Summary
Vi demonstrerar encellig kultur av bakterier inuti jätte blåsor (GVs). GVs som innehåller bakterieceller bereddes av DROPP överföringsmetoden och immobiliserades på ett membran som stöds på ett glas substrat för direkt observation av bakterietillväxt. Den här metoden kan också vara anpassningsbar till andra celler.
Abstract
Vi utvecklade en metod för odling av bakterieceller på encellig nivå inuti Giant blåsor (GVS). Bakteriell cellkultur är viktigt för att förstå funktionen hos bakterieceller i den naturliga miljön. På grund av tekniska framsteg, olika bakteriella cellfunktioner kan avslöjas på encellig nivå inuti ett trångt utrymme. GVS är sfäriska mikro-stora fack består av amfifila lipid molekyler och kan hålla olika material, inklusive celler. I denna studie var en enda bakteriecell inkapslad i 10 – 30 μm GVs av DROPP metoden och GVs som innehöll bakterieceller immobiliserades på ett membran som stöds på ett glas substrat. Vår metod är användbar för att observera realtids-tillväxten av enstaka bakterier inuti GVs. Vi odlade Escherichia coli (E. coli) celler som en modell inuti GVS, men denna metod kan anpassas till andra celltyper. Vår metod kan användas inom vetenskap och industriella områden inom mikrobiologi, biologi, bioteknik och syntetisk biologi.
Introduction
Kulturen i bakterieceller på encellig nivå har fått ökad uppmärksamhet. Odling av bakterieceller på encellig nivå inuti ett trångt utrymme kan belysa bakteriella funktioner såsom fenotypisk variabilitet1,2,3,4, cell Behavior5, 6 , 7 , 8 , 9, och antibiotikaresistens10,11. På grund av de senaste framstegen inom kultur teknik, kan kulturen av enstaka bakterier uppnås i ett trångt utrymme, såsom i en väl chip4,7,8, gel dropp12,13 , och vatten-i-olja (W/O) DROPP5,11. För att främja förståelsen eller utnyttjandet av enstaka bakterieceller behövs ytterligare teknisk utveckling av odlingstekniker.
Vesikler som imiterar det biologiska cellmembranet är sfäriska fack som består av amfifila molekyler och kan hålla olika material. Vesiklarna klassificeras efter storlek och omfattar små blåsor (SVs, diameter < 100 nm), stora vesikler (LVs, < 1 μm) och jätte blåsor (GVs, > 1 μm). SVs eller LVs används ofta som drog bärare på grund av deras affinitet till det biologiska cellmembranet14. GVs har också använts som ett reaktorsystem för byggande av protoceller15 eller konstgjorda-celler16. Inkapsling av biologiska celler i GVS har rapporterats17,18, och därmed GVS Visa potential som ett cellkultursystem i kombination med reaktor systemet.
Här, tillsammans med en video av experimentella procedurer, beskriver vi hur GVs kan användas som nya cell-kultur fartyg19. GVs innehållande bakterier gjordes av DROPP överföringsmetoden20 och immobiliserades sedan på ett membran som stöds på ett täckglas. Vi använde detta system för att observera bakterietillväxt på Single-cellnivå inuti GVs i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av GVs som innehåller bakterieceller med dropp överföringsmetoden
- Förbered lipidstockslösningar av 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC, 10 mM, 1 mL) och 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[biotinyl (polyetyleneglykol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) i kloroform/ metanol lösning (2/1, v/v) och förvara beståndet vid-20 ° c.
- Beredning av en lipidinnehållande oljelösning
- Häll 20 μL av POPC-lösningen och 4 μL av biotin-PEG-DSPE-lösningen i ett glasrör (figur 1b (i)).
- Avdungra det organiska lösningsmedlet med luftflöde för att bilda en lipidfilm och placera filmen i en exsickator i 1 h för att helt avdunta det organiska lösningsmedlet (figur 1b (II)).
Anmärkning: Det är nödvändigt att avdunpa det organiska lösningsmedlet i ett draghuv. - Tillsätt 200 μL mineralolja (0,84 g/mL, tabell av material) till injektionsflaskan med glas (figur 1b (III)).
