Summary
Tumor mikromiljø er en væsentlig del af kræft vækst og invasion. For at efterligne karcinomer er der behov for en biologisk relevant menneskelig matrix. Denne protokol introducerer en forbedring for in vitro tredimensionel sfæroide invasion assay ved at anvende en human leiomyoma-baseret matrix. Protokollen introducerer også en computer-baseret celle invasion analyse.
Abstract
To-dimensionelle cellekultur-baserede analyser er almindeligt anvendt i in vitro-kræftforskning. Men, de mangler flere grundlæggende elementer, der danner tumor mikromiljø. For at opnå mere pålidelige in vitro resultater, er flere tredimensionale (3D) cellekultur analyser blevet introduceret. Disse analyser tillade kræftceller til at interagere med den ekstracellulære matrix. Denne interaktion påvirker celle adfærd, såsom spredning og invasion, samt cellernes morfologi. Desuden kan denne interaktion inducere eller undertrykke udtrykket af flere Pro-og anti-tumorigene molekyler. Spheroid invasion assay blev udviklet til at give en passende 3D in vitro-metode til at studere kræft celle invasion. I øjeblikket, animalske afledte matricer, såsom mus sarkom-afledt matrix (MSDM) og Rottehale type I kollagen, anvendes hovedsageligt i sfæide invasion assays. Under hensyntagen til forskellene mellem den menneskelige tumor mikromiljø og animalske afledte matricer, en menneskelig myoma-afledt matrix (HMDM) blev udviklet fra benign livmoderen leiomyoma væv. Det er blevet påvist, at HMDM inducerer migration og invasion af karcinom celler bedre end MSDM. Denne protokol gav en enkel, reproducerbar og pålidelig 3D menneskelige tumor-baserede sfæroide invasion assay ved hjælp af hmdm/fibrin matrix. Den indeholder også detaljerede instruktioner om billeddannelse og analyse. Sfæroider vokser i en U-formet ultra-lav fastgørings plade inden for HMDM/fibrin-matrixen og invaderer den. Invasionen er dagligt indpakket, målt, og analyseret ved hjælp af ilastik og Fiji ImageJ software. Analyse platformen blev påvist ved hjælp af humane laryngeale primære og metastatiske planocellulært celle karcinom cellelinjer. Men, protokollen er velegnet også til andre solide kræft cellelinjer.
Introduction
Konventionelle to-dimensionelle (2D) cellekultur undersøgelser har bidraget betydeligt til kræftforskning. I øjeblikket, forskere er ved at flytte mere i retning af tredimensionale (3D) cellekultur analyser at bedre efterligne in vivo betingelser1. 3D Cancer cellekulturen mere præcist afspejler den komplekse tumor mikromiljø i form af celle-celle-og celle-matrix interaktioner, genekspression profiler, stof følsomhed, og signalering pathway aktivitet2,3.
Flere 3D cellekultur modeller anvendes i kræftforskning såsom tumor væv explant, tumor på en chip, og fler cellulære tumor sfæroider3,4. Flercellede tumor sfæroider er nu almindeligt anvendt, da de efterligner flere funktioner i in vivo betingelser i human tumorer1,5. Når sfæroide diameter er større end 500 μm, det har endda hypoksiske regioner og en nekrotisk Center, der repræsenterer således in vivo tumor situation2.
Mange syntetiske (f. eks. Polydimethylsiloxan) og animalske afledte (f. eks. Rottehale type I kollagen og mus sarkom-afledt matrix, matrigel, benævnt MSDM) matricer er blevet udviklet til 3D cellekultur analyser3,6, 7,8. Hidtil har ingen af de kommercielt tilgængelige matricer stammer fra humant tumor væv. Derfor, de mangler funktionerne i den menneskelige tumor mikromiljø, som har betydelige virkninger på kræft celle invasion processer8.
