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Immunology and Infection

विशालकाय Vesicles के अंदर एकल सेल स्तर पर जीवाणु सेल संस्कृति

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59555
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

Summary

हम विशाल vesicles (GVs) के अंदर बैक्टीरिया की एकल कोशिका संस्कृति का प्रदर्शन. जीवाणु कोशिकाओं वाले जीव ों को छोटी बूंद हस्तांतरण विधि द्वारा तैयार किया गया था और जीवाणु विकास के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए कांच सब्सट्रेट पर एक समर्थित झिल्ली पर स्थिर किया गया था। यह दृष्टिकोण भी अन्य कोशिकाओं के लिए अनुकूलनीय हो सकता है.

Abstract

हमने विशाल vesicles (GVs) के अंदर एकल-सेल स्तर पर जीवाणु कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक विधि विकसित की है। जीवाणु कोशिका संस्कृति प्राकृतिक वातावरण में जीवाणु कोशिकाओं के समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। तकनीकी प्रगति के कारण, विभिन्न जीवाणु कोशिका कार्यों एक सीमित स्थान के अंदर एकल सेल स्तर पर पता चला जा सकता है. जीवी गोलाकार सूक्ष्म आकार के डिब्बे हैं जो उभयरागी लिपिड अणुओं से बने होते हैं और कोशिकाओं सहित विभिन्न सामग्रियों को पकड़ सकते हैं। इस अध्ययन में, एक एकल जीवाणु कोशिका को बूंद-बूंद हस्तांतरण विधि द्वारा 10-30 डिग्री ग्राम जीव में समझाया गया था और जीवाणु कोशिकाओं वाले जीवी को कांच के सब्सट्रेट पर एक समर्थित झिल्ली पर स्थिर किया गया था। हमारी विधि GVs के अंदर एकल बैक्टीरिया की वास्तविक समय विकास को देखने के लिए उपयोगी है. हम GVs के अंदर एक मॉडल के रूप में Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) कोशिकाओं को सुसंस्कृत, लेकिन इस विधि अन्य सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हमारी विधि सूक्ष्म जीव विज्ञान, जीव विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी, और सिंथेटिक जीव विज्ञान के विज्ञान और औद्योगिक क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

एकल कोशिका स्तर पर जीवाणु कोशिकाओं की संस्कृति पर अधिक ध्यान दिया गया है। एक सीमित स्थान के अंदर एकल कोशिका स्तर पर जीवाणु कोशिकाओं को ठंडा करने से जीवाणु कार्यों जैसे फेनोटाइपिक परिवर्तनशीलता1,2,3,4, सेल व्यवहार5, 6 , 7 , 8 , 9, और एंटीबायोटिक प्रतिरोध10,11. संस्कृति तकनीकों में हाल ही में प्रगति की वजह से, एकल बैक्टीरिया की संस्कृति एक सीमित स्थान के अंदर प्राप्त किया जा सकता है, जैसे एक अच्छी तरह से चिप4,7,8, जेल छोटी बूंद12,13 में , और पानी में तेल (W/O) बूंद5,11. एकल जीवाणु कोशिकाओं की समझ या उपयोग को बढ़ावा देने के लिए, खेती की तकनीकों के आगे तकनीकी विकास की आवश्यकता है।

वेसिकल्स जो जैविक कोशिका झिल्ली की नकल करते हैं, वे गोलाकार डिब्बे होते हैं जिनमें उभयरागी अणु होते हैं और विभिन्न पदार्थ ों को पकड़ सकते हैं। Vesicles आकार के अनुसार वर्गीकृत कर रहे हैं और छोटे vesicles शामिल हैं (SVs, व्यास और lt; 100 एनएम), बड़े vesicles (LVs, और lt;1 $m), और विशाल vesicles (GVs, gt;1 $m). एसवी या एलवी का उपयोग सामान्यतः जैविक कोशिका झिल्ली14के प्रति उनकी आत्मीयता के कारण औषध वाहकों के रूप में किया जाता है . जीवी का उपयोग प्रोटोसेल्स15 या कृत्रिम कोशिकाओं16के निर्माण के लिए एक रिएक्टर प्रणाली के रूप में भी किया गया है। जीवी में जैविक कोशिकाओं के encapsulation17,18की सूचना दी गई है , और इस तरह जीवी एक सेल संस्कृति प्रणाली के रूप में क्षमता दिखाने के लिए जब रिएक्टर प्रणाली के साथ संयुक्त.

