Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

Summary

Мы представляем методы изоляции, культивирования, характеристики и дифференциации клеток-прародителей мышц человека (HMPCs), полученных из скелетной мышечной биопсии ткани. hMPCs, полученные и характеризуемые с помощью этих методов, могут быть использованы для последующего решения вопросов, связанных с исследованиями, связанными с миогенезом человека и регенерацией скелетных мышц.

Abstract

Использование первичных тканей и клеток человека идеально подходит для исследования биологических и физиологических процессов, таких как регенеративный процесс скелетных мышц. Существуют признанные проблемы для работы с человеческими первичными взрослыми стволовыми клетками, особенно клетками-потомками человеческих мышц (HMPCs), полученными в результате биопсии скелетных мышц, включая низкую урожайность клеток из собранной ткани и большую степень неоднородности донора параметров роста и смертности между культурами. Хотя включение неоднородности в экспериментальную конструкцию требует большего размера выборки для обнаружения значительных эффектов, это также позволяет нам определить механизмы, которые лежат в основе изменчивости потенциала расширения HMPC, и, таким образом, позволяет нам лучше понять неоднородность в регенерации скелетных мышц. Новые механизмы, которые отличают расширение способности культур имеют потенциал, чтобы привести к развитию терапии для улучшения регенерации скелетных мышц.

Introduction

Скелетная мышца является крупнейшей органной системой в организме человека, накоторую приходится 30–40% массы всего тела 1. В дополнение к своей хорошо признанной роли в передвижении, скелетные мышцы поддерживает температуру тела и осанку, и играет центральную роль во всем теле питательных гомеостаза. Исследования с участием человеческих участников, животных и моделей клеточной культуры являются ценными для решения вопросов, касающихся биологии скелетных мышц и регенерации. Изоляция и культура клеток-прародителей мышц человека (HMPCs) обеспечивает надежную модель, которая позволяет использовать методы клеточной культуры и манипуляции в образцах человека. Преимущество использования HMPCs является то, что они сохраняют генетический и метаболический фенотип от каждого донора^2,3. Поддержание донорского фенотипа позволяет исследователям исследовать межиндивидуальные различия в миогенном процессе. Например, мы использовали наш метод характеристикhMPC для выявления возрастных и половыхразличий в емкости расширения популяции hMPC 4.

Цель юма этого протокола состоит в том, чтобы подробно методы изолировать, культуры, охарактеризовать и дифференцировать HMPCs от скелетной мышечной биопсии ткани. Опираясь на предыдущую работу, которая описала HMPCs и определилпотенциальных создателей поверхности клеток для изоляции hMPC^5,6, этот протокол заполняет критический пробел в знаниях, связывая изоляцию с характеристикой HMPCs. Кроме того, подробные пошаговые инструкции, включенные в этот протокол, делают изоляцию и характеристики hMPC доступными для широкой научной аудитории, в том числе с ограниченным опытом работы с ГМпС. Наш протокол является одним из первых, чтобы описать использование цитометра изображений для отслеживания популяций клеток. Недавно разработанные цитометры визуализации являются самыми современными, высокопроизводительными и микроплитными, что позволяет в течение нескольких минут анализировать живые клетки, подсчет клеток и многоканальный анализ флуоресценции всех клеток в каждой скважине сосуда культуры. Эта система позволяет быстро количественно измерять динамические изменения в пролинизации и жизнеспособности всей популяции клеток с минимальным нарушением культуры. Например, мы можем выполнять объективные показатели слияния в последующие дни в пробирке, чтобы определить кинетику роста каждой культуры, полученной от различных доноров. Многие протоколы в литературе, особенно те, с участием дифференциации ПДК, требуют клетки для достижения определенного уровня слияния до начала дифференциации или лечения⁷. Наш метод позволяет объективно определить слияние каждой скважины в сосуде культуры, что позволяет исследователям инициировать лечение беспристрастным, несубъективным образом.

В прошлом основным ограничением использования первичных ГМпС были низкие урожаи, ограничивающие количество клеток, доступных для экспериментов. Мы и другие показали, что выход ПДК из ткани биопсии скелетных мышц составляет 1–15 ПДК на миллиграмм ткани(рисунок 1)⁸. Поскольку наш протокол позволяет четыре прохода клеток до очистки с флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS), наши криоконсервированные урожаи hMPC, полученные из небольших количеств биопсии ткани (50-100 мг), достаточно для решения исследовательских целей, где требуется несколько экспериментов. Наш протокол FACS производит 80% чистой (Pax7 положительный) MPC населения, таким образом, наш протокол оптимизирован как для урожайности и чистоты.

Protocol

Этот протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом Корнельского университета. Все участники были проверены на основные состояния здоровья и дали информированное согласие.