Myogel (Human myoma-afledt matrix, benævnt HMDM) er udvundet fra humant uterus leiomyoma tumor væv9. Det er påvist, at proteinindholdet i HMDM afviger betydeligt fra MSDM. Faktisk er 66% af HMDM-proteinerne forskellige fra MSDM-proteiner. På den anden side, nogle proteiner, såsom Laminin, type IV kollagen, dermatansulfat sulfat proteoglycans, nidogen, og epidermal vækstfaktor, er til stede i begge matricer10. Derudover, musen adskiller sig fra det menneskelige i enzym indhold, med mennesker, der har 78 færre proteaser end mus11.
Fibrin er blevet anvendt i vid udstrækning alene eller i kombination med andre materialer som stilladset materiale12. I 3D cellekultur analyser kombineres kommercielt tilgængeligt humant fibrinogen og thrombin for at danne en fibrin hydrogel12.
Denne protokol beskriver en forbedring af den tidligere indførte 3D tumor sfæroide invasion assay7. Denne nye protokol gælder Human tumor-afledte matrix i stedet for muse afledte tumor matrix. Det indebærer også billedbehandling og analyseteknikker ved hjælp af ilastik og Fiji ImageJ software. Denne protokol kan anvendes til sfæroide assay af flere forskellige solid Cancer cellelinjer. Det tilbyder et biologisk relevant værktøj til at udvikle nye anti-cancer terapier og til at studere virkningerne af specifikke molekyler på kræft celle invasion.
Protocol
1. generering af Multicellulære tumor Sfæroider
Bemærk: Protokollen er demonstreret her med UT-SCC-42A og-42B cellelinjer, men det kunne også anvendes ved hjælp af andre cellelinjer.
- Vask UT-SCC-42A-og-42B-cellerne med 6 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS), tilsæt 0,05% trypsin-EDTA (3 mL til 75 cm2 kolbe), og Anbring kolben i en cellekultur-inkubator (37 °c, 5% Co2, 95% fugtighed) i 2-5 min.
- Kontroller, at cellerne er afmonteret under et mikroskop. Tilsæt derefter hele Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM)-medier (DMEM + 10% føtale kvægserum, 100 e/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 250 ng/mL amphotericin B, 0,4 μg/mL hydrocortison og 50 μg/mL ascorbinsyre) for at neutralisere enzymet (6 mL for 75 cm 2 kolbe) og Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør.
Bemærk: Vælg cellekultur mediet, der passer til de celler, der undersøgt. - Cellesuspensionen centrifugeres ved 200 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og celle pillen suspenderes i 2-5 mL komplet DMEM.
- Cellerne tælles, og cellesuspensionen fortyndes med komplet DMEM til en endelig koncentration på 20.000 celler/mL.
Bemærk: Det optimale antal celler skal bestemmes for hver cellelinje. - Der dispenseres 50 μL af cellesuspensionen i hver ultra-lav fastgørelse 96-godt rundt bundplade godt til en endelig koncentration af 1.000 celler per brønd.
- Pladen overføres til celle kulturens inkubator (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed). Fire dage senere, visuelt bekræfte tumor sfæoide dannelse med en inverteret mikroskop og fortsætte med analysen. Sørg for, at der kun er én sfæide pr. brønd.
Bemærk: Den tid, det tager at danne en sfæide, varierer mellem forskellige cellelinjer.
2. tredimensionel Spheroid invasion-assay
Bemærk: Forbered 2x opløsning, fordi gelen vil blive fortyndet 1:1, når den tilsættes i brøndene.
- Thaw HMDM på is og fibrinogen stamopløsning i et vandbad, der holdes ved 37 °C. Forstyr ikke fibrinogen, før det er fuldstændig opløst og ikke sætter opløsningen på is; nedbør vil forekomme.
- Det passende rumfang af hvert reagens blandes: 1 mg/mL HMDM (slutkoncentration: 0,5 mg/mL), 0,6 e/mL thrombin (slutkoncentration: 0,3 e/mL), 66,6 mg/mL aprotinin (slutkoncentration: 33,3 ug/mL) og 1 mg/mL fibrinogen (slutkoncentration: 0,5 mg/mL ).