- Linda in Öppningsdelen av glasflaskan med film och Sonikera den i ett ultraljudsbad (120 W) i minst 1 h (figur 1b (III)). De slutliga koncentrationerna av POPC och biotin-PEG-DSPE är 1 mM respektive 0,002 mM.
- För-odling av bakterie-celler
- Inokulera E. coli i 1x lb-medium (1 g jästextrakt, 2 g Bacto Tryptone och 2 g natriumklorid i 200 ml avjoniserat vatten) från en LB-platta och inkubera vid 37 ° c i 12 – 14 timmar (över natten).
- Efter inkubering, samla 20 μL av kulturen lösning och överföra till 1,98 mL färskt 1x LB medium, och odla cellerna igen för 2 h.
- Kontrollera den optiska densiteten vid 600 Nm (OD600)-värdet för för odlings lösningen (upprättad i steg 1.3.2). En för kultur lösning av OD600 = 1,0 – 1,5 ska användas.
- Beredning av de yttre och inre vattenlösningar av GVs
- Lös upp glukos i 1x LB medium för att bereda en yttre vattenlösning av GVs. Förbered 20 mL av en lager glukoslösning (500 mM).
- Späd ut lager glukos lösningen med 1x LB medium till 200 mM (tabell 1).
- Lös upp sackaros i 1x LB medium för att bereda en inre vattenlösning av GVs. Förbered 20 mL av en stam sackaroslösning (500 mM).
- Blanda före-kulturlösningen (OD600 = 1,0 – 1,5), sackaroslösning (500 mm) och 1x lb-medium (tabell 1). Det slutliga OD600 -värdet för kultur lösningen bör vara 0,01 – 0,015 och den slutliga sackaroskoncentrationen bör vara 200 mm.
Anmärkning: Var försiktig för att undvika osmotiskt tryck. Det är nödvändigt att balansera koncentrationen mellan den inre och yttre vattenlösning.
- Beredning av vatten i olja (W/O) droppar som innehåller bakterieceller
- Tillsätt 2 μL av den inre vatten lösningen av GVs (beredd i steg 1.4.4) till 50 μL av den oljelösning som innehåller lipider (mineralolja med POPC och biotin-PEG-DSPE) i ett 0,6 mL lockat plaströr (figur 1b (IV)).
- Emulgera de två komponenterna i plaströr genom att knacka på röret för hand (figur 1b (v)).
- Bildande av GVs som innehåller bakterieceller
- Tillsätt 50 μL av den yttre vatten lösningen av GVs (beredd i steg 1.4.2) i ett 1,5 mL lockat plaströr (figur 1b (vi)) och försiktigt lager 150 μl av den oljelösning som innehåller lipider (mineralolja med POPC och biotin-PEG-dspe) på ytan av den yttre vatten lösning (figur 1b (VII)). Inkubera detta prov i rumstemperatur (RT, 25 ° c) i 10 – 15 min. Kontrollera att gränssnittet för olja och vattenlösningar är plant.
- Tillsätt 50 μl av W/O dropp-lösningen (upprättad i steg 1.5.2) på gränssnittet för olja och vattenlösning med hjälp av en pipett (figur 1b (VIII)).
- Centrifugera 1,5 mL lockded plaströr (från steg 1.6.2) i 10 min vid 1 600 x g vid RT i en stationär centrifug (figur 1b (IX)). Efter centrifugering, aspirera oljan (översta lagret) från 1,5-mL lockded plaströr med hjälp av en pipett, och samla in GVs som innehåller bakterieceller (figur 1b (x)).
2. beredning av ett GV-observationssystem (bakteriellt cell kultur system)
-
Beredning av små blåsor (SVS) för pågående ng en lipidens membran som stöds
- Häll 20 μL av POPC-lösningen och 4 μL av biotin-PEG-DSPE-lösningen i ett glasrör (med samma lipidsammansättning som används för GV-beredning i steg 1,1).
- Avdungra det organiska lösningsmedlet med luftflöde för att bilda en lipidfilm och placera detta prov i en exsickator i 1 h för att helt avdunta det organiska lösningsmedlet.
