Summary
Vi demonstrerer én cellekultur av bakterier inne gigantiske blemmer (GVs). GVs inneholdende bakterielle celler ble utarbeidet av dråpe overføringsmetoden og ble immobilisert på en støttet membran på et glass substrat for direkte observasjon av bakteriell vekst. Denne tilnærmingen kan også tilpasses andre celler.
Abstract
Vi utviklet en metode for å dyrking bakterieceller på enkelt cellenivå inne gigantiske blemmer (GVs). Bakteriell cellekultur er viktig for å forstå funksjonen av bakterielle celler i det naturlige miljøet. På grunn av teknologiske fremskritt, kan ulike bakterielle celle funksjoner bli avslørt på enkelt cellenivå inne i et trangt sted. GVs er sfæriske mikro-sized avdelinger bestående av amfifile lipid molekyler og kan holde ulike materialer, inkludert celler. I denne studien, en enkelt bakteriell celle ble innkapslet i 10-30 μm GVs av dråpe overføringsmetoden og GVs inneholder bakterielle celler ble immobilisert på en støttet membran på et glass substrat. Vår metode er nyttig for å observere sann tids veksten av enkelt bakterier inne i GVs. Vi kultivert Escherichia coli (E. coli) celler som en modell inni GVs, men denne metoden kan tilpasses andre celletyper. Vår metode kan brukes i vitenskap og industrielle felt av mikrobiologi, biologi, bioteknologi og syntetisk biologi.
Introduction
Kulturen av bakterielle celler på ett cellenivå har fått økende oppmerksomhet. Dyrking bakterieceller på enkelt cellenivå inne i et trangt sted kan belyse bakterie funksjoner som fenotypiske variasjon1,2,3,4, celle adferd5, 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9, og antibiotikaresistens10,11. På grunn av nylige fremskritt innen kultur teknikker, kan kulturen i enkelt bakterier oppnås inne i et trangt sted, for eksempel i en brønn-chip4,7,8, gel dråpe12,13 og vann-i-olje (W/O) dråpe5,11. For å fremme forståelse eller utnyttelse av enkelt bakterielle celler, er ytterligere tekniske utviklingen av dyrking teknikker nødvendig.
Blemmer som etterligner den biologiske cellemembranen er sfæriske avdelinger bestående av amfifile molekyler og kan holde ulike materialer. Blemmer er klassifisert i henhold til størrelse og inkluderer små blemmer (SVs, diameter < 100 NM), store blemmer (LVs, < 1 μm), og gigantiske blemmer (GVs, > 1 μm). SVs eller LVs brukes ofte som legemiddel bærere på grunn av deres affinitet til den biologiske cellemembranen14. GVs har også blitt brukt som en reaktor system for bygging av protocells15 eller kunstige-celler16. Innkapsling av biologiske celler i GVs har blitt rapportert17,18, og dermed GVs vise potensial som en cellekultur system kombinert med reaktoren systemet.
Her, sammen med en video av eksperimentelle prosedyrer, beskriver vi hvordan GVs kan brukes som romanen celle-kultur fartøy19. GVs inneholdende bakterier ble gjort av dråpe overføringsmetoden20 og ble deretter immobilisert på en støttet membran på et dekkglass. Vi brukte dette systemet til å observere bakteriell vekst på single-cellenivå inne GVs i sanntid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av GVs som inneholder bakterielle celler av dråpe overføringsmetoden
- Forbered lipid lager løsninger på 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) og 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleneglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) i kloroform/ løsningen (2/1, v/v) og lagre aksjen ved-20 ° c.
- Fremstilling av en lipid-inneholdende olje løsning
- Hell 20 μL av POPC-løsningen og 4 μL av biotin-PEG-DSPE-løsningen i et glass rør (figur 1B (i)).
- Fordamper det organiske oppløsningsmidlet med luftstrøm for å danne en lipid-film og plassere filmen i en desikator for 1 time for å fordampe helt den organiske væsken (figur 1B (II)).
Merk: Det er nødvendig å fordampe det organiske oppløsningsmidlet i en avtrekksvifte. - Tilsett 200 μL av mineralolje (0,84 g/mL, Material tabell) på glass flasken (figur 1B (III)).
