Summary
Demostramos el cultivo monocelular de bacterias dentro de vesículas gigantes (GV). Los GV que contenían células bacterianas fueron preparados por el método de transferencia de gotas y fueron inmovilizados sobre una membrana apoyada sobre un sustrato de vidrio para la observación directa del crecimiento bacteriano. Este enfoque también puede ser adaptable a otras células.
Abstract
Desarrollamos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes (GV). El cultivo celular bacteriano es importante para entender la función de las células bacterianas en el medio natural. Debido a los avances tecnológicos, varias funciones celulares bacterianas se pueden revelar a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado. Los GV son compartimentos esféricos de tamaño micro compuesto por moléculas de lípidos anfifílicos y pueden contener diversos materiales, incluidas las células. En este estudio, una sola célula bacteriana fue encapsulada en 10-30 m de GV por el método de transferencia de gotas y los GV que contienen células bacterianas fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un sustrato de vidrio. Nuestro método es útil para observar el crecimiento en tiempo real de bacterias individuales dentro de los GV. Cultivamos células escherichia coli (E. coli) como modelo dentro de los GV, pero este método se puede adaptar a otros tipos de células. Nuestro método se puede utilizar en los campos científico e industrial de la microbiología, la biología, la biotecnología y la biología sintética.
Introduction
El cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula ha recibido cada vez más atención. Cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado puede dilucidar funciones bacterianas como la variabilidad fenotípica1,2,3,4, comportamiento celular5, 6 , 7 , 8 , 9, y resistencia a los antibióticos10,11. Debido a los recientes avances en las técnicas de cultivo, el cultivo de bacterias individuales se puede lograr dentro de un espacio confinado, como en un bien-chip4,7,8, gota de gel12,13 , y gota de agua en aceite (W/O)5,11. Para promover la comprensión o la utilización de células bacterianas individuales, se necesitan desarrollos técnicos adicionales de las técnicas de cultivo.
Las vesículas que imitan la membrana celular biológica son compartimentos esféricos que consisten en moléculas anfifílicas y pueden contener diversos materiales. Las vesículas se clasifican según el tamaño e incluyen vesículas pequeñas (SVs, diámetro < 100 nm), vesículas grandes (LV, <1 m) y vesículas gigantes (GV, >1 m). SVs o LV se utilizan comúnmente como portadores de drogas debido a su afinidad con la membrana celular biológica14. Los GV también se han utilizado como sistema de reactores para la construcción de protocélulas15 o células artificiales16. La encapsulación de células biológicas en GV se ha reportado17,18, y por lo tanto los GV muestran potencial como un sistema de cultivo celular cuando se combina con el sistema del reactor.
Aquí, junto con un video de procedimientos experimentales, describimos cómo los GV pueden ser utilizados como nuevos buques de cultivo celular19. Los GV que contenían bacterias fueron fabricados por el método de transferencia de gotas20 y luego fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un vidrio de cubierta. Utilizamos este sistema para observar el crecimiento bacteriano a nivel de una sola célula dentro de los GV en tiempo real.
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Protocol
1. Preparación de LOS GV que contienen células bacterianas por el método de transferencia de gotas
- Preparar soluciones de stock de lípidos de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) y 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en cloroformo/ metanol (2/1, v/v) y almacene el stock a -20 oC.
- Preparación de una solución de aceite que contenga lípidos
- Vierta 20 ml de la solución POPC y 4 l de la solución biotina-PEG-DSPE en un tubo de vidrio (Figura1b (i)).
- Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire para formar una película lipídica y colocar la película en un desecador durante 1 h para evaporar completamente el disolvente orgánico (Figura1b (ii)).
NOTA: Es necesario evaporar el disolvente orgánico en una campana de humo. - Añadir 200 l de aceite mineral (0,84 g/ml, tabla de materiales)al vial de vidrio (Figura1b (iii)).
- Envuelva la parte inicial del vial de vidrio con película y sonicarla en un baño ultrasónico (120 W) durante al menos 1 h (Figura1b (iii)). Las concentraciones finales de POPC y biotina-PEG-DSPE son de 1 mM y 0,002 mM, respectivamente.