1. Получение мышечной ткани человека через биопсию скелетных мышц

1. Определите мышцу vastus lateralis через пальпацию, анатомические ориентиры, и активное сокращение мышцы.
2. Palpate vastus lateralis, имея участника затянуть свои четырехглавой мышцы и найти живот мышцы, около 1 / 3 пути от коленной чашечки до бедра, и просто вентролатеральной к бедренной кости.
3. Используйте бумагу измерительная лента, чтобы отметить область с хирургическим маркером около 4'6 дюймов от верхней части коленной чашечки, представляющих живот мышцы.
4. Бритье волос вблизи отмеченной области, а затем очистить с хирургическим антисептиком класса, который используется перед медицинскими процедурами (Например: 2% хлоргексидина глюконата (CHG)/ 70% изопропиловый спирт (IPA)) .
5. Анестезия биопсии сайт с 1% лидокаина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения лидокаина в скелетную мышцу.
6. Сделайте путь разреза на 4-мм мм на отмеченном участке.
7. После того, как область обезболлена, нажмите бергстром иглу с трокаром через фасцию в живот мышцы (примерно 2-3 см).
8. Нарисуйте мышечную ткань в иглу Бергстром, снимая режущий трокар 2-3 см, в то время как помощник применяет всасывание, снимая прикрепленный 60 мл шприца поршени.
9. Закройте режущей камеру.
10. Поверните основание биопсии иглы четверть оборота и повторить последовательность открытия иглы, применения всасывания, и закрытие иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз, когда игла закрыта, разрез мышечной ткани должны быть получены внутри иглы Бергстром. Во время сбора образцов, игла будет оставаться в бедре в том же вертикальном положении, в то время как она вращается продольно через 360 ", чтобы получить каждый образец. Эта последовательность может быть повторена 3–4 раза.
11. Изгоните собранную биопсию ткани из иглы в стерильную непридерживательную повязку.
12. Изучите ткани и удалите любые видимые жировые и фиброзные ткани с помощью стерильных лезвий скальпеля или пинцета.
13. Поместите часть (50–100 мг) ткани в стерильную трубку, содержащую CO₂-независимую питательную среду (например, Hibernate A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вес ткани определяется следующим образом. Первое место ограничен трубки, содержащие питательную среду по шкале и табер. Затем поместите ткань в трубку, подвешите трубку, а затем взвесьте трубку, содержащую ткани в питательной среде.
14. Храните трубку, содержащую ткани и питательную среду при 4 градусах Цельсия до обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань биопсии должна быть обработана в пределах 48 ч от сбора.

2. Изолирование клеток-прародителей мышц человека из биопсии ткани

1. Биопсия ткани фарша.
   1. Перенос мышечной ткани из питательной среды в стерильную чашку Петри в шкафу биологической безопасности или аналогичном стерильном рабочем месте.
   2. Используйте стерильные лезвия скальпеля, чтобы фарш ткани в 1 мм³ штук.
2. Вымойте рубленую ткань биопсии для удаления остаточного мусора.
   1. Перенесите мышечную ткань в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 10 мл фосфатно-буферного сосудистого раствора (PBS) и дайте ткани осесть через гравитацию.
   2. Аспирировать супернатант быть осторожным, чтобы не нарушить мышечной ткани.
   3. Добавьте 10 мл PBS в промытую ткань и дайте мышечной ткани переселиться через гравитацию.
   4. Аспирировать супернатант быть осторожным, чтобы не нарушить мышечной ткани.
   5. Добавьте 10 мл модифицированной среды Eagle (DMEM) с низким содержанием глюкозы Вольбекко (DMEM) и дайте ткани переселиться через гравитацию.
   6. Аспирировать супернатант быть осторожным, чтобы не нарушить мышечной ткани.
3. Инкубировать ткани в дайджест-носителе.