- Pakk åpningen del av hetteglasset med film og sonikere det i et ultralydbad (120 W) i minst 1 time (figur 1B (III)). De endelige konsentrasjonene av POPC og biotin-PEG-DSPE er henholdsvis 1 mM og 0,002 mM.
- Pre-kulturen i bakterielle celler
- Vaksinere E. coli til 1x lb medium (1 g gjærekstrakt, 2 g bacto tryptone, og 2 g natriumklorid i 200 ml deionisert vann) fra en lb plate og ruge ved 37 ° c for 12 – 14 h (over natten).
- Etter inkubasjons, samle 20 μL av kultur løsning og overføre til 1,98 mL frisk 1x LB medium, og kultur cellene igjen for 2 t.
- Sjekk den optiske tettheten ved 600 NM (OD600) verdi av pre-kultur løsning (utarbeidet i trinn 1.3.2). En pre-kultur løsning av OD600 = 1,0-1.5 bør brukes.
- Utarbeidelse av de ytre og indre vandige løsninger av GVs
- Oppløse glukose i 1x LB medium for å forberede en ytre vandig løsning av GVs. Forbered 20 mL av en lager glukoseoppløsning (500 mM).
- Fortynne lager glukoseoppløsning med 1x LB medium til 200 mM (tabell 1).
- Oppløse sukrose i 1x LB medium for å forberede en indre vandig løsning av GVs. Forbered 20 mL av en lager sukrose løsning (500 mM).
- Bland den pre-kultur løsning (OD600 = 1,0 – 1.5), sukrose løsning (500 mm), og 1x lb medium (tabell 1). Den endelige OD600 verdi av kulturen løsningen skal være 0,01-0.015 og den endelige sukrose konsentrasjonen skal være 200 mm.
Merk: Pass på å unngå osmotisk trykk. Det er nødvendig å balansere konsentrasjonen mellom indre og ytre vandig løsning.
- Tilberedning av vann-i-olje (W/O) dråper som inneholder bakterielle celler
- Tilsett 2 μL av den indre vandige oppløsningen til GVs (fremstilt i trinn 1.4.4) til 50 μL av olje oppløsningen som inneholder lipider (mineralolje med POPC og biotin-PEG-DSPE) i et 0,6 mL lidded plast rør (figur 1B (IV)).
- Emulgere de to komponentene i plast slangen ved å trykke på røret for hånd (figur 1B (v)).
- Dannelse av GVs som inneholder bakterieceller
- Tilsett 50 μL av den ytre vandige oppløsningen av GVs (fremstilt i trinn 1.4.2) i et 1,5 mL lidded plast rør (figur 1B (vi)) og forsiktig lag 150 μL av olje oppløsningen som inneholder lipider (mineralolje med POPC og BIOTIN-Peg-DSPE) på overflaten av den ytre vandige oppløsning (figur 1B (VII)). Ruge denne prøven ved romtemperatur (RT, 25 ° c) i 10 – 15 min. Kontroller at grensesnittet til olje-og vandige oppløsninger er flatt.
- Tilsett 50 μL av W/O dråpe oppløsning (fremstilt i trinn 1.5.2) på grensesnittet av oljen og vandig oppløsning ved hjelp av en pipette (figur 1B (VIII)).
- Sentrifuger 1,5 mL lidded plast rør (fra trinn 1.6.2) i 10 min ved 1 600 x g ved RT i en stasjonær sentrifuge (figur 1B (IX)). Etter sentrifugering, aspirer oljen (øverste laget) fra 1,5-mL lidded plastrør ved hjelp av en pipette, og samle GVs inneholder bakterielle celler (figur 1B (x)).
2. utarbeidelse av en GV observasjon system (bakteriell Cell kultur system)
-
Utarbeidelse av små blemmer (SVS) for oppbygningen ng en støttet bilayer membran
- Hell 20 μL av POPC-løsningen og 4 μL av biotin-PEG-DSPE-løsningen i et glass rør (ved hjelp av samme lipid-sammensetning som brukes til GV-forberedelse i trinn 1,1).
- Fordampe den organiske løsemiddel med luftstrøm for å danne en lipid film og plassere denne prøven i en desikator for 1 t for å helt fordampe den organiske løsemiddel.