- Tillsätt 200 μL 200 mM glukos i 1x LB-medium (den yttre vatten lösningen av GVs) till injektionsflaskan med glas.
- Linda öppningen del av glaset injektionsflaskan med film och Sonikera den i ett ultraljudsbad (120 W) för minst 1 h.
- Förbered SVs med extrudering metod21 med en mini-extruder och polykarbonat membran med 100 nm porstorlek.
-
Beredning av en handgjord kammare
- Borra ett 7 mm hål med en hålslag på en dubbelbelagd tätning (10 mm x 10 mm x 1 mm).
- Klistra in den dubbelställda tätningen med hålet på ett täckglas (30 mm x 40 mm, tjocklek 0,25 – 0,35 mm).
-
Beredning av ett lipidens membran som stöds på täckglaset i kammarens hål
- Tillsätt 30 μL av SV-lösningen till kammarens hål (förberett i avsnitt 2,2) och inkubera vid RT i 30 minuter.
- Tvätta försiktigt hålet två gånger med 20 μL 1x LB-medium innehållande 200 mM glukos (den yttre vatten lösningen av GVs) genom pipettering.
-
Immobilisering av GVs på stöttas membran som stöds på täckglaset i kammarens hål
- Introducera 10 μL neutravidin med den yttre vatten lösningen av GVs (1 mg/mL) i hålet och inkubera vid RT i 15 min.
- Tvätta försiktigt hålet två gånger med 20 μL 1x LB-medium innehållande 200 mM glukos (den yttre vatten lösningen av GVs) genom pipettering.
- Tillsätt all lösning som innehåller GVs (bereds i steg 1.6.3) i kammarens hål och försegla med ett täckglas (18 mm x 18 mm, tjocklek 0,13 – 0,17 mm) (figur 2b).
-
Mikroskopisk observation av bakteriell celltillväxt inuti GVs
- Ställ ett mikroskopiskt uppvärmnings skede system med ett inverterat Mikroskop utrustad med en 40x/0.6 numerisk bländare (NA) objektiv med ett långt arbetsavstånd (figur 2b).
- Placera kammaren på det mikroskopiska värme stegs systemet (figur 2b). Inkubera GVs som innehåller bakterieceller i kammaren vid ett statiskt tillstånd under 6 h vid 37 ° c.
- Fånga och spela in mikroskopbilder av bakteriecell tillväxt inuti GVs varje 30 min med hjälp av en vetenskaplig kompletterande Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar en enkel metod för att generera GVs som innehåller enstaka bakterieceller med hjälp av DROPP överföringsmetoden (figur 1). Figur 1a visar en schematisk bild av utfällningen av GVS som innehåller bakterier. W/O droppar som innehåller bakterier överförs över olje-vatten (lipidmonolayer) gränssnitt genom centrifugering att bilda GVs. Skillnaden i densitet mellan sackaros (inre vattenlösning) och glukos (yttre vattenlösning) hjälper också passage av olje-vatten-gränssnittet i W/O droppar. Det är nödvändigt att övervaka osmotiska trycket i inre och yttre vattenlösning eftersom en liten skillnad i koncentration mellan dessa lösningar kan framkalla deformation och kollaps av GVs. Ett flödesschema för beredning av GVs som innehåller bakterieceller med dropp överföringsmetoden visas i figur 1b. Genom att följa denna procedur kan GVs som innehåller enstaka bakterieceller lätt erhållas.
För att iaktta bakterie cells tillväxt inom GVs konstruerades ett originellt kultur system för mikroskopisk observation (figur 2). GVs innehållande bakterier immobiliserades på en understödd membran yta belagd med neutravidin på ett täckglas (figur 2A). Denna immobilisering teknik har möjliggjort långvarig observation av GVs.
Typiska mikroskopibilder i faskontrast av de olika storleks-GVs som innehåller enstaka bakterieceller visas i figur 3. I detta experiment fick vi även GVs innehållande bakterieceller med storlekar från 10 μm till 30 μm. Figur 3 visar bakterietillväxt på encellig nivå i GVS med olika storlekar på 10,7 μm (figur 3a) och 28 μm (figur 3b). För båda storlekarna av GVs, E. coli -celler genomgick förlängning och Division processer, med en eller två E. coli celler växer till ett mycket stort antal celler över 6 h. Sålunda, E. coli celler växte stabilt inne i GVS.