- Precultivo de células bacterianas
- Inocular E. coli en 1x medio LB (1 g de extracto de levadura, 2 g de bacto triptona y 2 g de cloruro de sodio en 200 ml de agua desionizada) de una placa LB e incubar a 37 oC durante 12-14 h (durante la noche).
- Después de la incubación, recoger 20 l de la solución de cultivo y transferir a 1,98 ml de medio fresco 1x LB, y volver a cultivar las células durante 2 h.
- Compruebe la densidad óptica en el valor de 600 nm (OD600) de la solución de precultivo (preparada en el paso 1.3.2). Se debe utilizar una solución precultal de600 OD a 1,0–1,5.
- Preparación de las soluciones acuosas externas e internas de los GV
- Disolver la glucosa en un medio de 1x LB para preparar una solución acuosa externa de GV. Prepare 20 mL de una solución de glucosa en stock (500 mM).
- Diluir la solución de glucosa en stock con 1x LB medio a 200 mM (Tabla1).
- Disolver la sacarosa en un medio de 1x LB para preparar una solución acuosa interna de GV. Prepare 20 ml de una solución de sacarosa en stock (500 mM).
- Mezclar la solución de precultivo (OD600 a 1,0–1,5), la solución de sacarosa (500 mM) y el medio 1x LB (Tabla1). El valor final de oD600 de la solución de cultivo debe ser 0,01–0,015 y la concentración final de sacarosa debe ser de 200 mM.
NOTA: Tenga cuidado de evitar la presión osmótica. Es necesario equilibrar la concentración entre la solución acuosa interna y externa.
- Preparación de gotas de agua en aceite (W/O) que contienen células bacterianas
- Añadir 2 l de la solución acuosa interna de los GV (preparadoen en el paso 1.4.4) a 50 l de la solución de aceite que contiene lípidos (aceite mineral con POPC y biotina-PEG-DSPE) en un tubo de plástico tapado de 0,6 ml (Figura1b (iv)).
- Emulsionar los dos componentes en el tubo de plástico tocando el tubo a mano (Figura1b (v)).
- Formación de GV que contienen células bacterianas
- Añadir 50 ml de la solución acuosa externa de los GV (preparado en el paso 1.4.2) en un tubo de plástico tapado de 1,5 ml (Figura1b (vi)) y colocar suavemente 150 ml de la solución de aceite que contiene lípidos (aceite mineral con POPC y biotina-PEG-DSPE) en la superficie del acuoso externo solución (Figura1b (vii)). Incubar esta muestra a temperatura ambiente (RT, 25 oC) durante 10-15 min. Compruebe que la interfaz del aceite y las soluciones acuosas sea plana.
- Añadir 50 l de la solución de gotas para rinuofencias (preparada en el paso 1.5.2) en la interfaz del aceite y la solución acuosa utilizando una pipeta (Figura1b (viii)).
- Centrifugar el tubo de plástico tapado de 1,5 ml (del paso 1.6.2) durante 10 min a 1.600 x g a RT en una centrífuga de escritorio (Figura1b (ix)). Después de la centrifugación, aspirar el aceite (capa superior) del tubo de plástico tapado de 1,5 ml utilizando una pipeta, y recoger los GV que contienen células bacterianas (Figura1b (x)).
2. Preparación de un sistema de observación GV (Sistema de cultivo celular de bacterias)
-
Preparación de pequeñas vesículas (SVs) para constructi ng un membrana bicapa apoyada
- Vierta 20 ml de la solución POPC y 4 l de la solución biotina-PEG-DSPE en un tubo de vidrio (utilizando la misma composición lipídica utilizada para la preparación de GV en el paso 1.1).
- Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire para formar una película lipídica y colocar esta muestra en un desecador durante 1 h para evaporar completamente el disolvente orgánico.
- Añadir 200 ml de glucosa de 200 mM en un medio de 1x LB (la solución acuosa externa de GV) al vial de vidrio.
- Envuelva la parte inicial del vial de vidrio con película y sonicarla en un baño ultrasónico (120 W) durante al menos 1 h.