यहाँ, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के एक वीडियो के साथ, हम वर्णन कैसे GVs उपन्यास सेल संस्कृति जहाजों19के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. बैक्टीरिया युक्त जीव 20 छोटी बूंद हस्तांतरण विधि द्वारा किए गए थे और फिर एक कवर ग्लास पर एक समर्थित झिल्ली पर immobilized थे. हम वास्तविक समय में GVs के अंदर एकल सेल स्तर पर जीवाणु विकास का निरीक्षण करने के लिए इस प्रणाली का इस्तेमाल किया.

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Protocol

1. ड्रॉपलेट स्थानांतरण विधि द्वारा जीवाणु कोशिकाओं युक्त जीवी की तैयारी

  1. 1-पामितोल-2-ओलियोइल-स्न ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलीन (पीओपीसी, 10 एमएम, 1 एमएल) और 1,2-डिस्टेरोयल-स्न-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोएथेनोलमाइन-एन-बायोटिनिल (पॉलीथीनग्लिथल)-2000] (बायोटिन-पीईजी-डीएसपीई, 0.1 एम.एम., 1 एमएल) क्लोरोफॉर्म/ मेथनॉल विलयन (2/1, v/v) और स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  2. लिपिड युक्त तेल समाधान की तैयारी
    1. पीओपीसी विलयन का 20 डिग्री सेल्सियस तथा बायोटिन-पीईजी-डीएसपीई विलयन का 4ल् एक काँच की नली में डाल दें (चित्र1ब (प)।।
    2. एक लिपिड फिल्म बनाने के लिए वायु प्रवाह द्वारा कार्बनिक विलायक को वाष्पित करें और फिल्म को 1 ज के लिए एक शुष्कक में रख दें ताकि कार्बनिक विलायक को पूरी तरह से वाष्पित कर दिया जा सके (चित्र 1ख (ii))।
      नोट: यह एक धूआं हुड में कार्बनिक विलायक वाष्पित करने के लिए आवश्यक है।
    3. कांच की शीशी (चित्र1ब (पपप) में 200 र्ल् खनिज तेल (0ण्84 हधम,मL, सामग्रीसारणी) जोड़ें।
    4. फिल्म के साथ कांच शीशी के उद्घाटन भाग लपेटें और कम से कम 1 एच के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान (120 डब्ल्यू) में यह sonicate (चित्र 1b (iii))। पीओपीसी और बायोटिन-पीईजी-डीएसपीई की अंतिम सांद्रता क्रमशः 1 एमएम और 0.002 एमएम है।
  3. जीवाणु कोशिकाओं की पूर्व संस्कृति
    1. 1x LB माध्यम (1 ग्राम खमीर निकालने, 2 ग्राम बैक्टो ट्रिप्टोन, और 2 00 एमएल deionized पानी में 2 ग्राम सोडियम क्लोराइड) में ई. कोलाई में टीका लगाने और 12-14 एच (रात के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट)।
    2. ऊष्मायन के बाद, संस्कृति समाधान के 20 $L इकट्ठा करने और ताजा 1x LB माध्यम के 1.98 एमएल करने के लिए स्थानांतरण, और संस्कृति कोशिकाओं को फिर से 2 ज के लिए.