   1. Приостановить мышечной ткани в 3 мл дайджест анакоподносителя (2 мг/мл коллагеназа D при низкой глюкозе DMEM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеназа D фондовые растворы могут быть подготовлены при 20 мг/мл в низкой глюкозы DMEM и храниться при -80 градусах По Цельсию, а затем разбавленного 1:10 в низком уровне глюкозы DMEM во время использования.
   2. Инкубировать трубку, содержащую мышечную ткань в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
   3. Тритурегировать подвеску мышечной ткани каждые 10 минут с помощью серологического пипетки объемом 10 мл или широкой пипетки.
   4. Добавьте 83 л дополнительных дайджестовых носителей и 24 л раствора диспаса (0,76 мМ ацетата кальция, 1,39 мМ ацетат натрия, 13,91 мг/мл диспази II при низком уровне глюкозы DMEM). Верните подвеску на водяную ванну 37 градусов.
   5. Тритурегируйте суспензию мышечной ткани каждые 5–10 минут с широким наконечником трубача.
   6. Продолжайте тритурацию до тех пор, пока не будет достигнута однородная суспензия, и не более 1,5 ч, чтобы предотвратить переварение пищеварения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточное измельчение тканей и ферментативная активность коллагеназы и диспазы могут повлиять на пищеварение образцов. Однородный суспензии должен быть в состоянии пройти через нормальный кончик пипетки с минимальным окклюзии после 1,5 ч. Если однородная суспензия не достигается после 1,5 ч, дважды проверьте, достаточно ли измельчения тканей, и ткань измельчается до соответствующего размера (шаг 2.1.2). Кроме того, активность ферментов должны быть проверены, как много много вариации в ферментативной активности происходит.
4. Клетки пеллета и замораживание в восстановительных носителях.
   1. Добавьте 6 мл средств роста (GM; 79% ветчины F12, 20% фетальных сыворотки крупного рогатого скота, 1% пенициллин / стрептомицин, 5 нг / мл основной фактор роста фибробластов "bFGF", pH 7.4, прошел через фильтр 0,22 мкм) в суспензию.
   2. Pipette подвески через 70 мкм ячейки ситечко в 50 мл конической трубки. Промыть ситечко дополнительными 4 мл ГМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может быть передан обратно в 15 мл конической трубки для удобства визуализации гранул. Больший объем стирки может быть использован, если последующие выходы клеток являются низкими.
   3. Центрифуга при температуре 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
   4. Пусть супернатант быть уверенным, чтобы не нарушить гранулы. Флик трубки, чтобы повторно йет в оставшихся носителях. Если ячейки не собираются культивироваться, немедленно приступайте к шагу 2.4.5 для инструкций по долгосрочному хранению, в противном случае приступайте к шагу 3.1.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если желательная культура желательна, ГМ в пластинах клеточной культуры следует предварительно инкубировать (шаги 3.1.1 и 3.1.2) до начала биопсии.
   5. Добавьте 1,5 мл восстановления клеточной культуры замораживания средств(Таблица материалов) к восстановленным гранул.
   6. Перенесите суспензию в кривой. Поместите криовиальный в изопропанол контролируемых скорость охладитель ночь на -80 градусов по Цельсию. Храните криовые при -80 градусах По Цельсию до готовности к культуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Криовиалы, содержащие суспензию, могут храниться в жидком азоте для длительного хранения (больше 1 месяца). Использование изопропанола контролируемых скорость охладитель позволяет клеткам быть воспроизводимы заморожены со скоростью 1 КС / мин в результате оптимальных темпов восстановления клеток, о чем свидетельствует жизнеспособность после замораживания и повышенная вероятность привязанности к сосудам клеточной культуры⁹. Кроме того, можно использовать стакан, содержащий изопропанол RT, помещенный в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию.