- Prepare SVs por el método de extrusión21 utilizando una membrana miniextrusora y policarbonato con tamaño de poro de 100 nm.
-
Preparación de una cámara hecha a mano
- Taladre un orificio de 7 mm con un punzón hueco en un sello de doble cara (10 mm x 10 mm x 1 mm).
- Pegue el sello de doble cara con el orificio en un vidrio de cubierta (30 mm x 40 mm, espesor 0,25-0,35 mm).
-
Preparación de una membrana bicapa apoyada en el vidrio de la cubierta en el orificio de la cámara
- Añadir 30 l de la solución SV al orificio de la cámara (preparado en la sección 2.2) e incubar a RT durante 30 min.
- Lave suavemente el orificio dos veces con 20 ml de medio de 1lb que contiene 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.
-
Inmovilización de los GV en el membrana bicapa apoyada en el vidrio de la cubierta en el agujero de la cámara
- Introducir 10 ml de neutravidina con la solución acuosa externa de GV (1 mg/ml) en el orificio e incubar a RT durante 15 min.
- Lave suavemente el orificio dos veces con 20 ml de medio de 1lb que contiene 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.
- Añadir toda la solución que contenga GV (preparado en el paso 1.6.3) en el orificio de la cámara y sellar con un vidrio de cubierta (18 mm x 18 mm, espesor 0,13–0,17 mm) (Figura2b).
-
Observación microscópica del crecimiento celular bacteriano dentro de los GV
- Establecer un sistema de etapa de calentamiento microscópico con un microscopio invertido equipado con una lente objetivo de apertura numérica (NA) de 40x/0.6 con una larga distancia de trabajo (Figura2b).
- Coloque la cámara en el sistema de etapa de calentamiento microscópico (Figura2b). Incubar los GV que contienen células bacterianas en la cámara a una condición estática durante 6 h a 37 oC.
- Capture y grabe imágenes de microscopio sin crecimiento celular bacteriano dentro de los GV cada 30 minutos mediante el uso de una cámara científica complementaria complementaria de semiconductores de óxido metálico (sCMOS).
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Representative Results
Presentamos un método sencillo para generar GV que contengan células bacterianas individuales utilizando el método de transferencia de gotas (Figura 1). La Figura 1a muestra una imagen esquemática de la precipitación de los GV que contienen bacterias. Las gotas W/O que contienen bacterias se transfieren a través de la interfaz de agua de aceite (monocapa lipídica) por centrifugación para formar GV. La diferencia de densidad entre la sacarosa (solución acuosa interna) y la glucosa (solución acuosa externa) también ayuda al cruce de la interfaz aceite-agua de las gotas W/O. Es necesario controlar la presión osmótica en la solución acuosa interna y externa porque una ligera diferencia en la concentración entre estas soluciones puede inducir la deformación y el colapso de los GV. En la Figura 1bse muestra un diagrama de flujo para preparar los GV que contienen células bacterianas mediante el método de transferencia de gotas. Siguiendo este procedimiento, los GV que contienen células bacterianas individuales se pueden obtener fácilmente.
Para observar el crecimiento celular bacteriano dentro de los GV, se construyó un sistema de cultivo original para la observación microscópica (Figura2). Los GV que contenían bacterias fueron inmovilizados sobre una superficie de membrana apoyada recubierta con neutravidina en un cristal de cubierta (Figura2a). Esta técnica de inmovilización ha permitido la observación prolongada de los GV.
Las imágenes típicas de microscopía de contraste de fase de los CV de diferentes tamaños que contienen células bacterianas individuales se muestran en la Figura3. En este experimento, también obtuvimos PV que contienen células bacterianas con tamaños que van desde 10 m a 30 m. La Figura 3 muestra el crecimiento bacteriano a nivel de una sola célula dentro de los GV con diferentes tamaños de 10,7 m (Figura3a ) y 28 m (Figura3b). Para ambos tamaños de GV, las células de E. coli se sometieron a procesos de elongación y división, con una o dos células de E. coli creciendo a un número muy grande de células durante 6 horas. Por lo tanto, las células de E. coli crecieron establemente dentro de los GV.