Den relativa frekvensen av GVs som innehåller ett givet antal bakterieceller visas i figur 4. I vårt experimentella tillstånd (OD600 = 0,01 – 0,015) inkapslades bakterieceller på singelcellsnivå hos cirka 10% av de erhållna GVS (tomma GVS var cirka 80%). GVs-kapslingen på singelcellsnivå var ungefär 50% av de GVs som innehöll bakterieceller, beräknat från inuppsättningen av figur 4.
Figur 1: experimentella procedurer för GVs som innehåller bakterier. a) GVS-system som innehåller bakterier som framställts genom en dropp överföringsmetod. W/O mikrodroppar som innehåller bakterier passera genom en lipidmonolayer gränssnitt med centrifugalkraft och sedan bilda ett lipidbilayer membran. b) flödet av syntesen av GVS som innehåller bakterier. i) organiska lösningsmedel som innehåller lipider (POPC och biotin-PEG-DSPE, 100:0,2 molar ratio). II) lipid film på botten av glasflaskan. III) oljelösning som innehåller lipider. IV) blandning av 50 μL oljelösning och 2 μL inre vattenlösning (200 mM sackaros och 1x LB-substrat) som innehåller bakterieceller. v) emulgering genom hand avlyssning (över 50 gånger). Vi) 50 μL av den yttre vatten lösningen (200 mM glukos i 1x LB-medium). VII) skiktning av 150 μL oljelösning på den yttre vatten lösningen. (VIII) skiktning av W/O dropp-lösningen. IX) centrifugering av röret. (x) utfälld GVs som innehåller bakterieceller efter aspiration av oljan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: o bdling system av bakteriell cellkultur inuti GVs. (a) GVS immobiliseras på ett membran som stöds genom biotin – neutravidin-bindning på täckglaset. GVs inkuberas av ett värmesystem. bbild av observationssystemet, inklusive en handgjord kammare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: faskontrastmikroskop bilder av GVs som innehåller enstaka bakterieceller (indikeras av de svarta pilarna). Snap-Shots av bakteriecell tillväxt insida olikt storleksanpassat GVs. (a) vesikelstorlek = 10,7 μm. bvesikelstorlek = 28 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: statistisk analys av antalet inkapslade bakterieceller per gv. De relativa frekvenserna av GVs plottas som histogram. Inset: förstoring av de relativa frekvenserna av GVs som innehåller bakterieceller från enstaka till 10 < celler. Totalt analyserades 235 GVs. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Yttre vattenlösning | Inre vattenlösning | Slutliga | |
| 500 mM glukos med LB-medium | 200 μL | – | 200 mM |
| 500 mM sackaros med LB-medium | – | 200 μL | 200 mM |
| 1x LB-medium | 300 μL | 295 μL | – |
| För kultur lösning (OD600 = 1,0 – 1,5) | – | 5 μL | OD600 = 0,01 – 0,015 |
| Total volym | 500 μL | 500 μL |
Tabell 1: sammansättningen och volymerna av de yttre och inre vatten lösningarna i GVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en metod för odling av bakterieceller på encellsnivå inuti GVs. Denna enkla metod innebär att bilda GVS som innehåller bakterieceller på Single-cellnivå med hjälp av DROPP överföringsmetod. Jämfört med andra metoder för att erhålla GVs som innehåller bakterieceller, har denna metod två fördelar: (i) det är lätt att utveckla, och (II) en liten volym (2 μL) av provlösningen krävs för att förbereda GVs. DROPP överföringsmetoden20 för beredning av GVS som innehåller bakterieceller är enklare än de klassiska hydreringsmetoderna22 och mikrofluidik17. Till exempel, den klassiska hydrering metod22 är en enkel och enkel metod för att förbereda GVS, men inkapsling effektiviteten av material i GVS är ganska låg och minst ett par hundra mikroliter prov krävs. Den nyligen utvecklade cellulosa Paper-abetted hydrering23 och gel-Assisted hydrering24 metoder för att göra GVS har en hög inkapsling verkningsgrad av biomolekyler jämfört med den klassiska hydrering metod22. Deras inkapsling effektivitet är lika hög som för dropp transfer teknik, och det förväntas att dessa två metoder kan tillåta inkapsling av celler inuti GVS. Dessutom, den mikrofluidik metod17 exakt kapslar in enstaka celler inuti GVS och visar en mycket hög inkapsling effektivitet av material till GVS men kräver komplicerad hantering och tekniker för fabricera mikroenheter och en stor provvolym (åtminstone några milliliter) för att strömma röret.