3. Культивирование клеток-прародителей мышц человека

1. Оттепель мышечной суспензии.
   1. Перед оттаиванием и посевом HMPCs, предварительно уравновешенных клеточных культурных пластин в ГМ. Добавить 250 Л ГМ в 4 скважины коллагена покрытием (коллаген I), 24-хорошо клеточной культуры пластины. Заполните оставшиеся скважины 500 л стерильных базовых носителей (т.е. F12), чтобы предотвратить испарение во время долгосрочной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для биопсии от 50 г до 100 г, четыре колодца 24-хорошо пластины являются целесообразными. Если биопсия ткани меньше 50 г, две скважины могут быть более подходящими. Остаточный мусор и низкий номер ячейки предотвращает использование метода подсчета клеток на этом этапе; поэтому точная плотность посева не определяется и незначительно варьируется от биопсии до биопсии.
   2. Инкубировать сосуды культуры клеток с ГМ при 37 градусах По Цельсия в 5% CO₂ на 1 ч до посева.
   3. Удалить криовиалы из морозильной камеры -80 градусов и поместить в водяную ванну 37 градусов по Цельсию; жидкость в трубке должна быть полностью погружена в воду.
   4. При оттаивании почти завершена (5 мин), перенесите криовиальный на стерильный ламинарный капот потока. Перенесите мышечную суспензию из кривой трубки и добавьте в коническую трубку 15 мл, содержащую 6 мл предварительно разогретого ГМ со скоростью 1 мл/мин.
   5. Центрифуга мышечной суспензии на 300 х г в течение 5 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размахивая центрифуга ведро может сделать его легче визуализировать небольшие гранулы на этом этапе, но не является существенным.
   6. Пусть супернатант быть уверенным, чтобы не нарушить гранулы. Флик трубки, чтобы повторно йет в оставшихся носителей и повторно в 1 мл ГМ.
   7. Передача 250 л из перепровисаемых гранул (в настоящее время считается суспензией hMPC) на каждую из 4 скважин предварительно инкубированных 24-колодца плиты культуры клеток.
2. Культура и проход hMPCs.
   1. Поддержание культур hMPC в ГМ на 37 градусов по Цельсию в 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы ГМ без bFGF (т.е. F12, антибиотики, FBS) готовятся партиями и хранятся при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель. bFGF добавляется в ГМ в день использования. Медиа, содержащие bFGF, могут храниться в течение 48 ч при 4 градусах Цельсия.
   2. Двадцать четыре часа после изоляции, аспирировать ГМ, осторожно мыть культуры судна 2x с предварительно подогретых ГМ, и добавить свежий ГМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 24 ч должно обеспечить HMPCs достаточно времени, чтобы прикрепить; hMPCs не должны быть удалены после мытья. Этот шаг также удалит оставшийся мусор, который был создан во время сбора клеток, что сделает судно более поддающимся точному сканированию слияния с помощью цитометра изображений (раздел 5 ниже). После этого первоначального изменения мультимедиа, ГМ меняется каждые 48 ч.
   3. Прохождение HMPCs, когда 70% слияния достигается или когда они остались на той же культуре блюдо в течение 10 дней, в зависимости от того, что происходит в первую очередь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 70% слияние составляет примерно 55000 клеток / см².
   4. Для прохождения, добавить 250 л предварительно разогретого трипсина к каждому колодцу 24-хорошо плиты культуры клеток и инкубировать в течение 5 мин.
   5. Нажмите сосуд культуры клеток на твердую поверхность, чтобы отделить HMPCs. Легкий микроскоп может быть использован для проверки того, что HMPCs отсоединились.
   6. Перенесите подвески trypsin/hMPC до 5 мл ГМ в конической трубке 15 мл.
   7. Centrifuge подвеска hMPC на 300 x g в течение 5 мин на RT.
   8. Снимите суспензию hMPC с центрифуги и поместите на лед в стерильный ламинарный капот потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение HMPCs на льду во время прохождения приводит к меньшему скоплению клеток.
   9. Аспирный супернатант от HMPCs и аккуратно resuspend гранулы в 1 мл ГМ.
   10. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: 1:5 разбавления ячейки подвески для клеточного буфера подсчета, как правило, уместно.
   11. Семена hMPCs на коллагена покрытием культуры блюда, содержащие предварительно подогретых ГМ при плотности 3500 клеток на см². Идеально подходит сочетание 10 см пластин и 24-колодца пластин. 24-нуколой пластины могут быть сканированы ежедневно на цитометр изображения для мониторинга роста.
   12. Следуйте той же процедуре (начиная с шага 3.2.4.) для последующих проходов.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровье и чистота клеток можно контролировать через проходы с помощью маркера клеточного сенесценции (например, з-галактозидаза) и иммунонаблюдения для Pax7.
3. Криоконсервайте HMPCs.
   1. Криоконсервайте избыточные ячейки для последующего использования, чтобы сделать объем культуры более управляемым.
   2. Для криоконсервации следуйте процедуре трипсизации, описанной в шагах 3.2.4.-3.2.9.
   3. В то время как суспензия клеток центрифугируется, подготовьте смесь 20% (например, 200 л) диметилсульксида (ДМСО) и 80% (например, 800 л) ГМ. Пипетта вверх и вниз в 20 раз для обеспечения адекватного смешивания. Оставьте смесь на льду.
   4. Основываясь на количество клеток, разбавить подвеску hMPC до 2 х 10⁶/мл в ГМ.
   5. Смешайте подвеску hMPC и 20% стерильную Смесь DMSO/80% GM 50/50. Окончательный криоконсервации сми представляет собой сочетание DMSO (10%) и ГМ (90%) содержащий 1 x 10⁶ hMPCs/mL.
   6. Поместите 1 мл подвески hMPC, подготовленной в шаге 3.3.5 в столько криовиалов, сколько позволяет первоначальное количество клеток. Затем поместите aliquoted hMPCs в изопропанол контролируемых скорость охладитель в -80 градусов морозильник на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, как правило, от 5 до 15 миллионов клеток получаются, 30-60% из которых идентифицируются как HMPCs FACS.

4. Изолирование Pax7^- клетки-прародители мышц человека с помощью цитометрии потока