La frecuencia relativa de los GV que contienen un número determinado de células bacterianas se muestra en la Figura4. En nuestra condición experimental (OD600 a 0,01–0,015), las células bacterianas se encapsularon a nivel de célula única en aproximadamente el 10% de los GV obtenidos (los GV vacíos fueron aproximadamente el 80%). Los GV encapsulados a nivel de célula única fueron aproximadamente el 50% de los GV que contienen células bacterianas, según se estima a partir de la aparición de la Figura4.
Figura 1: Procedimientos experimentales de los GV que contienen bacterias. (a) Esquema de los GV que contienen bacterias preparadas mediante un método de transferencia de gotas. Las microgotas W/O que contienen bacterias pasan a través de una interfaz monocapa lipídica por fuerza centrífuga y luego forman una membrana bicapa lipídica. (b) Flujo de la síntesis de GV que contienen bacterias. (i) Disolvente orgánico que contiene lípidos (POPC y biotina-PEG-DSPE, relación molar 100:0.2). (ii) Película de lípidos en la parte inferior del vial de vidrio. (iii) Solución de aceite que contiene lípidos. (iv) Mezcla de 50 ml de solución de aceite y 2 ml de solución acuosa interna (200 mM de sacarosa y 1x medio LB) que contiene células bacterianas. (v) Emulsificación pulsando a mano (más de 50 veces). (vi) 50 l de la solución acuosa externa (200 mM de glucosa en medio 1x LB). (vii) Capas de 150 l de solución de aceite en la solución acuosa externa. (viii) Capas de la solución de gotas para w/O. (ix) Centrifugación del tubo. (x) GV precipitados que contienen células bacterianas después de la aspiración del aceite. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La o sistema de servación del cultivo celular bacteriano dentro de los GV. (a) Los GV se inmovilizan en una membrana apoyada a través de la unión biotina-neutravidina en el cristal de la cubierta. Los REPRODUCTORes de agua son incubados por un sistema de calefacción. (b) Imagen del sistema de observación incluyendo una cámara hecha a mano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes del microscopio de contraste de fase de los GV que contienen células de bacterias individuales (indicadas por las flechas negras). Snap-shots de crecimiento celular bacteriano dentrode GM de diferentes tamaños. ( a ) Tamaño de vesícula a 10,7 m. (b) Tamaño de la vesícula a 28 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis estadístico del número de células bacterianas encapsuladas por GV. Las frecuencias relativas de los GV se trazaron como histogramas. Inset: Ampliación de las frecuencias relativas de los GV que contienen células bacterianas de células simples a 10<. Se analizaron un total de 235 GV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución acuosa externa | Solución acuosa interna | Final | |
| 500 mM Glucosa con medio LB | 200 l | – | 200 mM |
| Sacarosa de 500 mM con medio LB | – | 200 l | 200 mM |
| 1x medio LB | 300 l | 295 l | – |
| Solución de precultura (OD600 a 1,0–1,5) | – | 5 l | OD600 a 0,01–0,015 |
| Volumen total | 500 l | 500 l |
Tabla 1: La composición y los volúmenes de las soluciones acuosas externas e internas de los GV.
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Discussion
Aquí, describimos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de los GV. Este método simple implica la formación de GV que contienen células bacterianas a nivel de una sola célula mediante el método de transferencia de gotas. En comparación con otros enfoques para la obtención de GV que contienen células bacterianas, este método tiene dos ventajas: (i) es fácil de desarrollar, y (ii) se requiere un pequeño volumen (2 l) de la solución de la muestra para preparar los GV. El método de transferencia de gotas20 para preparar los GV que contienen células bacterianas es más simple que los métodos clásicos de hidratación22 y microfluídicos17. Por ejemplo, el método de hidratación clásica22 es un método simple y fácil para preparar GV, pero la eficiencia de encapsulación de materiales en GV es bastante baja y se requiere al menos unos pocos cientos de microlitros de muestra. Los métodos de hidratación de celulosa23 y24 de hidratación asistida por gel para la fabricación de GV tienen una alta eficiencia de encapsulación de biomoléculas en comparación con el método de hidratación clásica22. Su eficiencia de encapsulación es tan alta como la de la técnica de transferencia de gotas, y se espera que estos dos métodos puedan permitir la encapsulación de células dentro de LOS GV. Además, el método microfluídico17 encapsula con precisión células individuales dentro de GV y muestra una eficiencia de encapsulación muy alta de materiales en GV, pero requiere un manejo complicado y técnicas para fabricar microdispositivos y un gran volumen de la muestra (al menos unos pocos mililitros) para fluir el tubo.
