD600-Wert der Kulturlösung sollte 0,01–0,015 und die endgültige Saccharosekonzentration 200 mM betragen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, osmotischen Druck zu vermeiden. Es ist notwendig, die Konzentration zwischen der inneren und äußeren wässrigen Lösung auszugleichen.
- Herstellung von Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen, die Bakterienzellen enthalten
- Fügen Sie 2 l der inneren wässrigen Lösung von GVs (in Schritt 1.4.4) bis 50 l der lipidhaltigen Öllösung (Mineralöl mit POPC und Biotin-PEG-DSPE) in ein 0,6 ml Deckelkunststoffrohr (Abbildung1b (iv)) ein.
- Emulgieren Sie die beiden Komponenten im Kunststoffrohr, indem Sie das Rohr von Hand tippen (Abbildung1b (v)).
- Bildung von GVs, die Bakterienzellen enthalten
- 50 l der äußeren wässrigen Lösung von GVs (in Schritt 1.4.2) in ein 1,5 ml Deckelkunststoffrohr (Abbildung1b (vi)) geben und 150 l der lipidhaltigen Öllösung (Mineralöl mit POPC und Biotin-PEG-DSPE) auf der Oberfläche des äußeren wässrigen Lösung(Abbildung 1b (vii)). Inkubieren Sie diese Probe bei Raumtemperatur (RT, 25 °C) für 10–15 min. Überprüfen Sie, ob die Schnittstelle zwischen Öl und wässrigen Lösungen flach ist.
- Fügen Sie 50 l der W/O-Tröpfchenlösung (in Schritt 1.5.2) an der Schnittstelle des Öls und der wässrigen Lösung mit einer Pipette hinzu (Abbildung1b (viii)).
- Zentrifugieren Sie das 1,5 ml-Kunststoffrohr (ab Schritt 1.6.2) für 10 min bei 1.600 x g bei RT in einer Desktop-Zentrifuge (Abbildung1b (ix)). Nach der Zentrifugation das Öl (obere Schicht) aus dem 1,5-ml-Kunststoffrohr mit einer Pipette ansaugen und die GVs mit Bakterienzellen sammeln (Abbildung 1b (x)).
2. Vorbereitung eines GV-Beobachtungssystems (Bakterielles Zellkultursystem)
-
Herstellung von kleinen Vesikeln (SVs) für konstruktiv ng a unterstützte Bilayer-Membran
- Gießen Sie 20 l der POPC-Lösung und 4 l der Biotin-PEG-DSPE-Lösung in ein Glasrohr (unter Verwendung der gleichen Lipidzusammensetzung wie bei der GV-Vorbereitung in Schritt 1.1).
- Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom zu einem Lipidfilm und legen Sie diese Probe in einem Trockengerät für 1 h, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.
- Fügen Sie 200 l 200 mM Glukose in 1x LB Medium (die äußere wässrige Lösung von GVs) in die Glasdurchstechflasche ein.
- Den Eröffnungsteil der Glasdurchstechflasche mit Folie umwickeln und in einem Ultraschallbad (120 W) mindestens 1 h beschallen.
- Bereiten Sie SVs nach dem Extrusionsverfahren21 mit einem Miniextruder und einer Polycarbonatmembran mit 100 nm Porengröße vor.
-
Vorbereitung einer handgefertigten Kammer
- Bohren Sie ein 7-mm-Loch mit einem Hohlstanz auf einer doppelseitigen Dichtung (10 mm x 10 mm x 1 mm).
- Die doppelseitige Dichtung mit dem Loch auf ein Abdeckglas (30 mm x 40 mm, Dicke 0,25–0,35 mm) kleben.
-
Vorbereitung einer unterstützten Doppelschichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
- Fügen Sie 30 l der SV-Lösung in das Loch der Kammer (in Abschnitt 2.2) und inkubieren bei RT für 30 min.
- Waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 l 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) durch Pipettieren enthält.
-
Immobilisierung von GVs auf der unterstützte Zweischichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
- 10 l Neutravidin mit der äußeren wässrigen Lösung von GVs (1 mg/ml) in das Loch einführen und bei RT 15 min inkubieren.
- Waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 l 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) durch Pipettieren enthält.