- Tilsett 200 μL av 200 mM glukose i 1x LB medium (den ytre vandige oppløsning av GVs) til hetteglasset.
- Pakk åpningen del av hetteglasset med film og sonikere det i et ultralydbad (120 W) i minst 1 time.
- Forbered SVs ved ekstrudering metoden21 ved hjelp av en mini-Ekstruder og polykarbonat membran med 100 NM pore størrelse.
-
Utarbeidelse av en håndlaget kammer
- Bor en 7 mm hull med en hul punch på en dobbel-ansikt tetning (10 mm x 10 mm x 1 mm).
- Lim inn den doble forseglingen med hullet på et deksel glass (30 mm x 40 mm, tykkelse 0,25 – 0.35 mm).
-
Utarbeidelse av en støttet bilayer membran på dekselet glass i hullet i kammeret
- Tilsett 30 μL av SV-løsningen på hullet i kammeret (fremstilt i avsnitt 2,2) og ruge ved RT i 30 minutter.
- Vask forsiktig hullet to ganger med 20 μL av 1x LB medium inneholdende 200 mM glukose (den ytre vandige oppløsning av GVs) ved pipettering.
-
Immobilisering av GVs på støttet bilayer membran på dekselet glass i hullet i kammeret
- Introduser 10 μL neutravidin med den ytre vandige oppløsningen av GVs (1 mg/mL) inn i hullet og ruge ved RT i 15 minutter.
- Vask forsiktig hullet to ganger med 20 μL av 1x LB medium inneholdende 200 mM glukose (den ytre vandige oppløsning av GVs) ved pipettering.
- Legg til alle løsninger som inneholder GVs (fremstilt i trinn 1.6.3) inn i hullet i kammeret og forsegle med et deksel glass (18 mm x 18 mm, tykkelse 0.13 – 0.17 mm) (figur 2b).
-
Mikroskopisk observasjon av bakterie cellevekst i GVs
- Sett et mikroskopisk oppvarmingssystem med et invertert mikroskop utstyrt med et objektiv objektiv med 40x/0,6 numerisk blenderåpning (NA) med lang arbeidsavstand (figur 2b).
- Plasser kammeret på den mikroskopiske varme scene systemet (figur 2b). Ruge GVs som inneholder bakterieceller i kammeret ved en statisk tilstand for 6 timer ved 37 ° c.
- Fange og fortegnelse mikroskop profilen av bakteriell cellen oppblomstringen innenfor GVs enhver 30 min av benytter en naturvitenskapelig komplementær metallisk oksid halvleder (sCMOS) kameraet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en enkel metode for å generere GVs som inneholder enkelt bakterielle celler ved hjelp av dråpe overføringsmetoden (figur 1). Figur 1a viser et skjematisk bilde av nedbøren i GVs som inneholder bakterier. W/O dråper som inneholder bakterier er overført over olje-vann (lipid monolag) grensesnitt ved sentrifugering å danne GVs. Forskjellen i tetthet mellom sukrose (indre vandig løsning) og glukose (ytre vandig løsning) også bistår kryssing av olje-vann-grensesnittet i W/O dråper. Det er nødvendig å overvåke osmotisk trykket i indre og ytre vandig løsning fordi en liten forskjell i konsentrasjon mellom disse løsningene kan indusere deformasjon og kollaps av GVs. En Flow diagram for å forberede GVs som inneholder bakterielle celler av dråpe overføringsmetoden er vist i figur 1B. Ved å følge denne prosedyren, kan GVs som inneholder enkelt bakterielle celler lett fås.
For å observere bakterie cellevekst innenfor GVs, ble et originalt kultur system konstruert for mikroskopisk observasjon (figur 2). GVs inneholdende bakterier ble immobilisert på en støttet membran overflate belagt med neutravidin på et deksel glass (figur 2a). Denne immobilisering teknikken har aktivert forlenget observasjon av GVs.