    3. 600 एनएम (ओडी600) पूर्व संस्कृति समाधान के मूल्य पर ऑप्टिकल घनत्व की जाँच करें (चरण 1.3.2 में तैयार). ओडी600 र् 1ण्0-1ण्5 के पूर्व-संवर्धन समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. GVs के बाहरी और आंतरिक जलीय समाधान की तैयारी
    1. ग्लूकोज का बाहरी जलीय विलयन तैयार करने के लिए 1x LB माध्यम में ग्लूकोज को भंग करें। स्टॉक ग्लूकोज समाधान (500 एमएम) का 20 एमएल तैयार करें।
    2. 1x LB मध्यम से 200 MM (तालिका 1) के साथ स्टॉक ग्लूकोज समाधान को पतला करें।
    3. जीवी का आंतरिक जलीय विलयन तैयार करने के लिए 1x LB माध्यम में सुक्रोज को भंग करें। स्टॉक सुक्रोज विलयन (500 एम)) का 20 एमएल तैयार करें।
    4. पूर्व-संस्कृति विलयन (ओड600 र् 1ण्0ण्1ण्5), सुक्रोज विलयन (500 उम) तथा 1x LB माध्यम (तालिका1) मिलाएं। संस्कृति समाधान के अंतिम OD600 मूल्य 0.01-0.015 होना चाहिए और अंतिम sucrose एकाग्रता 200 मीटर होना चाहिए.
      नोट: परासरणी दबाव से बचने के लिए ध्यान रखें। आंतरिक और बाहरी जलीय विलयन के बीच सांद्रता को संतुलित करना आवश्यक है।
  5. पानी में तेल की तैयारी (W/O) जीवाणु कोशिकाओं से युक्त बूंदों
    1. जीवी के आंतरिक जलीय विलयन का 2 डिग्री सेल्सियस जोड़ना (चरण 1-4-4 में तैयार) लिपिड युक्त तेल विलयन के 50 डिग्री सेल्सियस (पीओपीसी और बायोटिन-पीईजी-डीएसपीई के साथ खनिज तेल) को 0ण्6 एमएल ढक्कनवाली प्लास्टिक ट्यूब में जोड़ें (चित्र1ख (iv))।
    2. ट्यूब को हाथ से टैप करके प्लास्टिक ट्यूब के दो घटकों को पायस कीजिए (चित्र 1ख (अ)।
  6. जीवाणु कोशिकाओं वाले जीव ी का निर्माण
    1. जीवी के बाहरी जलीय विलयन का 50 डिग्री सेल्सियस (चरण 1.4ण्2 में तैयार) 1.5 एमएल ढक्कनदार प्लास्टिक ट्यूब में जोड़ें (चित्र 1b (vi)) और धीरे परत 150 $L तेल समाधान जिसमें लिपिड (POPC और बायोटिन-PEG-DSPE के साथ खनिज तेल) बाहरी ऊसकी की सतह पर हल(चित्र 1ख (vii)। 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी, 25 डिग्री सेल्सियस) पर इस नमूने को इनक्यूबेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए जाँचें कि तेल और जलीय समाधानों का इंटरफ़ेस सपाट है।
    2. पिपेट का उपयोग करते हुए तेल तथा जलीय विलयन के अंतराफलक पर ड/ओ बूंदी विलयन (चरण 1.5ण्2 में तैयार) का 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (चित्र 1ब (viii)) का उपयोग करके।
    3. सेंट्रीफ्यूज 1.5 एमएल ढक्कनदार प्लास्टिक ट्यूब (चरण 1.6.2 से) के लिए 10 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर एक डेस्कटॉप सेंट्रीफ्यूज में आरटी (चित्र1b (ix))। अपकेंद्रण के बाद, 1.5-एमएल ढक्कन वाले प्लास्टिक ट्यूब से तेल (शीर्ष परत) को एक पिपेट का उपयोग करके, और जीवाणु कोशिकाओं वाले जीवी एकत्र करें (चित्र 1ख (x))।