- Fügen Sie alle Lösung strotzenden GVs (in Schritt 1.6.3) in das Loch der Kammer und versiegeln Sie mit einem Abdeckglas (18 mm x 18 mm, Dicke 0,13–0,17 mm) (Abbildung 2b).
-
Mikroskopische Beobachtung des Bakterienzellwachstums in GVs
- Stellen Sie ein mikroskopisches Heizbühnensystem mit einem invertierten Mikroskop ein, das mit einer 40x/0,6 numerischen Blende (NA) Objektivlinse mit einem langen Arbeitsabstand ausgestattet ist (Abbildung 2b).
- Platzieren Sie die Kammer auf dem mikroskopischen Heizbühnensystem (Abbildung 2b). Inkubieren Sie die GVs, die Bakterienzellen in der Kammer enthalten, in einem statischen Zustand für 6 h bei 37 °C.
- Erfassen und aufzeichnen Sie Mikroskopbilder des Bakterienzellwachstums in GVs alle 30 min mit hilfe einer wissenschaftlichen Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkamera (sCMOS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir stellen eine einfache Methode zur Generierung von GVs vor, die einzelne Bakterienzellen mit der Tröpfchenübertragungsmethode enthalten (Abbildung 1). Abbildung 1a zeigt ein schematisches Bild der Ausfällung von GVs, die Bakterien enthalten. W/O-Tröpfchen, die Bakterien enthalten, werden durch Zentrifugation über die Öl-Wasser-Schnittstelle (Lipid-Monolayer) zu GVs übertragen. Der Dichteunterschied zwischen Saccharose (innere wässrige Lösung) und Glukose (äußere wässrige Lösung) unterstützt auch die Überquerung der Öl-Wasser-Schnittstelle der W/O-Tröpfchen. Es ist notwendig, den osmotischen Druck in der inneren und äußeren wässrigen Lösung zu überwachen, da ein leichter Unterschied in der Konzentration zwischen diesen Lösungen Verformung und Kollaps von GVs verursachen kann. Ein Flussdiagramm zur Vorbereitung von GVs, die Bakterienzellen durch die Tröpfchenübertragungsmethode enthalten, ist in Abbildung 1bdargestellt. Durch dieses Verfahren können GVs, die einzelne Bakterienzellen enthalten, leicht erhalten werden.
Um das Wachstum der bakterienzellgerüchen in GVs zu beobachten, wurde ein ursprüngliches Kultursystem für die mikroskopische Beobachtung konstruiert (Abbildung 2). GVs, die Bakterien enthalten, wurden auf einer mit Neutravidin beschichteten unterstützten Membranoberfläche auf einem Deckglas immobilisiert (Abbildung 2a). Diese Immobilisierungstechnik hat eine längere Beobachtung von GVs ermöglicht.
Typische Phasenkontrastmikroskopiebilder der unterschiedlich großen GVs, die einzelne Bakterienzellen enthalten, sind in Abbildung 3dargestellt. In diesem Experiment erhielten wir auch GVs, die Bakterienzellen mit Größen von 10 bis 30 m enthalten. Abbildung 3 zeigt das Bakterienwachstum auf einzelzelligem Niveau in GVs mit unterschiedlichen Größen von 10,7 m (Abbildung 3a) und 28 m (Abbildung 3b). Bei beiden GVs-Größen wurden E. coli-Zellen Dehnungs- und Teilungsprozesse durchlaufen, wobei ein oder zwei E. coli-Zellen über 6 h zu einer sehr großen Anzahl von Zellen heranwuchsen. So wuchsen E. coli-Zellen stabil in den GVs.
Die relative Häufigkeit von GVs, die eine bestimmte Anzahl von Bakterienzellen enthalten, ist in Abbildung 4dargestellt. In unserem experimentellen Zustand (OD600 = 0,01–0,015) wurden Bakterienzellen auf Einzelzellebene in etwa 10% der erhaltenen GVs verkapselt (leere GVs waren etwa 80%). Die auf Einzelzellebene gekapselten GVs waren etwa 50 % der GVs, die Bakterienzellen enthielten, wie aus dem Einset von Abbildung 4geschätzt.