1. Чтобы подготовить HMPCs из живых культур (шаг 3.2.11), trypsinize достаточно культуры судов для 1 х 10⁶2 х 10⁶ общих ячеек. Подготовьте суспензии клеток, описанные в шагах 3.2.4-3.2.9.
2. Подготовка ГМпК из криоконсервированных культур (шаг 2.4.6 или 3.3.6).
   1. Выберите 1 х 2 трубки, содержащие 1 х 10⁶ проход четыре HMPCs для каждого донора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование прохода четыре HMPCs позволяет адекватной урожайности клеток в то же время поддержание пролиферативного потенциала до прохождения шесть(Рисунок 2).
   2. Быстро оттаивать клетки, удаляя их из морозильной камеры -80 градусов и помещая их в водяную ванну 37 градусов по Цельсию с жидкостью в трубке, полностью погруженной в воду.
   3. При оттаивании почти завершена (5 мин), перенесите HMPCs на стерильный ламинарный капот потока и перенесите содержимое клеточной подвески в 6 мл предварительно разогретого ГМ в конической трубке 15 мл со скоростью 1 мл/мин.
   4. Подготовьте суспензии клеток, описанные в шагах 3.2.7-3.2.9.
   5. Приостановить каждую гранулу в 3 мл буфера FACS (500 мл PBS, 12,5 мл нормальной сыворотки для коз, 2 мл 0,5 м EDTA, рН 7,4, прошел через фильтр 0,22 мкм).
   6. Центрифуга подвески ячейки на 300 х г в течение 5 мин на RT.
   7. Аспирный супернатант из HMPCs и аккуратно resuspend гранулы в 250 Зл буфера FACS; место на льду.
   8. Поместите 100 кл/л клеток в микроцентрифугную трубку 1,7 мл и оставьте на льду для использования в качестве живого/мертвого контроля (шаг 4.5.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 100 ul клеток, которые будут использоваться для живых / мертвых контроля может исходить от принятия небольшого объема (20 ul) из resuspended клеток от каждого донора для сортировки или из накренился клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не принимать более 20 ul из повторного клеток от одного донора. Принесите объем до 100 ul с буфером FACS, если имеется qlt; 100 ul ячеек.
3. Пятно HMPCs для маркеров поверхности клеток.
   1. Подготовьте следующий коктейль из антител (показанные суммы для каждой культуры, масштабируйте сятрелую): 5 Л. CD56 (молекула стыкания нейронных клеток (NCAM); PE-Cy7-конъюгированный) и 5 qL CD29 (No1-итегрин; AlexFluor488-конъюгированный). Окончательное разбавление антител 1:50.
   2. Добавьте 10 юрлиц коктейля к каждой подвеске hMPC и инкубировать на льду в течение 30 минут в темноте.
   3. Добавьте 10 мл буфера FACS к каждой смеси коктейлей подвески/антитела.
   4. Центрифуга каждая трубка на 300 х г в течение 5 мин на RT.
   5. Приостановите гранулы в 300 кЛ буфера FACS и перенесите в 5 мл круглой нижней полистироловой трубки.
   6. Держите подвеску на льду и защищены от света.
4. Подготовьте компенсационные бусы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положительный контроль для каждого антитела и отрицательный контроль (неокрашенные бусы) должны быть подготовлены с использованием компенсации бусы. Контроль компенсационных бисов должен работать на цитометре потока до того, как образцы будут отсортированы. Эти элементы управления позволяют определить, сколько фторхром от каждого антитела могут быть обнаружены в канале другого, так что компенсация может быть применена.
   1. Vortex компенсации бусы.
   2. В три микроцентрифуговых трубки мощностью 1,7 мл добавьте одну каплю (50 л) компенсационных бусинок.
   3. Добавьте 1 зл каждого антитела к соответствующей трубке, или нет отрицательного контроля.
   4. Инкубировать в темноте в течение 15 мин.
   5. Добавьте 1,5 мл буфера FACS к каждой трубке и вихрю.
   6. Центрифуга каждая трубка на 300 х г в скамейке центрифуги в течение 5 минут на RT.
   7. Аспирный супернатант и resuspend гранулы в 200 л буфера FACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы могут быть очень трудно визуализировать; следует принимать осторожность при успозировании супернатанта.
   8. Поместите подвеску в 5 мл круглой нижней пропастной трубки, а затем держать трубку на льду и защищены от света.
5. Подготовьте живые и мертвые элементы управления.
   1. Разделите 100 кЛ HMPCs от шага 4.2.8 в 2 пробки микроцентрифуги 1.7 mL (одно для управления в реальном маштабе времени и одно для мертвого управления).
   2. Поместите мертвую трубку управления в нагревательный блок предварительно нагревается до 70 градусов по Цельсию для В течение этого времени, держать живой контроль на льду.
   3. Центрифуга каждая трубка на 300 х г в скамейке центрифуги в течение 5 минут на RT.
   4. Аспирный супернатант и resuspend гранулы в 150 л буфера FACS.
   5. Объедините живые/мертвые элементы управления в одну 5 мл круглой нижней произносичная трубка.
6. Выполните жизнеспособность окрашивания.
   1. Добавьте 1 зл 7-аминоактиномицин D (7-AAD) ко всем трубам, содержащим клетки для сортировки и живому/мертвому контролю.
   2. Добавьте ГМ в коллагеновое покрытие с 24-ну х л (250 л/ну) и 10 см (8 мл/колодец) пластинии позволяют уравновесить в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия при 5% CO 2.
7. Сортировать HMPCs через цитометрию потока.
   1. Сортировать HMPCs на поток цитометра с 100 мкм сопло при давлении 20 пси. Определите живой hMPCS на основе бокового и переднего рассеяния, а также 7-AAD отрицательность (сортировка параметров и представитель рода можно увидеть на рисунке 3).
   2. Клетки, положительные для PE-Cy7 (780/60 нм) и AlexFluor488 (530/30 нм) представляют CD56^и/CD29 - клетки и, таким образом, являются положительными клетками Pax7 (HMPCs). Сортируйте двойные положительные клетки в трубки для сбора, содержащие 300 юаней подушки буфера FACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота отсортированных культур может быть определена путем иммуностоинга для Pax7, а затем ниже по течению потока цитометрии анализа(рисунок 4).
   3. Откажитесь от всех других ячеек.
   4. Перенесите отсортированные ячейки в коническую трубку 15 мл.
   5. Спин hMPC подвески на 300 х г в течение 5 мин на RT.
   6. Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend в 1 мл ГМ.
   7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя количество ячеек может быть выведено как число событий, которые положительно отсортированы, было установлено, что это количество завышает количество ячеек на 10–40% по сравнению с традиционными методами подсчета ячеек.
   8. Семя hMPCs, как указано в шаге 3.2.11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка чистоты популяции hMPC может быть определена путем иммунонаблюдения за Pax7 и анализа с помощью цитометрии потока.