En este protocolo, la estabilidad de la interfaz aceite-agua es importante para obtener GV que contengan células bacterianas (Figura1b (vii)). Para obtener muchos GV, es esencial aplanar la interfaz aceite-agua. Por lo tanto, es necesaria una preparación adecuada de la fase de aceite. Hemos sonicado la fase de aceite durante al menos 1 h en un baño ultrasónico de alta potencia (120 W) para disolver completamente las moléculas de lípidos. Es importante colocar en capas la fase de aceite en la solución acuosa externa inmediatamente después de la sonicación (Figura1b (vii)).
El método descrito aquí tiene dos limitaciones. En primer lugar, los GV a menudo se rompen y las células bacterianas se filtran en la solución acuosa externa. Esto se debe a que durante la formación de GV, algunas gotas de W/O no se pueden transferir a través de la interfaz aceite-agua y se rompen. Esto es inevitable cuando se utiliza el método de transferencia de gotas20. Además, los GV pueden romperse durante la observación. Se debe mejorar la estabilidad de los GV, por ejemplo mediante el uso de un citoesqueleto artificial que estabilice los GV25. En segundo lugar, el número de células bacterianas encapsuladas no se puede controlar perfectamente. La Figura 4 muestra que un gran número de células bacterianas fueron encapsuladas en los GV, y por lo tanto, es difícil controlar el número de células bacterianas en GV utilizando el método de transferencia de gotas. Para controlar el número de celda, se puede utilizar la tecnología de microfluidos.
Los GV pueden controlar su solución acuosa interna de manera más eficaz que otros materiales (gotas de gel12,13 o gotas para W/O5,11). Por ejemplo, las condiciones acuosas de las soluciones internas y externas de los GV se ven alteradas por la permeabilidad natural de la membrana26 o la permeabilidad facilitada por un poro de membrana16 o transportador27. En el método actual, las moléculas de aceite (aceite mineral en este caso) permanecieron en la membrana20. Se desconoce la influencia del aceite que queda en la membrana en la permeabilidad de los nutrientes u oxígeno para el crecimiento bacteriano. Aunque no conocemos la permeabilidad natural de la membrana de nutrientes u oxígeno, consideramos que la cantidad de nutrientes u oxígeno en el medio de crecimiento fue suficiente para el crecimiento bacteriano en el presente estudio. La permeabilidad natural de la membrana de nutrientes u oxígeno es muy importante para el crecimiento celular bacteriano y es un tema importante para futuros estudios. La técnica para controlar la permeabilidad no puede llevarse a cabo utilizando el método de cultivo con gotas de gel12,13 o gotas W/O5,11. Por lo tanto, los GV se convertirán en la primera opción para aplicaciones de cultivo bacteriano en un espacio confinado.
Nuestro método de cultivo bacteriano es un concepto y herramienta potencialmente nuevo en microbiología19 para cultivar bacterias ambientales desconocidas para obtener o analizar sus productos metabólicos. Además, nuestros PV que contienen células bacterianas son un sistema híbrido de un modelo de células artificiales (GV) y una célula viva (células bacterianas) para crear una nueva herramienta para la biotecnología28 y la biología sintética de abajo hacia arriba29.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una Iniciativa Líder para Excelentes Investigadores Jóvenes (LEADER, No. 16812285) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón, una Beca en Ayuda para la Investigación de Jóvenes Científicos (No 18K18157, 16K21034) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a M.M., y la Beca en Ayuda de MEXT a K.K. (No 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
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