Bemærk: Tilsæt fibrinogen lige før udlevering af blandingen i brøndene og arbejde hurtigt; det vil danne en gel i et par minutter. Behandl blot et par brønde ad gangen. - Der tilsættes 50 μL af gelen i hver brønd. Direkte spidsen mod indersiden væg af brønden og pipet langsomt. Undgå luftbobler (ved hjælp af reverse pipette Rings teknikken) og forsøg ikke at flytte sfæooid fra midten af brønden.
- Vend pladen tilbage til celle kulturens inkubator, og lad HMDM/fibrin-matrixen størkne i 30 minutter, og tilsæt forsigtigt 100 μL komplet DMEM til hver brønd oven på gelen.
3. billeddannelse
- Billede sfæroider dagligt ved hjælp af et inverteret lys mikroskop. Alternativt kan du bruge automatiske billedbehandlingssystemer.
4. billedsegmentering med Ilastik
- Åbn ilastik, og vælg arbejdsproces for pixel klassifikation (figur 1A). Den klassificerer pixel baseret på anmærkninger, der er foretaget af brugeren. Gem ilastik-projektet (. ILP) på computeren.
- Tilføj billeder til analyser. Klik på input data , og Tilføj ny , og vælg derefter billeder (figur 1B).
-
Ved valg af funktioner skal du klikke på valg af funktion og vælg funktioner (figur 1C, rødt rektangel).
Bemærk: de valgte funktioner skal nogenlunde svare til de visuelle egenskaber, der adskiller objekterne fra baggrunden, og de vil blive brugt til at træne klassifikatoren.- Vælg funktioner ved at klikke på boksene. De markerede felter bliver grønne (figur 1C, blåt rektangel).
Bemærk: Her kan brugeren vælge mellem flere forskellige funktionstyper og skalaer. Farve/intensitet skal vælges for at adskille objekter baseret på farve eller lysstyrke. Edge skal markeres for at adskille objekter baseret på lysstyrke eller farveforløb. Tekstur er en vigtig funktion, hvis objekterne i billedet har en særlig stoflige udseende. Til denne analyse anvendes farve/intensitet (Sigma 0) og Edge (Sigma 6).
- Vælg funktioner ved at klikke på boksene. De markerede felter bliver grønne (figur 1C, blåt rektangel).
-
For træning, klik på træning og i træningssektionen er der to etiketter: label 1 og label 2 (figur 1D, rødt rektangel). Hvis der kun er én etiket, skal du tilføje en ny etiket ved at trykke på Tilføj etiket (figur 1D, blåt rektangel).
- Marker baggrunden med en af etiketterne (figur 1d, gul) og cellerne med den anden etiket (figur 1d, blå).
- Træne softwaren til de første 10% af billederne. Vælg næste billede fra Aktuel visning.
- Når cellerne og baggrunden er markeret (af det første billede), skal du trykke på Live Update (figur 1D, lilla rektangel).
Bemærk: med det næste billede, vil ilastik automatisk udføre analysen i henhold til de tidligere billeder.
- Efter træningen er færdig og ilastik har analyseret alle billeder, Klik forudsigelse Export. Vælg simpel segmentering fra kilde; Vælg ikke sandsynlig heder eller andet (figur 1E).
- Vælg det ønskede output filformat fra Vælg Eksporter billedindstillinger... i afsnittet forudsigelse Export (figur 1E). Eksporter resultaterne af mærkningen ved at klikke på Eksporter alle (figur 1F). Filerne vil blive eksporteret til den samme mappe med de originale billeder.
Bemærk: i dette eksperiment anvendes. H5-format.
5. område analyse med Fiji ImageJ
-
Indstilling af skalering
- Åbn det originale billede med en skaleringsbar i Fiji ImageJ (figur 2a). Sørg for, at billedet har samme størrelse og dimension som de analyserede billeder. Brug værktøjet linje markering til at tegne en linje med en kendt længde (figur 2B).
Bemærk: Denne protokol udføres ved hjælp af Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) og ilastik-1.3.2 RC. - Klik på Analysér og Indstil skala (figur 2C). Indstil den kendte distance i feltet kendt distance , og Indstil den korrekte enhed, og klik på Global (figur 2D).