5. Характеристика человеческой мышечной клетки-прародителя (hMPC) Культуры с помощью цитометра изображений

1. Используйте цитометр изображения (Таблица материалов) для выполнения сканирования слияния.
   1. Выберите Создать новое сканирование, а затем введите / выберите категорииплиты , плита профиля и идентификатора плиты. Цитометр изображения может вместить 96, 24 и 6 колодцев.
   2. В соответствии с приложением , выберите Слияние
   3. Выберите колодец для просмотра с помощью навигатора справа от экрана.
   4. Найти плоскость фокусировки, где клетки появляются белые по сравнению с фоном и выберите руководство регистра или позволить цитометр уитилика, чтобы выбрать плоскость фокусировки, выбрав регистравто.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 96 скважин, предложенных в таблицематериалов, приблизительное положение составляет 4,3 единицы.
   5. Используйте мышь, чтобы выделить все скважины, которые должны быть отсканированы. Вся область скважины будет автоматически отсканирована. Выберите стартовое сканирование.
   6. Выберите параметры анализа, оптимальные для типа пластины и ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для HMPCs оптимальны следующие параметры: интенсивность No 6, насыщенная интенсивность - 0, диаметр - 8, минимальная толщина - 3, размер скопления мин - 500, точность - высокая.
   7. Выберите стартовый анализ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально проверить изображения, чтобы убедиться, что пользователь и цитометр изображения согласны относительно периметра клеток. Если существует большое несоответствие, отсканируй пластину с помощью другой плоскости фокусировки или различных параметров анализа. Сканирование слияния может быть использовано для сравнения роста между культурами, время введения лечения, или для мониторинга клеток и решить, когда инициировать дифференциацию. При желании дифференциации приведены подробные сведения в разделе 6.
2. Используйте цитометр изображения для подсчета клеток.
   1. Подготовьте окрашивающий раствор, содержащий 12 мл F12, 6 л из Hoechst 33342 и 24 л йодида пропидиума.
   2. Аспирировать носители и заменить окрашивающим раствором, инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
   3. Аспирируете окрашивающее раствор и заменяете F12 Ham.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать средства массовой информации с низким уровнем фенола красный для получения четких изображений. Кроме того, PBS может быть использован.
   4. Загрузите пластину на цитометр изображения и под приложением, выберите жизнеспособность клетки В прямом эфире будет яркое полевая изображение, мертвым каналом будет пропидиум Иодид, а общий канал будет Hoechst 33342.
   5. Установите канал Live на яркое поле и нажмите Регистрация Авто под Focus Setup.
   6. Под каналом Total установите канал на синий цвет. Используйте Фокус Найти, чтобы привести ядра в фокус еили или использовать вверх и вниз стрелки вручную установить фокус. Нажмите Набор смещения, чтобы выбрать фокус.
   7. Под каналом Мертвых установите канал на красный цвет. Используйте Фокус Найти, чтобы привести мертвые клетки в фокус или использовать вверх и вниз стрелки вручную установить фокус. Нажмите Набор смещения, чтобы выбрать фокус.
   8. Выберите стартовое сканирование, чтобы начать сканирование.
   9. Выберите параметры анализа, подходящие для пластины и типа ячейки. Выберите стартовый анализ, чтобы начать анализ. После завершения анализа визуально убедиться, что анализ является надлежащим подсчетом клеток (например, для общего канала проверить, что каждое ядро признается в качестве ядра и что цитометр изображения не считывает каких-либо пятен в фоновом режиме, как ядра). Если сканирование и анализ являются удовлетворительными, верните пластину в инкубатор, в противном случае переесли или измените параметры анализа.

6. Дифференциирование клеток-прародителей мышц человека (HMPCs) на Myotubes

1. Определить слияние hMPC с помощью протокола в разделе 5.1. Для дифференцирования HMPCs в миотубеты, он идеально подходит для клеток, чтобы быть 80-85% слияния, как это определено функцией слияния на цитометр изображения (см. раздел 5). Если используются HMPCs от более чем одного уникального донора, сканирование слияния позволяет клеткам различных доноров начать дифференциацию в момент их достижения слияния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При слиянии 80%, Есть примерно 66000 клеток / см².
2. Вымойте клетки 2x с дифференциацией средств (97% ветчины F12, 2% лошадиной сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина, рН 7,4, прошел через фильтр 0,22 мкм).
3. Поддержание клеток в дифференциации средств до тех пор, как эксперимент диктует при переключении средств ежедневно.
4. Непосредственно оценить образование миотубевейта путем иммуно-спотления для эмбрионального миозина тяжелой цепи, которая, как правило, обнаруживается после 7-10 дней дифференциации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для формирования миотубев может немного отличаться в зависимости от донора и количества клеток при начале дифференциации; поэтому рекомендуется, чтобы культуры каждого донора контролировались индивидуально.