Abbildung 1: Experimentelle Verfahren von GVs, die Bakterien enthalten. (a) Schema von GVs, die Bakterien enthalten, die nach einer Tröpfchentransfermethode hergestellt werden. W/O-Mikrotröpfchen, die Bakterien enthalten, passieren durch Zentrifugalkraft eine Lipid-Monolayer-Schnittstelle und bilden dann eine Lipid-Doppelschichtmembran. (b) Fluss der Synthese von GVs, die Bakterien enthalten. i) Organische lösungsmittelhaltige Lipide (POPC und Biotin-PEG-DSPE, 100:0,2 Molverhältnis). ii) Lipidfolie an der Unterseite der Glasdurchstechflasche. iii) Öllösung, die Lipide enthält. iv) Mischung aus 50 l Öllösung und 2 l innenwässriger Lösung (200 mM Saccharose und 1x LB-Medium), die Bakterienzellen enthält. v) Emulgierung durch Handklopfen (über 50-mal). vi) 50 l der äußeren wässrigen Lösung (200 mM Glukose in 1x LB-Medium). vii) Schichtung von 150 l Öllösung auf der äußeren wässrigen Lösung. viii) Schichtung der W/O-Tröpfchenlösung. ix) Zentrifugation des Rohres. x) Gefälltitten GVs, die Bakterienzellen nach dem Absetzen des Öls enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die o Bservierungssystem der bakteriellen Zellkultur in GVs. (a) GVs werden auf einer unterstützten Membran durch Biotin-Neutravidin-Bindung auf dem Deckglas immobilisiert. GVs werden durch eine Heizungsanlage inkubiert. (b) Bild des Beobachtungssystems einschließlich einer handgefertigten Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Phasenkontrastmikroskopbilder von GVs, die einzelne Bakterienzellen enthalten (angezeigt durch die schwarzen Pfeile). Schnappschüsse des bakterienbasierten Zellwachstums in verschiedenen GVs. (a) Vesikelgröße = 10,7 m. (b) Vesikelgröße = 28 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Statistische Analyse der Anzahl der gekapselten Bakterienzellen pro GV. Die relativen Frequenzen von GVs wurden als Histogramme dargestellt. Inset: Vergrößerung der relativen Frequenzen von GVs, die Bakterienzellen von einzelnen bis 10< Zellen enthalten. Insgesamt wurden 235 GVs analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Äußere wässrige Lösung | Innere wässrige Lösung | Finale | |
| 500 mM Glukose mit LB medium | 200 l | – | 200 mM |
| 500 mM Saccharose mit LB medium | – | 200 l | 200 mM |
| 1x LB mittel | 300 l | 295 l | – |
| Vorkulturlösung (OD600 = 1.0–1.5) | – | 5 l | OD600 = 0,01–0,015 |
| Gesamtvolumen | 500 l | 500 l |
Tabelle 1: Zusammensetzung und Volumen der äußeren und inneren wässrigen Lösungen von GVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb von GVs. Bei dieser einfachen Methode werden GVs gebildet, die Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene enthalten, indem die Tröpfchenübertragungsmethode verwendet wird. Im Vergleich zu anderen Ansätzen zur Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, hat diese Methode zwei Vorteile: (i) es ist leicht zu entwickeln, und (ii) ein kleines Volumen (2 l) der Probenlösung ist erforderlich, um die GVs vorzubereiten. Die Tröpfchentransfermethode20 zur Herstellung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, ist einfacher als die klassische Hydratation22 und die Mikrofluidik-Methoden17. Zum Beispiel ist die klassische Hydratationsmethode22 eine einfache und einfache Methode zur Herstellung von GVs, aber die Verkapselungseffizienz von Materialien in GVs ist recht gering und es sind mindestens ein paar hundert Mikroliter Probe erforderlich. Die kürzlich entwickelten Zellulose-Papier-gestützte Hydratation23 und gelunterstützte Hydratation24 Methoden zur Herstellung von GVs haben eine hohe Verkapselungseffizienz von Biomolekülen im Vergleich zur klassischen Hydratationsmethode22. Ihre Verkapselungseffizienz ist so hoch wie die der Tröpfchentransfertechnik, und es wird erwartet, dass diese beiden Methoden die Verkapselung von Zellen in GVs ermöglichen können. Darüber hinaus kapselt die Mikrofluidik-Methode17 einzelne Zellen in GVs und zeigt eine sehr hohe Verkapselungseffizienz von Materialien in GVs, erfordert jedoch eine komplizierte Handhabung und Techniken zur Herstellung von Mikrogeräten und eine große Probenvolumen (mindestens ein paar Milliliter), um das Rohr zu fließen.