Typiske fase-kontrast mikroskopi bilder av de forskjellige størrelse GVs som inneholder enkelt bakterielle celler er vist i Figur 3. I dette eksperimentet har vi også fått GVs som inneholder bakterielle celler med størrelser fra 10 μm til 30 μm. Figur 3 viser bakteriell vekst på enkelt cellenivå inne i GVs med forskjellige størrelser 10,7 μm (Figur 3a) og 28 μm (Figur 3b). For begge størrelsene av GVs, E. coli celler gjennomgikk forlengelse og divisjon prosesser, med en eller to E. coli celler vokser til et svært stort antall celler over 6 h. Dermed vokste E. coli celler stabilt inne i GVs.
Den relative frekvensen av GVs som inneholder et gitt antall bakterieceller, vises i Figur 4. I vår eksperimentelle tilstand (OD600 = 0.01-0.015), bakterielle celler ble innkapslet på enkelt cellenivå i ca 10% av de oppnådde GVs (tom GVs var ca 80%). Den GVs innkapslet på enkelt cellenivå var ca 50% av GVs inneholder bakterielle celler, som anslått fra innfelt i Figur 4.
Figur 1: eksperimentelle prosedyrer for GVs som inneholder bakterier. (a) ordningen med GVs som inneholder bakterier fremstilt ved en dråpe overføringsmetode. W/O microdroplets inneholder bakterier passere en lipid monolag grensesnitt ved sentrifugalkraft og deretter danne en lipid bilayer membran. (b) flyt av syntesen av GVs som inneholder bakterier. (i) organisk løsemiddel som inneholder lipider (POPC og biotin-PEG-DSPE, 100:0.2 molar ratio). (II) lipid film på bunnen av hetteglasset. (III) olje løsning som inneholder lipider. (IV) blanding av 50 μL av oljeoppløsning og 2 μL av indre vandig oppløsning (200 mM sukrose og 1x LB medium) som inneholder bakterielle celler. (v) emulgering for hånd tapping (over 50 ganger). (vi) 50 μL av den ytre vandige oppløsningen (200 mM glukose i 1x LB medium). (VII) lagdeling på 150 μL av olje løsning på den ytre vandige oppløsningen. (VIII) lagdeling av W/O dråpe løsningen. (IX) sentrifugering av slangen. (x) igangsatte GVs som inneholder bakterieceller etter aspirasjon av oljen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: o bservation system av bakteriell cellekultur inne GVs. (a) GVs er immobilisert på en støttet membran gjennom biotin – neutravidin binding på dekkglasset. GVs er inkubert av et varmesystem. (b) bilde av observasjonssystemet, inkludert en håndlaget kammer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: fase kontrast mikroskop bilder av GVs som inneholder enkelt bakterieceller (indikert med svarte piler). Snap-shots av bakteriell cellevekst i forskjellig størrelse GVs. (a) vesicle størrelse = 10,7 μm. (b) vesicle størrelse = 28 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: statistisk analyse av antall innkapslet bakterieceller per GV. De relative frekvensene til GVs ble plottet som histogrammer. Innfelt: forstørrelse av de relative frekvensene av GVs som inneholder bakterieceller fra enkelt til 10 < celler. Totalt 235 GVs ble analysert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ytre vandig løsning | Indre vandig løsning | Endelige | |
| 500 mM glukose med LB medium | 200 μL | – | 200 mM |
| 500 mM sukrose med LB medium | – | 200 μL | 200 mM |
| 1x LB medium | 300 μL | 295 μL | – |
| Pre-kultur løsning (OD600 = 1,0 – 1.5) | – | 5 μL | OD600 = 0,01-0.015 |
| Totalt volum | 500 μL | 500 μL |
Tabell 1: sammensetningen og volumene av de ytre og indre vandige løsninger av GVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en metode for dyrking av bakterieceller på enkelt cellenivå inne i GVs. Denne enkle metoden innebærer forming GVs inneholder bakterielle celler på enkelt cellenivå ved hjelp av dråpe overføringsmetoden. Sammenlignet med andre tilnærminger for å skaffe GVs som inneholder bakterieceller, har denne metoden to fordeler: (i) det er lett å utvikle seg, og (II) et lite volum (2 μL) av prøve løsningen er nødvendig for å klargjøre GVs. Dråpe overføringsmetoden20 for fremstilling av GVs som inneholder bakterieceller, er enklere enn den klassiske hydration22 og materialer metoder17. For eksempel er den klassiske hydration metoden22 en enkel og enkel metode for å forberede GVs, men innkapsling effektiviteten av materialer i GVs er ganske lav og minst et par hundre mikroliter av prøven er nødvendig. Den nylig utviklede cellulose papir-abetted hydration23 og gel-assistert hydration24 metoder for å lage GVs har en høy innkapsling effektivitet av biomolekyler sammenlignet med den klassiske hydration metode22. Deres innkapsling effektivitet er så høy som for dråpe overførings teknikk, og det er forventet at disse to metodene kan tillate innkapsling av celler inne GVs. Videre materialer metoden17 nøyaktig omslutter enkeltceller inne i GVs og viser en meget høy innkapsling effektiviteten av materialer i GVs men krever komplisert håndtering og teknikker for fabrikere microdevices og en stor prøvevolum (minst et par milliliter) for å strømme røret.