2. एक जीवी अवलोकन प्रणाली की तैयारी (बैक्टीरियल सेल संस्कृति प्रणाली)

  1. निर्माण के लिए छोटे vesicles (एसवी) की तैयारी एन.एन.जी. ए. समर्थित द्विपरत झिल्ली
    1. पीओपीसी विलयन का 20 डिग्री सेल्सियस और बायोटिन-पीईजी-डीएसपीई विलयन का 4 डिग्री सेल्सियस कांच की नली में डालें (चरण 1-1 में जीवी तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले समान लिपिड संरचना का उपयोग करके)।
    2. एक लिपिड फिल्म बनाने के लिए हवा के प्रवाह से कार्बनिक विलायक का वाष्पित करें और इस नमूने को 1 एच के लिए एक desiccator में पूरी तरह से कार्बनिक विलायक वाष्पित करने के लिए रखें।
    3. कांच की शीशी में 1x एलबी माध्यम (जीवी का बाहरी जलीय विलयन) में 200 एमएल 200 एमएल जोड़ें।
    4. फिल्म के साथ कांच शीशी के उद्घाटन भाग लपेटें और कम से कम 1 एच के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान (120 डब्ल्यू) में यह sonicate।
    5. बाहर निकालना विधि द्वारा SVs तैयार21 100 एनएम छिद्र आकार के साथ एक मिनी-एक्सट्रूडर और पॉली कार्बोनेट झिल्ली का उपयोग कर।
  2. एक हस्तनिर्मित कक्ष की तैयारी
    1. एक डबल चेहरे सील पर एक खोखले पंच के साथ एक 7 मिमी छेद ड्रिल (10 मिमी x 10 मिमी x 1 मिमी).
    2. एक कवर ग्लास (30 मिमी x 40 मिमी, मोटाई 0.25-0.35 मिमी) पर छेद के साथ डबल चेहरे सील पेस्ट करें।
  3. कक्ष के छेद में कवर कांच पर एक समर्थित द्विपरत झिल्ली की तैयारी
    1. कक्ष के छेद में एसवी विलयन का 30 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (खंड 2-2 में तैयार) और 30 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
    2. छेद को पाइपिंग द्वारा 200 एमएल ग्लूकोज (जीवी के बाहरी जलीय समाधान) युक्त 1x LB माध्यम के 20 डिग्री सेल्सियस से दो बार धोएं।
  4. पर जीवी की अचलीकरण कक्ष के छेद में कवर कांच पर समर्थित द्विपरत झिल्ली
    1. ग्वीकेस (1 मिलीग्राम/एमएल) के बाह्य जलीय विलयन के साथ न्यूट्राविडिन के 10 डिग्री सेल्सियस का परिचय छेद में और 15 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
    2. छेद को पाइपिंग द्वारा 200 एमएल ग्लूकोज (जीवी के बाहरी जलीय समाधान) युक्त 1x LB माध्यम के 20 डिग्री सेल्सियस से दो बार धोएं।
    3. कक्ष के छेद में जीवी (चरण 16.3 में तैयार) वाले सभी घोल जोड़ें तथा आवरण कांच (18 मिमी x 18 उउ, मोटाई 0ण्13-0ण्17 उउ) (चित्र2ब) के साथ सील करें।
  5. जीवी के अंदर जीवाणु कोशिका विकास का सूक्ष्म अवलोकन
    1. एक सूक्ष्म तापन अवस्था प्रणाली को एक उल्टे सूक्ष्मदर्शी के साथ सेट करें जो लंबी कार्य दूरी के साथ 40x/0ण्6 संख्यात्मक छिद्र (एनए) परविकलित लेंस से सुसज्जित है (चित्र 2ब)।
    2. सूक्ष्म तापन अवस्था तंत्र पर कक्ष रखें (चित्र 2ब)। जीवी को 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 एच के लिए एक स्थिर स्थिति में कक्ष में जीवाणु कोशिकाओं से युक्त इनक्यूबेट करें।
    3. एक वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (sCMOS) कैमरे का उपयोग करके GVs के अंदर जीवाणु कोशिका विकास के हर 30 मिनट पर कब्जा और रिकॉर्ड माइक्रोस्कोप छवियों.

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Representative Results

हम बूंद-बूंद अंतरण विधि का उपयोग करके एकल जीवाणु कोशिकाओं वाले जीव ों वाले जीव ों के उत्पादन के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं (चित्र 1)। चित्र 1क बैक्टीरिया युक्त जीवी की वर्षण की एक योजनाबद्ध छवि दिखाता है। W/O बैक्टीरिया युक्त बूंदों को जीवी बनाने के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा तेल-पानी (लिपिड मोनोलेयर) इंटरफेस में स्थानांतरित किया जाता है। सुक्रोज (इनर जलीय विलयन) और ग्लूकोज (बाहरी जलीय विलयन) के बीच घनत्व में अंतर भी W/O बूंदों के तेल-जल इंटरफ़ेस के पार करने में सहायता करता है। आंतरिक और बाहरी जलीय समाधान में परासरणी दबाव की निगरानी करना आवश्यक है क्योंकि इन समाधानों के बीच एकाग्रता में थोड़ा सा अंतर जीवी के विरूपण और पतन को प्रेरित कर सकता है। छोटी बूंद हस्तांतरण विधि द्वारा जीवाणु कोशिकाओं वाले जीवी तैयार करने के लिए एक प्रवाह चार्ट चित्र 1खमें दर्शाया गया है। इस प्रक्रिया का पालन करके, एकल जीवाणु कोशिकाओं वाले जीवी आसानी से प्राप्त किए जा सकते हैं।