- Åbn det originale billede med en skaleringsbar i Fiji ImageJ (figur 2a). Sørg for, at billedet har samme størrelse og dimension som de analyserede billeder. Brug værktøjet linje markering til at tegne en linje med en kendt længde (figur 2B).
-
Installation af makroen
- Hvis et plugin ilastik ikke er installeret, skal du følge disse trin: Klik på Hjælp, Opdater.... Klik på Administrer opdaterings webstederi det åbne vindue ImageJ Updater. Klik på næste til ilastik i det åbne vindue Administrer opdaterings websteder, og klik derefter på Luk. Klik derefter på Anvend ændringer i vinduet ImageJ Updater. Denne proces kan tage noget tid. Det næste vindue vil være oplysninger med teksten opdateret. Klik på OK og genstart ImageJ.
- Klik på plugins, makroerog Installer (figur 3A). Vælg derefter filen Counter. IJM (Se supplerende oplysninger), og klik på Åbn.
Bemærk: Makroen blev skrevet specielt til måling af området. Makroen skal installeres, hver gang softwaren åbnes.
-
Område analyse
- Analysér billeder når alle plugins er installeret. Klik på plugins , og rul ned til ilastik (figur 3C). Vælg IMPORTER HDF5, Vælg filen med. H5-format, klik på Åbn , og Indlæs og Anvend lut (figur 3C, D).
- Tryk på a -knappen fra tastaturet (makroen) og området vises i oversigts vinduet som samlet område (figur 3E).
Representative Results
Fire dage efter UT-SCC-42b (metastatisk larynx SCC celle linie) celle såning, matricen (hmdm/fibrin, MSDM, eller kollagen) blev tilføjet på de dannede sfæroider (dag 0) og invasionen blev overvåget i tre dage. Billeder her blev opnået dagligt ved hjælp af et inverteret mikroskop (figur 4).
Når cellerne i HMDM/fibrin-matrixen var indlejret, begyndte de at invadere hurtigt efter en dag og udstrakte sig til matrixen (figur 4A). Cellerne i MSDM invaderede ikke i den omgivende matrix, men dannede i stedet en asymmetrisk struktur (figur 4B). På den anden side invaderede cellerne i kollagen en smule, men på grund af matrix krympning var analysen vanskelig (figur 4C). I nogle kollagenbrønde forsvandt sfærooiderne endda efter tre dage (figur 4C).
Figur 5 illustrerer kvantificeringen af celle invasionen i hmdm/fibrin af den primære larynx SCC-cellelinje UT-SCC-42a og den tilsvarende metastatiske cellelinje UT-SCC-42b. Den video (Movie 1) taget ved hjælp af en Live-celle analyse system af hmdm/fibrin sfæroide viser bevægelsen af SCC-celler i matrixen, hvor de danner tråde efterfulgt af de andre celler.
Figur 1 : Billedsegmentering. Udvalgte trin i billedsegmentering ved hjælp af ilastik. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skaleringsindstilling. Udvalgte trin i skala indstilling ved hjælp af Fiji ImageJ. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Invasion analyse ved hjælp af ImageJ. Udvalgte trin i billedanalyse ved hjælp af Fiji ImageJ. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : UT-SCC-42B celle invasion i tre forskellige matricer. Repræsentative billeder af SCC celle invasion i 3D sfæroider. Invasionen blev fulgt i tre dage og billeder blev taget dagligt ved hjælp af en inverteret mikroskop. (A) hmdm/fibrin, (B) MSDM, (C) kollagen. Den sidste kolonne repræsenterer afklaring af dag 3 invasion. Skaleringsbar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kvantificering af SCC-celle invasion i HMDM/fibrin. Primær larynx UT-SCC-42a og tilsvarende metastatisk larynx UT-SCC-42b SCC cellelinje invasion blev analyseret ved hjælp af ilastik og Fiji ImageJ software. Resultater er gennemsnitlig ± standardafvigelse for tre uafhængige eksperimenter, hver i triplicat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: SCC Cell-bevægelse inden for HMDM/fibrin i tre dage. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Discussion
Den præsenterede metode giver en 3D menneskelige tumor-baserede assay til at evaluere invasivitet af kræftceller inden for menneskelige tumor mikromiljø efterligne matrix. Kræft celle invasion kan let måles ved daglig billeddannelse med et standard mikroskop og ved hjælp af billedanalyse software. Metoden demonstrerer celle invasion snarere end blot spredning.