Representative Results

Представитель потока цитометрии результаты hMPC изоляции от мышечной ткани человека можно рассматривать на рисунке 1. hMPCs могут быть определены путем первого gating событий, основанных на боковой рассеяния и вперед рассеяния для устранения мертвых клеток или мусора, а затем выбрать только клетки, которые являются отрицательными для 7-AAD и, следовательно, являются жизнеспособными. Выбор клеток положительный для обеих маркеров поверхности клетки CD56 и CD29 представляет популяцию hMPC. Биопсия 60 мг обеспечивает только приблизительно 75–250 HMPCs.

Репрезентативное сканирование слияния показано на рисунке 2A. Зеленые очертания на рисунке 2B были созданы цитометром изображения и показывают, как цитометр изображения определял слияние на основе выбранных параметров анализа. На обоих показанных изображениях слияние, определяемые цитометром изображения, согласуется с слиянием, визуально определяемым пользователем. Тем не менее, эти изображения также подчеркивают, что цитометр изображения не является совершенным. Например, красная стрелка выделяет несовершенство пластины, которая считается клетками. Если большое количество этих несовершенств присутствуют на пластине, то полученное слияние не будет точно представлять слияние клеток. На рисунке 2C показано представление всех трех каналов, используемых для подсчета ячеек (яркого поля, синего и красного) и объединенного изображения. Рисунок 2D показывает неоднородность между донорами. Обнаружение и точное описание этой неоднородности является ключевым применением цитометра изображения. На рисунке 2E показано, что измерения слияния и количество ядер от уникальных доноров тесно взаимосвязаны.

На рисунке 3 содержится руководство по определению ГМпК на основе процедуры FACS, описанной в данном протоколе. Гатирование на основе переднего и бокового рассеяния позволяет отделить жизнеспособные клетки от мусора(рисунок 3A). Сравнение переднего рассеяния по высоте для переброска вперед по области было использовано для различения событий, представляющих одиночные ячейки (коробочная область на рисунке 3B). Жизнеспособные клетки отмечены отсутствием включения жизнеспособности пятно 7-AAD(рисунок 3C). Наконец, клетки, положительные как для CD56, так и для CD29, идентифицируются как HMPCs(рисунок 3D). Для проверки процедуры FACS, описанной в этом протоколе, отбор положительных клеток Pax7 может быть определен с помощью иммуностоизинирующих клеток с антителом Pax7 и измерения экспрессии на цитометре потока. Рисунок 4 сравнивает количество HMPCs, как определить По Pax7 иммуно-стоинизм(Рисунок 4A) по сравнению с процедурой FACS (Рисунок 4B) подробно в этом протоколе из той же популяции клеток. Рисунок 5 использует Pax7 иммуно-стинеризм и анализ с помощью цитометрии потока, чтобы показать обогащение Pax7 выражающих клетки в общей популяции после FACS(Рисунок 5A по сравнению с Рисунком 5B), а также поддержание числа Pax7 выражающие клетки после прохождения(рисунок 5B по сравнению с рисунком 5C).

hMPCs можно дифференцировать для того чтобы сформировать myotubes следующим разделом 6. Чтобы определить, поддерживают ли изолированные ГМпК миогенные клетки емкости, можно иммуноопрепаратами антитела, характерные для эмбриональной миозина тяжелой цепи, и визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Репрезентативные изображения эмбрионального миозина тяжелых цепных положительных миотетбюсов можно посмотреть на рисунке 6.

Рисунок 1 : Представитель потока цитометрии изображения для HMPCs сортируются непосредственно из мышечной биопсии ткани. (A) Область рассеяния стороны (y-оси) против области переднего рассеяния (x-оси) gating стратегия используемая для того чтобы определить все клетки в образце дарителя. (B) 7-AAD жизнеспособность пятно (y-оси) против переднего рассеяния (x-оси) для выявления живых клеток. (C) Отрицательный сортировка профиля выбора (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA »y-оси») против маркера выбора CD34. (D) Отрицательный маркер выбора CD34 (y-оси) по сравнению с положительным маркером отбора CD29. (E) Положительный маркер выбора CD56 (y-оси) по сравнению с положительным маркером выбора CD29 (x-оси). (F) Урожайность от трех различных биопсий скелетных мышц. FSC - рассеяние вперед; SSC - боковой рассеяние; hMPCs, клетки-прародители мышц человека.