जीवी के भीतर जीवाणु कोशिका वृद्धि का प्रेक्षण करने के लिए सूक्ष्म प्रेक्षण के लिए एक मूल संस्कृति प्रणाली का निर्माण किया गया था (चित्र2)। बैक्टीरिया युक्त जीवी को आवरण कांच पर न्यूट्राविडिन से लेपित समर्थित झिल्ली की सतह पर स्थिर किया गया था (चित्र 2क) . इस स्थिरीकरण तकनीक ने जीवी का लंबे समय तक अवलोकन करने में सक्षम बना दिया है।

एकल जीवाणु कोशिकाओं वाले विभिन्न आकार के जीव ों की विशिष्ट प्रावस्था-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी छवियां चित्र 3में दर्शाए गए हैं। इस प्रयोग में, हमने जीवी भी प्राप्त की जिसमें जीवाणु कोशिकाएं होती हैं जिनमें 10 डिग्री मी से लेकर 30 डिग्री मी तक के आकार होते हैं। चित्र 3 10ण्7 उ के विभिन्न आकारों के साथ ग्Vs के अंदर एकल-कोशिका स्तर पर जीवाणु वृद्धि दर्शाता है (चित्र 3क) तथा 28 उ (चित्र 3ख) । GVs के दोनों आकारों के लिए, ई. कोलाई कोशिकाओं को एक या दो ई. कोलाई कोशिकाओं के साथ 6 एच से अधिक कोशिकाओं की एक बहुत बड़ी संख्या में बढ़ रही है, लंबाई और विभाजन प्रक्रियाओं लिया. इस प्रकार, ई. कोलाई कोशिकाओं GVs के अंदर स्थिर वृद्धि हुई.

जीवों की सापेक्ष आवृत्ति जिसमें जीवाणु कोशिकाओं की दी गई संख्या होती है, चित्र 4में दर्शाया गया है. हमारे प्रयोगात्मक स्थिति में (ओ.डी.ओ.डी.600 $ 0.01-0.015), जीवाणु कोशिकाओं प्राप्त GVs के लगभग 10% में एकल सेल स्तर पर encapsulated थे (खाली GVs लगभग 80% थे). चित्रा 4के इनसेट से अनुमान के अनुसार, एकल कोशिका स्तर पर समझाए गए जीव-जीव जीवाणु कोशिकाओं के लगभग 50% थे।

Figure 1
चित्र 1: बैक्टीरिया युक्त जीवी की प्रायोगिक प्रक्रियाएं। (क) एक छोटी-छोटी-छोटी-छोटी-छोटी-छोटी विधि द्वारा तैयार किए गए बैक्टीरिया वाले जीवी की योजना। W/O microdroplets बैक्टीरिया युक्त केन्द्रापसारक बल द्वारा एक लिपिड मोनोलेयर इंटरफेस के माध्यम से पारित और फिर एक लिपिड bilayer झिल्ली के रूप में. (ख) जीवाणुयुक्त जीवी के संश्लेषण का प्रवाह। (i) लिपिड युक्त कार्बनिक विलायक (पीओपीसी और बायोटिन-पीईजी-डीएसपीई, 100:0.2 मोलर अनुपात)। (पप) कांच की शीशी के तल पर लिपिड फिल्म। (पपप) लिपिड युक्त तेल समाधान। (पअ) 50 डिग्री सेल्सियस तेल विलयन का मिश्रण तथा आंतरिक जलीय विलयन (200 एम एम सुक्रोज तथा 1x LB माध्यम) जिसमें जीवाणु कोशिकाएं होती हैं। (v) हाथ से दोहन (50 बार से अधिक) पायसीकरण। (vi) बाह्य जलीय विलयन का 50 डिग्री सेल्सियस (200 मृ ग्लूकोज 1x LB माध्यम में)। (vii) बाह्य जलीय विलयन पर 150 उउतेल तेल विलयन का लेयरिंग। (viii) डब्ल्यू/ओ ड्रॉपलेट समाधान का लेयरिंग। (ix) ट्यूब का केंद्रीकरण। (x) तेल की आकांक्षा के बाद जीवाणु कोशिकाओं से युक्त होने वाले जीवी की गति निर्धारित की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ओ GVs के अंदर जीवाणु कोशिका संस्कृति के संरक्षण प्रणाली. (ं) जीवी आवरण काँच पर बायोटिन-न्यूट्राविडिन के माध्यम से समर्थित झिल्ली पर स्थिर हो जाते हैं। जीवी एक हीटिंग सिस्टम द्वारा incubated रहे हैं. (ख) एक हस्तनिर्मित कक्ष सहित प्रेक्षण प्रणाली का चित्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एकल बैक्टीरिया कोशिकाओं वाले जीवी के चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप छवियों (काले तीर द्वारा इंगित)। विभिन्न आकार के जीवी के अंदर जीवाणुकोशिका वृद्धि की स्नैप-शॉट्स। (क ) वेसिकल साइज 10ण्7 उ. (ख) वेस्कल का आकार ] 28 उ. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रति जीवी encapsulated जीवाणु कोशिकाओं की संख्या का सांख्यिकीय विश्लेषण. GVs के सापेक्ष आवृत्तियों हिस्टोग्राम के रूप में साजिश रची गई. इनसेट: जीवी के सापेक्ष आवृत्तियों का आवर्धन जिसमें जीवाणु कोशिकाओं को एकल से 10 और एलटी; कोशिकाओं तक शामिल किया जाता है। कुल 235 GVs का विश्लेषण किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बाहरी जलीय समाधान इनर जलीय समाधान अंतिम
एलबी माध्यम के साथ 500 एमएम ग्लूकोज 200 $L – 200 एमएम
एलबी माध्यम के साथ 500 एम एम सुक्रोज – 200 $L 200 एमएम
1x LB माध्यम 300 $L 295 जेडएल –
पूर्व-संस्कृति समाधान (ओ.डी.ओ.डी.600 $ 1.0-1.5) – 5 $L ओ.डी.600 ] 0.01-0.015
कुल मात्रा 500 $L 500 $L