I modsætning til MSDM kræver HMDM/fibrin-matrixen ingen temperaturkontrol. Denne metode er let at udføre, især uden at det er nødvendigt at overføre sfæroider fra en plade til en anden. Det har kun et teknisk følsomt trin, tilsætning af fibrinogen til matrixen. Da fibrinogen begynder at gel efter et par minutter, kræver tilsætning af fibrinogen robust pipettering og behandling af kun få brønde ad gangen. Der er også en risiko for at forstyrre sfæide og flytte den fra sin centrale position i U-formet godt, hvis pipettering sker i en højtryks-måde. Dislokation af sfæroide kan komplicere billeddannelse og i sidste ende analysen.
Analysen kan modificeres ved at ændre koncentrationen af HMDM eller fibrinogen. Cellerne kan også fastgøres og farves for efterfølgende molekylære undersøgelser. Selvom denne metode kan ændres til en fuldt automatiseret form, kan den også udføres med et normalt mikroskop og to open source-software, uden behov for dyrt udstyr.
Sammenlignet med de traditionelle MSDM-baserede 3D-assays, denne analyse kunne vise bedre celle invasion egenskaber. Spheroids dyrket i en kælder membran-indeholdende Laminin-rige matrix, såsom MSDM, kan have mere spredning af kræftceller end faktiske invasion, gør det uegnet til invasion analyser i flere kræft cellelinjer på grund af deres lave invaderende kapacitet. En anden hyppigt anvendte matrix, type I kollagen, har tendens til at krympe fra kanterne under 3D dyrkning, som påvirker sfæroide lokalisering og billeddannelse af brøndene. Desuden er forskellene mellem de iboende invasive egenskaber af de mere (HSC-3) og mindre (SCC-25) aggressiv tungen karcinom cellelinjer er blevet påvist ved hjælp af menneskelige tumor mikromiljø efterligne modeller (myoma skiver og dens opløselig form matrix)10,13.
Analysen er også mere etisk end at bruge MSDM, da HMDM er udvundet fra resterne materiale af human leiomyoma tumor. I øjeblikket er hmdm den eneste tilgængelige Human tumor-afledte ECM produkt, der synes at være egnet til mange kræft-relaterede in vitro-analyser8,10. I fremtiden, animalske vævs afledte matricer kunne erstattes af humane tumor-baserede matricer for at reducere behovet for at ofre dyr til matrix produktion.
Udskiftning 2D cellekultur analyser med 3D-metoder giver mere præcise oplysninger om kræft celle adfærd. I øjeblikket er der flere 3D-modeller og kommercielle matricer, men desværre er ingen egnet til alle kræft cellelinjer. Forskerne bør vælge den mest egnede matrix for deres særlige assay. Optimal matchning af assay og matrix kan være udfordrende, men det kan øge resultaternes pålidelighed betydeligt.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker denne Studies finansieringskilder: Sigrid Jusélius Foundation, den finske Cancer forening og Helsinki University central hospitals forskningsfonde. Forfatterne anerkender Biomedicum Imaging Unit ved universitetet i Helsinki for teknisk hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
| Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
| Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
| BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
| DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
| DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
| DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
| Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56 °C in waterbath before use. |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H2O. Warm the H2O and the fibrinogen to 37 °C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70 °C should be thawed in a water bath maintained at 37 °C. |
| Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
| Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
| Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
| Myogel | Lab made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
| Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
| Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
| UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |
References
- Jung, H., et al. Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo. Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).
- Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport. Nature Communications. 4, 2718 (2013).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. Journal of Visualized Experiments. (99), e52686 (2015).
- Salo, T., et al. A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies. BMC Cancer. 15, 981 (2015).
- Nurmenniemi, S., et al. A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment. The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).
- Salo, T., et al. Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).
- Overall, C. M., Blobel, C. P. In search of partners: linking extracellular proteases to substrates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).
- Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).
- Hoornstra, D., et al. Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin. In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).