I denne protokollen er stabiliteten i olje-vann-grensesnittet viktig for å oppnå GVs som inneholder bakterieceller (figur 1B (VII)). For å få mange GVs, er det viktig å flate ut olje-vann-grensesnittet. Derfor er riktig utarbeidelse av oljefasen nødvendig. Vi sonikert oljefasen i minst 1 time i et ultralydbad med høy effekt (120 W) for å fullstendig oppløse lipid molekylene. Det er viktig å lag oljefasen på den ytre vandige løsningen umiddelbart etter sonikering (figur 1B (VII)).
Metoden som beskrives her, har to begrensninger. Først GVs ofte bryte og bakterielle celler lekke inn i ytre vandig løsning. Dette er fordi under GV-formasjonen, kan noen W/O dråper ikke overføre gjennom olje-vann-grensesnittet og bli sprukket. Dette er uunngåelig når du bruker metoden for dråpeoverføring20. I tillegg kan GVs bryte under observasjon. Stabiliteten til GVs må forbedres, for eksempel ved å bruke en kunstig cytoskeleton som stabiliserer GVs25. For det andre, antall innkapslet bakterielle celler kan ikke være perfekt kontrollert. Figur 4 viser at et stort antall bakterieceller ble innkapslet i GVs, og derfor er det vanskelig å kontrollere antall bakterielle celler i GVs ved hjelp av dråpe overføringsmetoden. For å kontrollere celle nummeret, kan materialer teknologi brukes.
GVs kan kontrollere sin indre vandig løsning mer effektivt enn andre materialer (gel dråper12,13 eller W/O dråper5,11). For eksempel er de vandige forholdene i indre og ytre løsninger av GVs endres ved naturlig membran permeabilitet26 eller permeabilitet tilrettelagt av en membran pore16 eller transporter27. I denne metoden forble olje molekyler (mineralolje i dette tilfellet) i membranen20. Innflytelsen av oljen igjen i membranen på permeabilitet av næringsstoffer eller oksygen for bakteriell vekst er ukjent. Selv om vi ikke vet den naturlige membranen permeabilitet av næringsstoffer eller oksygen, anser vi at mengden av næringsstoffer eller oksygen i vekstmedium var tilstrekkelig for bakteriell vekst i den foreliggende studien. Den naturlige membran permeabilitet av næringsstoffer eller oksygen er svært viktig for bakteriell cellevekst og er et viktig tema for fremtidig studie. Teknikken for å kontrollere permeabilitet kan ikke utføres ved hjelp av kultur metoden med gel dråper12,13 eller W/O dråper5,11. GVs vil dermed bli det første valget for bakteriekultur applikasjoner i et trangt sted.
Vår bakteriell kultur metoden er et potensielt nytt konsept og verktøy i mikrobiologi19 til kultur ukjente miljømessige bakterier for å skaffe eller analysere sine metabolske produkter. Videre vår bakteriell celle-inneholder GVs er en hybrid system av en kunstig celle modell (GVs) og en levende celle (bakterielle celler) for å lage et nytt verktøy for bioteknologi28 og bottom-up syntetisk biologi29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en ledende initiativ for Excellent unge forskere (LEADER, no. 16812285) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan, en Grant-in-Aid for unge forsker forskning (nr. 18K18157, 16K21034) fra Japan Society for fremme av Science (JSP) til M.M., og Grant-in-Aid fra MEXT til K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al.
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al.
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L.
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