तालिका 1: जीवी के बाहरी और आंतरिक जलीय समाधानों की संरचना और खंड।

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Discussion

यहाँ, हम जीवी के अंदर एकल कोशिका स्तर पर जीवाणु कोशिकाओं culturing के लिए एक विधि का वर्णन. इस सरल विधि में बूंद-बूंद स्थानांतरण विधि का उपयोग करके एकल-सेल स्तर पर जीवाणु कोशिकाओं वाले जीव के निर्माण को शामिल किया गया है। जीवाणु कोशिकाओं युक्त GVs प्राप्त करने के लिए अन्य तरीकों के साथ तुलना में, इस विधि के दो फायदे हैं: (i) इसे विकसित करना आसान है, और (ii) जीवी तैयार करने के लिए नमूना समाधान की एक छोटी मात्रा (2 डिग्री एल) की आवश्यकता होती है। जीवाणु कोशिकाओं वाले जीव ों वाले जीव ों को तैयार करने के लिए छोटी बूंद हस्तांतरण विधि20 क्लासिकल हाइड्रेशन22 और माइक्रोफ्लूइडिक्स विधियोंकीतुलना में सरल है . उदाहरण के लिए, शास्त्रीय जलयोजन विधि22 GVs तैयार करने के लिए एक सरल और आसान तरीका है, लेकिन GVs में सामग्री के encapsulation दक्षता काफी कम है और नमूना के कम से कम कुछ सौ microliters की आवश्यकता है. हाल ही में विकसित सेलूलोज़ कागज-एबेटेड जलयोजन23 और जीवी बनाने के लिए जेल की सहायता से जलयोजन24 विधियों में शास्त्रीय जलयोजन विधि22की तुलना में जैव अणुओं की उच्च encapsulation दक्षता है। उनके encapsulation दक्षता छोटी बूंद हस्तांतरण तकनीक के रूप में के रूप में उच्च है, और यह उम्मीद है कि इन दो तरीकों GVs के अंदर कोशिकाओं के encapsulation की अनुमति हो सकती है. इसके अलावा, microfluidics विधि17 सही GVs के अंदर एकल कोशिकाओं encapsulates और GVs में सामग्री की एक बहुत ही उच्च encapsulation दक्षता से पता चलता है, लेकिन जटिल हैंडलिंग और microdevices और एक बड़े fabricating के लिए तकनीक की आवश्यकता है नमूना मात्रा (कम से कम कुछ मिलीलीटर) ट्यूब प्रवाह करने के लिए.