I detta protokoll är stabiliteten i olje vatten gränssnittet viktig för att erhålla GVs som innehåller bakterieceller (figur 1b (VII)). För att få många GVs, är det viktigt att platta till olje-vatten-gränssnittet. Därför är korrekt beredning av oljan fas nödvändig. Vi sonicated oljefasen för minst 1 h i en hög effekt ultraljudsbad (120 W) för att helt lösa upp lipidmolekylerna. Det är viktigt att lagret oljefasen på den yttre vatten lösningen omedelbart efter ultraljudsbehandling (figur 1b (VII)).
Den metod som beskrivs här har två begränsningar. Först, GVs bryter ofta och bakterieceller läcker in i den yttre vattenlösning. Detta beror på att under GV formation, kan vissa W/O droppar inte överföra genom olje-vatten-gränssnittet och blir spruckna. Detta är oundvikligt vid användning av DROPP-överföringsmetoden20. Dessutom kan GVs bryta under observation. Stabiliteten hos GVs måste förbättras, till exempel genom att använda ett artificiellt cytoskelett som stabiliserar GVs25. För det andra kan antalet inkapslade bakterieceller inte helt kontrolleras. Figur 4 visar att ett stort antal bakterieceller inkapslades i GVS, och därför är det svårt att kontrollera antalet bakterieceller i GVS med hjälp av överföringsmetoden för dropp. För att kontrollera cellnumret kan mikrofluidics-tekniken användas.
GVS kan kontrollera sin inre vattenlösning mer effektivt än andra material (gel droppar12,13 eller W/O droppar5,11). Till exempel, vattenförhållandena i de inre och yttre lösningarna av GVs ändras genom naturlig membran permeabilitet26 eller permeabilitet underlättas av en membran pore16 eller transporter27. I den nuvarande metoden förblev olje molekyler (mineralolja i detta fall) i membranet20. Påverkan av oljan kvar i membranet på permeabiliteten av näringsämnen eller syre för bakterietillväxt är okänd. Även om vi inte känner till det naturliga membranet permeabilitet av näringsämnen eller syre, anser vi att mängden näringsämnen eller syre i odlingssubstrat var tillräcklig för bakterietillväxt i den aktuella studien. Den naturliga membranet permeabilitet av näringsämnen eller syre är mycket viktigt för bakteriell celltillväxt och är ett viktigt ämne för framtida studier. Tekniken för kontroll av permeabilitet kan inte utföras med hjälp av odlingsmetoden med gel droppar12,13 eller W/O droppar5,11. GVs blir därmed förstahandsvalet för bakterie odlings applikationer i trånga utrymmen.
Vår bakteriekultur metod är ett potentiellt nytt koncept och verktyg i mikrobiologi19 för att odla okända miljö bakterier för att erhålla eller analysera deras metaboliska produkter. Dessutom är vår bakterie cells innehållande GVs ett hybridsystem av en konstgjord cell modell (GVs) och en levande cell (bakterieceller) för att göra ett nytt verktyg för bioteknik28 och bottom-up syntetisk biologi29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett ledande initiativ för framstående unga forskare (LEADER, nr 16812285) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) i Japan, ett bidrag-in-Aid för ung forskare forskning (nr 18K18157, 16K21034) från Japan Society for främjande av vetenskap (JSPS) till M.M., och Grant-in-Aid från MEXT till KK (nr 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al.
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al.
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L.
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