In diesem Protokoll ist die Stabilität der Öl-Wasser-Schnittstelle wichtig für die Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten (Abbildung 1b (vii)). Um viele GVs zu erhalten, ist es wichtig, die Öl-Wasser-Schnittstelle abzuflachen. Daher ist eine ordnungsgemäße Vorbereitung der Ölphase notwendig. Wir beschallten die Ölphase für mindestens 1 h in einem Hochleistungs-Ultraschallbad (120 W), um die Lipidmoleküle vollständig aufzulösen. Es ist wichtig, die Ölphase auf der äußeren wässrigen Lösung unmittelbar nach der Beschallung zu schichten (Abbildung 1b (vii)).
Die hier beschriebene Methode hat zwei Einschränkungen. Erstens brechen GVs oft und Bakterienzellen sickern in die äußere wässrige Lösung aus. Dies liegt daran, dass während der GV-Bildung einige W/O-Tröpfchen nicht durch die Öl-Wasser-Schnittstelle übertragen und gebrochen werden können. Dies ist bei Verwendung der Tröpfchenübertragungsmethode20unvermeidbar. Darüber hinaus können GVs während der Beobachtung brechen. Die Stabilität von GVs muss verbessert werden, z. B. durch die Verwendung eines künstlichen Zytoskeletts, das GVs25stabilisiert. Zweitens kann die Anzahl der verkapselten Bakterienzellen nicht perfekt kontrolliert werden. Abbildung 4 zeigt, dass eine große Anzahl von Bakterienzellen in den GVs eingekapselt wurden, und daher ist es schwierig, die Anzahl der Bakterienzellen in GVs mit der Tröpfchenübertragungsmethode zu kontrollieren. Zur Steuerung der Zellnummer kann die Mikrofluidik-Technologie eingesetzt werden.
GVs können ihre innere wässrige Lösung effektiver steuern als andere Materialien (Geltröpfchen12,13 oder W/O Tröpfchen5,11). Zum Beispiel werden die wässrigen Bedingungen der inneren und äußeren Lösungen von GVs durch natürliche Membrandurchlässigkeit26 oder Durchlässigkeit durch eine Membranpore16 oder Transporter27erleichtert verändert. Bei der vorliegenden Methode verblieben Ölmoleküle (in diesem Fall Mineralöl) in der Membran20. Der Einfluss des in der Membran verbleibenden Öls auf die Durchlässigkeit von Nährstoffen oder Sauerstoff für das Bakterienwachstum ist unbekannt. Obwohl wir die natürliche Membrandurchlässigkeit von Nährstoffen oder Sauerstoff nicht kennen, sind wir der Ansicht, dass die Menge an Nährstoffen oder Sauerstoff im Wachstumsmedium für das Bakterienwachstum in der vorliegenden Studie ausreichend war. Die natürliche Membrandurchlässigkeit von Nährstoffen oder Sauerstoff ist sehr wichtig für das Wachstum bakterieller Zellen und ein wichtiges Thema für zukünftige Studien. Die Technik zur Kontrolle der Durchlässigkeit kann nicht mit der Kulturmethode mit Geltröpfchen12,13 oder W/O Tröpfchen5,11durchgeführt werden. GVs werden somit die erste Wahl für Anwendungen der Bakterienkultur auf engstem Raum.
Unsere Bakterielle Kulturmethode ist ein potenziell neues Konzept und Werkzeug in der Mikrobiologie19, um unbekannte Umweltbakterien für die Gewinnung oder Analyse ihrer Stoffwechselprodukte zu kultitogen. Darüber hinaus sind unsere bakteriellen zellhaltigen GVs ein Hybridsystem eines künstlichen Zellmodells (GVs) und einer lebenden Zelle (Bakterienzellen), um ein neues Werkzeug für die Biotechnologie28 und die synthetische Bodenbiologie29zu schaffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einer Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) japans unterstützt, einem Stipendium für junge Wissenschaftlerforschung (Nr. 18K18157, 16K21034) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) bis M.M., und Grant-in-Aid von MEXT bis K.K. (Nr. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al.
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al.
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L.
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