इस प्रोटोकॉल में, जीवाणु कोशिकाओं वाले जीव ी प्राप्त करने के लिए तेल-जल इंटरफ़ेस की स्थिरता महत्वपूर्ण है (चित्र1ख (vii)। कई जीवी प्राप्त करने के लिए, यह तेल पानी इंटरफ़ेस समतल करने के लिए आवश्यक है. इसलिए, तेल चरण की उचित तैयारी आवश्यक है। हम एक उच्च शक्ति अल्ट्रासोनिक स्नान (120 डब्ल्यू) में कम से कम 1 एच के लिए तेल चरण sonicated पूरी तरह से लिपिड अणुओं भंग करने के लिए। sonication के तुरंत बाद बाहरी जलीय समाधान पर तेल चरण परत करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्र 1b (vii)।

यहाँ वर्णित विधि की दो सीमाएँ हैं. सबसे पहले, जीवी अक्सर तोड़ और जीवाणु कोशिकाओं बाहरी जलीय समाधान में रिसाव. इसका कारण यह है कि जीवी गठन के दौरान, कुछ W/O बूंदें तेल-पानी इंटरफ़ेस के माध्यम से स्थानांतरित नहीं कर सकती हैं और टूट जाती हैं। यह अपरिहार्य है जब छोटी बूंद हस्तांतरण विधि20का उपयोग कर . साथ ही, GVs अवलोकन के दौरान टूट सकता है। GVs की स्थिरता में सुधार किया जाना चाहिए, जैसे कि GVs25को स्थिर करने वाले कृत्रिम साइटोस्केलेटन का उपयोग करके. दूसरा, encapsulated जीवाणु कोशिकाओं की संख्या पूरी तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है. चित्र 4 से पता चलता है कि जीवाणु कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या GVs में encapsulated थे, और इसलिए, यह छोटी बूंद हस्तांतरण विधि का उपयोग कर GVs में जीवाणु कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. सेल नंबर को नियंत्रित करने के लिए, microfluidics प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया जा सकता है.

जीवी अन्य सामग्रियों की तुलना में अपने आंतरिक जलीय समाधान को अधिक प्रभावी ढंग से नियंत्रित कर सकते हैं (जेल बूंदें12,13 या W/O बूंदें5,11) . उदाहरण के लिए, GVs के आंतरिक और बाहरी समाधानों की जलीय स्थितियों को प्राकृतिक झिल्ली पारगम्यता26 या पारगम्यता द्वारा परिवर्तित किया जाता है जो झिल्ली के छिद्र16 या ट्रांसपोर्टर27द्वारा सुविधाजनक होती है। वर्तमान विधि में तेल अणु (इस स्थिति में खनिज तेल) झिल्ली20में बने रहे। जीवाणु विकास के लिए पोषक तत्वों या ऑक्सीजन की पारगम्यता पर झिल्ली में शेष तेल का प्रभाव अज्ञात है। यद्यपि हम पोषक तत्वों या ऑक्सीजन की प्राकृतिक झिल्ली पारगम्यता नहीं जानते हैं, हम मानते हैं कि विकास माध्यम में पोषक तत्वों या ऑक्सीजन की मात्रा वर्तमान अध्ययन में जीवाणु वृद्धि के लिए पर्याप्त थी। पोषक तत्वों या ऑक्सीजन की प्राकृतिक झिल्ली पारगम्यता जीवाणु कोशिका के विकास के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और भविष्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण विषय है. पारगम्यता को नियंत्रित करने की तकनीक जेल की बूंदों के साथ संस्कृति पद्धतिका उपयोग करके नहीं की जा सकती12,13 या डब्ल्यू / जीवी इस प्रकार एक सीमित स्थान में जीवाणु संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए पहली पसंद बन जाएगा.

हमारे जीवाणु संस्कृति विधि एक संभावित नई अवधारणा और सूक्ष्म जीव विज्ञान में उपकरणहै 19 प्राप्त करने या उनके चयापचय उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए अज्ञात पर्यावरण बैक्टीरिया संस्कृति के लिए. इसके अलावा, हमारे जीवाणु सेल युक्त जीवी एक कृत्रिम सेल मॉडल (जीवीएस) और एक जीवित कोशिका (बैक्टीरियल सेल) की एक संकर प्रणाली है जो जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक नया उपकरण बनाने के लिए28 और नीचे-अप सिंथेटिक बायोलॉजी29है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (MEXT) मंत्रालय से उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं (लीडर, नंबर 16812285) के लिए एक अग्रणी पहल द्वारा समर्थित किया गया था, युवा वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक अनुदान में सहायता (नहीं 18K18157, 16K21034) जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) से एम.एम., और MEXT से K.K. (No. 17H06417, 17H06413) तक अनुदान-इन-एड।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

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References

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Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

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