Рисунок 2 : Пролиферативный потенциал ГМпК, полученных от человеческих доноров сохраняется после 6 проходов. (A) Сканирование представительства слияния. (B) Представитель слияния сканирования с зелеными очертаниями, показывающие, как цитометр изображения определяется слияние. Красная стрелка показывает несовершенство на пластине. (C) Представитель Brightfield, Hoechst 33342 (синий), и propidium Iodide (красный) окрашивание и слияние изображения этих трех каналов. Шкала баров No 1 мм. (D) Ядра рассчитывает от 6 уникальных доноров подчеркивает неоднородность hMPC. (E) Слияние и количество ядер сильно коррелируют. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Параметры цитометрии потока представителя потока для изоляции hMPC. (A) Область рассеяния стороны (y-оси) против области переднего рассеяния (x-оси) gating стратегия используемая для того чтобы определить все клетки в образце дарителя. (B) Высота рассеяния вперед (y-оси) против области переднего рассеяния (x-оси) для дисквалификации дублетов от сортировки населения. (C) Высота рассеяния вперед (y-оси) против 7-AAD включения для выявления жизнеспособных клеток. (D) PE-Cy7 (CD56) против AF488 (CD29) окрашивание с No 2 представляющих двойные положительные клетки (HMPCs). Цвет представляет плотность событий.

Рисунок 4 : Сравнение положительности CD29/CD56 против положительности Pax7 в проходе 4 HMPCs от того же донора. (A) Граф (y-оси) против выражения Pax7 (x-оси). (B) Положительный маркер выбора CD56 (y-оси) против положительного маркера выбора CD29 (x-оси). NCAM - молекула срахи нервной клетки; hMPC - клетка-прародительа мышц человека.

Рисунок 5 : Положительность Pax7 поддерживается в HMPCs, полученных от одного и того же донора в течение нескольких проходов. (A) Выражение Pax7 (x-оси) ячеек, которые были проложены 4 раза до сортировки FACS. (B) Выражение Pax7 (x-оси) hMPCs 1 проход после сортировки FACS для CD29 и CD56 положительность (5 всего проходов). (C) Выражение Pax7 (x-оси) hMPCs 2 прохода после сортировки FACS для CD29 и CD56 положительности (6 полных проходов).

Рисунок 6 : Окрашивание hMPC производных миотубев для эмбрионального миозина тяжелой цепи. Представитель микроскопических изображений дифференцированных HMPCs совместно окрашенных с днк пятно (Hoechst 33342, синий) и эмбриональных миозина тяжелой цепи (зеленый) (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Первичные HMPCs являются важной исследовательской моделью, используемой для понимания биологии скелетных мышц и регенеративного процесса. Кроме того, HMPCs имеют потенциал для использования для терапии. Тем не менее, Есть признанные проблемы в использовании первичных HMPCs для исследований и терапии, в том числе ограниченное понимание клеток, полученных от людей¹⁰. Существует также большая степень вариации в расширении потенциала среди культур доноров, что ограничивает потенциал для использования HMPCs и может повлиять на результаты исследований¹¹. Например, недавно было продемонстрировано, что HMPCs изолированы с помощью метода, описанного в этом протоколе производства клеток, которые различаются по расширению потенциала, и это было обусловлено транскрипционный профиль, который не согласуется с полом или возраст¹¹.

Здесь мы представляем эффективный и высокоурожайный метод изоляции HMPCs в достаточном количестве для ряда приложений вниз по течению, включая дифференциацию на миотубины, тем самым моделируя миогенный процесс in vitro. Наш метод опирается на FACS, чтобыизолировать клетки CD56 /CD29, которые ранее были определены как представляющие обогащенный Pax7, выражающий население¹². Другие не менее действительные стратегиисортировки ячеек также были описаны 5,⁶.

Наиболее важным аспектом нашего метода изоляции и культуры hMPC является тщательный мониторинг отдельных культур. Неоднородность, основанная на донорах, включает в себя количество ГМпК, полученных в ходе каждой биопсии, их время для инициирования распространения в пробирке и темпы их расширения популяции. Поэтому, если различия в формировании миотубетов после лечения является вопросом интереса человека, hMPC культур следует переключить на лечение на основе уровня слияния определяется априори и оценивается объективно с помощью цитометра изображения.

Наш метод изоляции и культуры HMPCs был оптимизирован для получения урожайности клеток в миллионах для экспериментов в пробирке от относительно небольшой стартовой биопсии ткани (50–100 мг). Основным преимуществом этого подхода является то, что несколько анализов и экспериментов могут быть выполнены на HMPCs от одного и того же донора, что позволяет для поддержания фенотипа доноров через эксперименты, в то время как введение мало межэкспериментальной изменчивости. Наш метод отличается от недавно опубликованных методов, которые сосредоточены на извлечении чистейших популяций Pax7 выражая клетки непосредственно из ткани биопсии, где основное внимание ксенотрансплантации⁸. Проблема с этими предыдущими методами однако, что они требуют стартового веса ткани больше чем один грамм. Таким образом, они не практичны для исследований, связанных с биопсией скелетных мышц человека. Одним из ограничений нашего метода является то, что потенциал для ксенотрансплантации не была оценена. Однако этот тип процедуры не был одним из исходных приложений, предназначенных ниже по течению. Будущие направления этого метода могут включать оценку возможности прививок HMPCs, после прохождения нашей процедуры изоляции, чтобы определить, есть ли потенциал для использования этой процедуры в исследованиях трансплантации MPC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100x Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings