Summary
Här presenterar vi ett lätt tillämpbart protokoll för att bedöma lagrings stabiliteten hos extracellulära vesikler, en grupp av naturligt förekommande nanopartiklar som produceras av celler. Vesiklarna är laddade med glukuronidas som modell enzym och lagras under olika förhållanden. Efter lagringen utvärderas deras fysikalisk-kemiska parametrar och aktiviteten hos det inkapslade enzymet.
Abstract
Extracellulära vesikler (EVs) är lovande mål i aktuell forskning, som ska användas som läkemedel, läkemedel-bärare, och bio markörer. För deras kliniska utveckling är inte bara deras farmaceutiska aktivitet viktig utan även deras produktion måste utvärderas. I detta sammanhang fokuserar forskningen på isolering av EVs, deras karakterisering, och deras lagring. Det nuvarande manuskriptet syftar till att tillhandahålla ett lättsamt förfarande för bedömning av effekten av olika lagrings förhållanden på EVs, utan genetisk manipulation eller specifika funktionella analyser. Detta gör det möjligt att snabbt få ett första intryck av stabiliteten hos EVs under en given lagrings förhållanden, och EVs som härrör från olika cell källor kan jämföras lätt. Stabilitets mätningen baseras på de fysikalisk-kemiska parametrarna för EVs (storlek, partikel koncentration och morfologi) och bevarandet av deras last. Den senare bedöms av saponin-medierad inkapsling av enzymet beta-glukuronidas i EVs. Glukuronidas fungerar som ett surrogat och möjliggör en enkel kvantifiering via klyvning av en fluorescerande reporter molekyl. Det nuvarande protokollet kan vara ett verktyg för forskare i sökandet efter lagrings förhållanden som optimalt behåller EV egenskaper att avancera EV forskning mot klinisk tillämpning.
Introduction
EVs är membran bundna nanopartiklar som produceras av nästan alla cell typer. För däggdjurs celler kan EVS indelas i två huvud grupper med skilda produktions kedjor1,2. Membran vesikler, med en storleks intervall från cirka 100-1000 Nm, produceras genom direkt spirande från cell membranet. Exosomer, storlek 30-200 nm, härstammar från multivesikulära kroppar som bildas genom inåtgående i endosomer som därefter smälter samman med cell membranet för att frigöra flera exosomer samtidigt. Huvud funktionen hos dessa vesikler är transporten av information mellan cellerna3. För detta ändamål, laster som RNA, DNA, och proteiner är aktivt sorteras in i dem. EVs kan förmedla en mängd effekter på sina mål, med konsekvenser för både hälsa och sjukdoms tillstånd. På ena sidan, de förmedlar positiva effekter såsom vävnadsregenerering, antigen presentation, eller antibiotika effekter, vilket gör dem gynnsamma mål för deras utveckling som Therapeutics4,5. Å andra sidan kan EVS främja tumör vascularization6, inducera åskådare effekter i stress svar7, och kan spela en roll i autoimmuna sjukdomar8 och inflammatoriska sjukdomar9. Sålunda, de kan vara en viktig del för en bättre förståelse för många patologiska effekter. Emellertid, förekomsten av förändrade EVS i många sjukdomar, såsom cancer10,11,12 och kardiovaskulära sjukdomar13, och deras lätt tillgänglighet i blod och urin gör dem idealiska Biomarkörer. Slutligen, deras goda biokompatibilitet14 och deras inneboende inriktnings förmåga gör EVS också intressant för läkemedels leverans15. I detta manuskript beskriver vi ett protokoll för utvärdering av lagrings stabiliteten hos EVs som härrör från däggdjurs celler, en viktig egenskap som fortfarande unders öks lite.
För den kliniska utvecklingen av EVs, det finns fortfarande många hinder för att övervinna16, inklusive utvärdering av deras terapeutiska effekter, produktion, rening, och lagring17. Medan-80 ° c är allmänt ses som den gyllene standarden för EV lagring18, de nödvändiga frysarna är dyra, och bibehålla den erforderliga kyl kedjan från produktionen till patienten kan vara utmanande. Dessutom visar vissa rapporter att lagring vid-80 ° c fortfarande inte optimalt bevarar EVS och inducerar en förlust i EV funktionalitet19,20. Andra metoder, såsom frys torkning21,22 eller spray-torkning23, har föreslagits som potentiella alternativ till fryst lagring av EVS.
Det optimala sättet att bedöma lagrings stabiliteten är att testa EVs i funktionella analyser eller genom att utvärdera en specifik markör, till exempel deras antibakteriella aktivitet19. Detta är möjligt när den önskade effekten av vesikler är känd och när en distinkt grupp av EVs ska studeras. Om EVs från olika cell källor ska jämföras (t. ex. för läkemedels inkapsling) eller om det inte finns någon känd funktionell avläsning, är det inte längre möjligt att bedöma förändringar på grund av lagring på ett direkt sätt.
Å andra sidan, helt enkelt utvärdera förändringar i deras fysikalisk-kemiska parametrar, såsom storlek, partikel återvinning, och protein koncentration, inte alltid förutsäga förändringar i EV aktivitet, som har visats i ett nyligen patent20.
Här ger vi ett lätt tillämpbart protokoll för att mäta lagrings stabiliteten hos EVs genom att bedöma deras fysikalisk-kemiska parametrar kombinerat med aktiviteten hos ett inkapslat beta-glukuronidas-enzym som ett surrogat för last av EVs. Belastningen av enzymet sker genom saponin inkubation, en mild metod som fastställts med EVS från olika källor21,24,25. Saponin bildar övergående porer i EV-membranet, vilket möjliggör enzym upptag i vesikeln. Som enzymer är benägna att förlora sin verksamhet om de utsätts för ogynnsamma lagrings förhållanden, de är en idealisk surrogat för utvärdering av bevarandet av funktionella laster av EVs.
Vi har visat att tillämpningen av detta protokoll till EVs härrör från mänskliga mesenkymala stamceller (MSCs), mänskliga navel Strängs endotelceller (HUVECs), och mänskliga adenocarcinom alveolära epitelceller (A549) faktiskt resultera i stora skillnader i lagrings stabilitet mellan olika cellinjer, vilket bör beaktas vid val av EV-källa21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell odling och produktion av cell-konditionerat medel
- Generellt, odla celler under de individuella förhållanden som krävs för respektive cellinjen.
- Odla cellerna för 24-72 h i serum fria förhållanden eller i medium som innehåller EV-utarmat Foster nötkreatur serum (FBS).
Anmärkning: om EV-utarmat FBS används, använda en metod som visat sig effektivt bryter serumet, för att förhindra kontaminering med nötkreatur serum-derived EVs26. - Samla in mediet från kolvar. Centrifugera vid 300 x g i 10 min för att pelletera cellerna. Samla försiktigt in det cellbetingade mediet (CCM), utan att störa pelleterade celler. Använd gärna CCM direkt, eller förvara den över natten vid 4 ° c.
Obs: det är alltid bättre att använda nyproducerad CCM. Om lagring under längre tids perioder inte kan kringgås bör alla relevanta parametrar registreras i enlighet med MISEV2018 rikt linjer26, och de eventuella fördomar som erhållits av de erhållna resultaten måste beaktas. - Exempel protokoll för HUVECs
- Odla HUVEC celler för 120 h i EGM-2 medium som innehåller FBS och andra kost tillskott.
- Odla HUVEC celler för 48 h i EBM-2 basal medium fri från eventuella ytterligare kost tillskott.
- Samla upp mediet ur kolvar och utför centrifugeringssteget enligt ovan (steg 1,3). Använd vanligt vis 100 mL medium för en EV-isolering.
2. ultracentrifugation av kaustik kalcinerad magnesium oxid
- Omedelbart före ultracentrifugering (UC), Centrifugera CCM i 15 min vid 3 000 x g och 4 ° c för att avlägsna cell skräp och stora agglomerater.
- Överför försiktigt supernatanten till UC-rören. Om du använder en fast vinkel rotor, markera riktningen på rören i centrifugen för att under lätta hämtning av EV pelleten efter UC. Centrifugera i 2 timmar vid 120 000 x g, med en k-faktor på 259,4.
- Efter UC, Kassera supernatanten försiktigt med ett serologiskt pipet, för att undvika störning av de pelleterade EVs.
Obs: pelleten kan vara osynlig. - Tillsätt 200 μL av 0,2 μm-filtrerad fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till det första röret och Använd PBS och restsupernatanten för att resuspendera pelleten genom att Pipettera upp och ner. Överför den resulterande EV-avstängningen till nästa tub i respektive prov och Använd den för omsuspension. Fortsätt på detta sätt att omsuspendera alla EVs av provet i en slutlig volym av cirka 300-350 μL.
- Efter resuspension, bekräfta närvaron av partiklar av Nanopartikel spårnings analys (NTA). Använd inställningarna som optimerats för den givna EV-typen, till exempel inställningarna nedan (steg 2.5.1).
Obs: tidningarna av gardiner et al.27 och vestad et al.28 innehåller värdefull information om hur man optimerar parametrarna för mätning av EVS.- För att återge de resultat som beskrivs nedan, Använd instrument (t. ex. NanoSight LM14) utrustad med en grön laser. Spela in tre videor på 30 s med en skärm vinst på 1,0 och en kamera nivå på 13. För analys, Använd en skärm förstärkning på 1,0 och en detektions tröskel på 5.
- Använd pelleten omedelbart, om möjligt; förvara den vid 4 ° c över natten.
3. inkapsling av glukuronidas i EVs
- Till den återsuspenderade pelleten, tillsätt beta-glukuronidas (10 mg/mL i PBS) till en slutlig koncentration på 1,5 mg/mL och saponin (10 mg/mL i H2O) till en slutlig koncentration på 0,1 mg/ml. Blanda väl med vortexa för 3 s.
- Inkubera i 10 min vid rums temperatur med förinerad blandning genom att försiktigt snärta röret. Efter inkubation, direkt rena efter storlek-uteslutningskromatografi (SEC) (se avsnitt 5).
Anmärkning: frys inte upp glukuronidasprover när de har tinat, för att förhindra enzym nedbrytning på grund av frysning.
4. lipoviss produktion
- För att förbereda liposomer för jämförelse med EVs, lös 1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-fosfokolin (dmpc) och 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-FOSFOKOLIN (dppc) i en 2:3 molar ration i kloroform till en slutlig koncentration på 5 mm. Förbered 1 mL Ali kvoter i högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) injektions flaskor och låt dem torka över natten för att bilda en lipid film.
Varning: kloroform är giftigt och misstänks vara cancerogena. Vidta lämpliga försiktighets åtgärder vid hantering av den. - Återfukta lipidfilmen med 1 mL PBS innehåll ande 1,5 mg/mL glukuronidas. Värm den till 42 ° c och skaka i 1 min. Värm extruderenheten till 42 ° c och extrudera lipidfjädringen 11x genom ett 200 nm polykarbonatmembran. Direkt rening av SEC (se avsnitt 5).
5. rening av SEC
- Förbered SEC-kolumnen med hjälp av följande protokoll.
- Använd endast färskt renat vatten och nyberedda buffertar. Filtrera alla buffertar genom ett 0,2 μm membran filter och Degas dem för att förhindra bildandet av luft bubblor i kolonnen.
- För beredning av en SEC kolumn, Använd AGA ros gel filtrering-baserad matris (t. ex. sepharose cl-2b) eller annan SEC medium lämplig att separera EVS och liposomer från protein föroreningar och överskott enzym. Först, ta bort 20% EtOH lösning mediet lagras i, för att förhindra luft bubbla formation i kolumnen. För detta ändamål, Centrifugera SEC mediet på 3 000 x g för 10 min, ta bort EtOH, och ersätta den med avgasas vatten.
- Fyll en glaskolonn (med en innerdiameter på 10 mm) med SEC-mediet till 15 mL-markeringen.
Obs: volymerna kommer att skilja sig för kolumner med olika dimensioner. Se till att låta gelen bosätta sig helt. - Före en körning, jämvikt kolumnen med minst två kolumn volymer PBS. För att lagra kolonnen, tvätta först den med en kolumn volym vatten, följt av minst två kolumn volymer på 20% EtOH. Efter förvaring, Tvätta kolonnen först med en kolumn volym vatten innan jämvikt med PBS.
- Använd upp till 400 μL EV eller Liposom SUS pension i en separation. Samla fraktioner av 1 mL. Efter SEC, antingen förvara de renade EVs (se avsnitt 7) eller utsätta dem för en glukuronidasanalys (se avsnitt 6).
- Bekräfta separation av EVs och liposomer från kontaminerande proteiner och fritt glukuronidas. I detta syfte korrelerar partikel koncentrationen av de insamlade fraktionerna med protein koncentrationen och glukuronidasaktiviteten.
- Bedöm partikel koncentrationen med NTA (se 2,5)
- Bedöm proteinhalten med bicinchoninic Acid (BCA)-analys eller annan lämplig proteinkvantifieringsanalys. Utför analysen enligt tillverkarens protokoll.
- Bedöm glukuronidasaktiviteten genom glukuronidasanalys (se avsnitt 6).
- Alternativt, bedöma EV morfologi av transmission elektronmikroskopi (TEM) och scanning elektronmikroskopi (SEM).
- För beredning av TEM prover, tillsätt 10 μL EV SUS pension till ett TEM rutnät, Inkubera i 10 min, och sedan blot bort överflödig vätska med hjälp av ett filter papper. Utför fixeringen i 10 minuter med 10 μL 4% paraformaldehyd och torka bort eventuellt överskott. Tvätta 3x med vatten. Färga vesikler med 20 s inkubation med 30 μL 1% fosfor-tungstic Acid hydrat. Efter blotting bort överskottet, torka vesikler över natten. Visualisera genom TEM.
Varning: fosho-tungstimsyra är mycket frätande; därmed, skydda huden och ögonen. - För SEM, fixa de tidigare preparerade tem proverna på kol skivor och spotta dem med en 50 nm tjockt guld lager. Visualisera av SEM.
- För beredning av TEM prover, tillsätt 10 μL EV SUS pension till ett TEM rutnät, Inkubera i 10 min, och sedan blot bort överflödig vätska med hjälp av ett filter papper. Utför fixeringen i 10 minuter med 10 μL 4% paraformaldehyd och torka bort eventuellt överskott. Tvätta 3x med vatten. Färga vesikler med 20 s inkubation med 30 μL 1% fosfor-tungstic Acid hydrat. Efter blotting bort överskottet, torka vesikler över natten. Visualisera genom TEM.
6. glukuronidasanalys
- För att möjliggöra en jämförelse mellan olika prover och lagrings förhållanden genom att korrelera partikel antal och enzym aktivitet, Mät först partikel koncentrationen i provet med NTA (se steg 2,5).
- Bered en arbets lösning av fluorescein di-β-D-glukuronid genom att tillsätta 1 μL av substansen (10 mg/mL i H2O) till 199 μl PBS. Tillsätt 25 μL av denna lösning till 125 μL renade EVs för att få en slutlig koncentration på 8,3 μg/mL. Pipet provet i en svart 96-well plattan. Mät tids punkt 0 h med en Plattläsare, med 480 nm som excitation och 516 nm som emissions våglängd.
- Täck plattan tätt (t. ex. med genomskinlig plastfolie som används för PCR-plattor) för att minimera avdunstning och inkubera i mörker under 18 h vid 37 ° c. Mät den fluorescein produktionen med hjälp av plattan läsaren parametrar som anges i steg 6,2.
7. förvaring av EVs och liposomer
Obs: för alla lagrings ändamål, är det lämpligt att använda lågbindande rör för att minska EV förlust på grund av adsorption.
- Följ parametrarna i det här avsnittet för att återge de representativa resultat som anges nedan. Använd prover som består av 400 μL EV-SUS pension.
- Förvaras vid 4 ° c eller-80 ° c eller gå vidare till stegen som anges nedan.
- Lyophilize den EVs.
- Tillsätt trehalos (40 mg/mL i H2O) upp till en slutlig koncentration på 4 mg/ml till de renade EVS. Frys proverna vid-80 ° c i minst 1 h.
- Lyophilize proverna med hjälp av följande parametrar. För huvud torkning, Ställ in hylltemperaturen till 15 ° c och tryck på 0,180 mbar och låt proverna torka i 46 h. För slutlig torkning, Ställ in hylltemperaturen till 25 ° c och tryck på 0,0035 mbar och låt proverna torka i 2 h. Förvara de frystorkade proverna vid 4 ° c.
- För att rehydrera proverna, tillsätt H2O, lika med mängden EV-SUS pension som finns i början (typiskt, 400 μl). Använd inte någon buffert för rehydrering.
8. analys efter förvaring
- För att bedöma enzym aktivitet, först ta bort den fria glukuronidas, som kan ha läckt ut från EVs under lagring. Uppnå detta genom ett ytterligare renings steg som utförs antingen av SEC (se steg 5) eller asymmetrisk flödesfraktionering (AF4) (se steg 8.1.2).
Anmärkning: Observera att båda metoderna leder till en utspädning av EV provet; Använd därför tillräckliga EV-koncentrationer före lagring för att undvika att gå under kvantifieringsgränsen för NTA. Räkna med en 1:10 utspädning av partiklarna på grund av SEC eller AF4.- För SEC-rening, Följ protokollet som beskrivs ovan (se avsnitt 5).
- Utför AF4 rening.
- Ställ in instrumentet med en liten kanal med en 350 μm spacer och en 30 kD molekyl vikt cut-off cellulosa membran. Placera ett filter med 0,1 μm porstorlek mellan HPLC-pumpen och AF4-kanalen. Använd nyberedd 0,1 μm-filtrerad PBS som den mobila fasen för att minska partikel belastningen och brus i ljus spridnings detektorer.
- Detektera proteiner med en UV-detektor inställd på 280 nm. För att detektera partiklar, Använd multiangle ljus spridning med lasern inställd på 658 nm.
- Använd följande körnings metod. Pre-fokus för 1 min med ett fokus flöde på 1 mL/min; injicera sedan 300 μL av provet med en hastighet av 0,2 mL/min och håll fokus flödet under 10 min. Efter injektionen, eluera provet vid 1 ml/min vid applicering av ett kors flöde som minskar från 2 ml/min till 0,1 ml/min under loppet av 8 min. eluera för ytterligare 10 min utan kors flöde. Samla fraktioner av 1 mL, med början efter 12,5 min och fortsätter tills 27 min.
- Utför glukuronidasanalysen enligt beskrivningen ovan (se avsnitt 6).
- För att bedöma storlek och koncentration, Använd NTA enligt beskrivningen ovan (se steg 2,5).
- Alternativt kan du utföra TEM och SEM för att bedöma EVs morfologi efter lagring (se 5,3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar lagrings egenskaperna hos EVS som Isoler ATS från huvecs. EVs isolerades av UC, glukuronidas inkapslades och efter SEC utvärderades de renade EVs för sina fysikalisk-kemiska egenskaper av NTA. Ett prov av vesikler utsattes därefter för AF4 rening och glukuronidasaktiviteten mättes.
Vesiklarna lagrades sedan i 7 d vid 4 ° c eller-80 ° c och vid 4 ° c i frystorkad form, i det senare fallet med tillsats av 4% trehalos. Efter lagringen mättes vesiklarna på nytt av NTA, och efter AF4 bedömdes den kvarvarande glukuronidasaktiviteten per partikel.
Arbets principen för AF4 är baserad på kombinationen av laminärt flöde och ett ortogonalt tvärflöde genom det porösa membranet på botten av AF4-kanalen, som Differentiellt påverkar partiklar beroende på deras storlek (figur 2). Större partiklar tenderar att placeras närmare membranet medan mindre partiklar ligger längre upp i kanalen. På grund av den paraboliska flödes profilen hos det laminära flödet, kommer partiklar längre bort från membranet att färdas snabbare mot detektorn, vilket leder till en partikel separation efter storlek. I ett typiskt AF4 experiment är de injicerade partiklarna först fokuserade på membranet, genom att tillämpa ett kors flöde utan ett longitudinellt flöde genom kanalen (figur 2a). Efter injektion och fokusering börjar elutionen genom att samtidigt Applicera ett kors flöde och ett longitudinellt flöde till fraktionera och eluera de olika del mängderna av partiklar (figur 2B), som i vårt fall var EVS och fritt glukuronidas.
Figur 3 illustrerar separationen av nanopartiklar (EVS eller liposomer) från kontaminerande proteiner och icke inkapslade glukuronidas. SEC-elueringsprofilen för liposomer (figur 3a) renad efter beredningen (se avsnitt 4 i protokollet) visade separationen av partiklarna med inkapslat glukuronidas från det fria enzymet, DETEKTERAD både genom BCA-analys och enzym aktivitet. I det här exemplet skulle fraktion 6 och 7 väljas för ytterligare experiment eftersom de innehöll de högsta partikelkoncentrationerna och för att förhindra eventuella kontamineringar med fritt glukuronidas. AF4 var också framgångs rik i att separera EVs från fritt glukuronidas som visats i figur 3B, med en högre grad av separation än SEC, vilket gör kontaminering av fraktioner som innehåller vesikler mindre sannolika.
I figur 4utfördes ett kontroll experiment för att säkerställa att den enzym aktivitet som mättes för vesiklarna verkligen var kopplad till inkapslingen av glukuronidas i EVS och inte orsakades av enzym aggregat. Dessa aggregat kan ha bildats på grund av inkubation av glukuronidas med saponin och leda till falskt positiva resultat. För att kontrol lera fraktioner där vesikler skulle eluera, utsattes renade EVs utan inkapslat glukuronidas för SEC på samma kolonn som provet som bara innehöll saponin och enzymet.
När glukuronidas inkuberades med saponin och därefter renades av SEC, hittades ingen enzym aktivitet i de fraktioner som vanligt vis innehöll EVs. Medan små mängder av partiklar konstaterades att eluera samtidigt som EVs (vilket utgör < 0,1% av partiklarna återvinns från en typisk EV pellet), det fanns ingen korrelera enzym aktivitet. Dessa resultat tyder på att aktivt enzym som återfanns i fraktioner som innehåller vesikler var inkapslat i dem.
Figur 5 jämför återhämtningen av det aktiva enzymet efter lagring med eller utan ytterligare af4 rening för att ta bort icke inkapslat färg ämne. Med AF4 rening, det finns i allmänhet en lägre återhämtning av enzym per partikel, med den högsta effekten för lagring vid 4 ° c, där återhämtningen sjunker med två tredjedelar. Därför kan utelämna detta ytterligare renings steg leda till felaktiga antaganden om enzymet stabilitet.
Figur 6 visar effekten av frystorkad utan en kryoprotectant på vesikler som härrör från MSCS, A549 celler, och liposomer, jämfört med frysning vid-80 ° c. Partiklarna avbildades av TEM och SEM enligt beskrivningen ovan (se steg 5,3 i protokollet). De MSCs och A549 EVs inte uppvisar stora skillnader i form i TEM bilder, jämföra de två lagrings förhållanden. I SEM-bilderna visade dock de frystorkade proverna mängder som inte hittades i proverna-80 ° c. Liposomer visas också aggregat i SEM bild, medan tem, frys torkning verkade inducera en storlek ökning av liposomer. Lyophilization utan kryoprotectants minskade också återhämtningen av intakt glukuronidas efter förvaring (figur 7). Tillsatsen av trehalos som kryoprotectant ökade återhämtningen av det aktiva enzymet på ett DOS beroende sätt.
Figur 8 visar omvandlingen av fluorescein di-β-D-glukuronid till fri fluorescein, som äger rum i glukuronidasanalysen. Medan educt var nonlys på 516 nm, fluorescein är mycket fluorescerande på denna våglängd. Detta tillät ett enkelt enzym aktivitets test med hög känslighet.
Figur 1 : Lagring stabilitet av HUVEC EVs. Apartikel återvinning jämfört med före lagring,bmedel storlek ochcnormaliserad glukuronidasaktivitet per partikel av EVS som Isoler ATS från huvecs. Vesikler lagrades för 7 d vid 4 ° c och-80 ° c och vid 4 ° c efter frys torkning med 4% trehalos. Medel storleken och partikel återvinningen mättes med NTA. glukuronidasaktiviteten per partikel beräknades genom att kombinera NTA-data och resultaten av glukuronidasanalysen och normaliserades till före lagring. Medelvärde ± SD, n = 3, *p < 0,05 (enkelriktad ANOVA följt av Tukey ' s post hoc-test). Modifierad från Frank et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Funktions duglig princip av af4. (A) EVS och fritt glukuronidas är fokuserade efter injektion genom att tillämpa ett kors flöde. (B) efteråt, EVS och fritt enzym elueras separat genom att kombinera flödet genom kanalen med ett kors flöde. Modifierad från Frank et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Separation av EVs och liposomer från fritt glukuronidas. (A) representativ SEC separation av glukuronidase-laddade liposomer, fri glukuronidas, och protein föroreningar. Grafen visar partikel koncentrationen (röd), protein koncentrationen (blå) och glukuronidasaktiviteten (grön). B) demonstration av separation av EVS från fritt glukuronidas. Obehandlade EVs, EVs spetsade med 0,05 mg/mL glukuronidas, fritt glukuronidas (0,5 mg/mL), och EVs laddad med glukuronidas och renas med SEC (EV glukuronidas) injicerades och analyserades av UV vid 280 nm och 90 ° ljus spridning. Fritt enzym elueras separat från EVs. Modifierad från Frank et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kontroll experiment för rening av EVs från fritt glukuronidas. 400 μL av infödda EVs eller 400 μL av 1,5 mg/mL glukuronidas i PBS inkuberas under 10 min med 0,1 mg/mL saponin renades med SEC. apartikel koncentrationer av de insamlade fraktionerna av vesikler respektive glukuronidas och enzym aktiviteten hos den renade glukuronidas. (B) UV-absorption vid 280 nm mätt i samma experiment. Den första lilla toppen för glukuronidas motsvarar den grå linjen i panel A. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Effekten av ytterligare renings steg efter EV-lagring. Kvarvarande glukuronidasaktivitet per partikel jämfört med D0 med eller utan ytterligare AF4 renings steg efter förvaring. HUVEC EVs lagrades för 7 d vid 4 ° c eller-80 ° c och frystorkade med 4% trehalos. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Tem och SEM bilder av EVs. TEM och SEM bilder av EVs från (a) MSCS och (B) A549 celler och (c) liposomer. Proverna lagrades för 14 d vid-80 ° c eller Lyofiliserad utan tillsats av trehalos. Pilar indikerar närvaron av morfologiskt förändrade partiklar i TEM-bilderna och aggregaten i SEM-bilderna. Modifierad från Frank et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Effekten av trehalos på enzym återhämtning efter lyophilization. Jämförelse av enzym aktiviteten efter frys torkning i 14 dagar, med 0%, 1% och 4% trehalos med provet före förvaring (0 dagar). Modifierad från Frank et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Den enzymatiska klyvning av fluorescein di-β-D-glukuronid genom glukuronidas. I systemet förklaras den reaktion som ligger till grund för detektion av glukuronidas. Icke-fluorescerande fluorescein di-β-D-glukuronid klyvs av glukuronidas. Genom avlägsnandet av sockerrester återfår fluorescein sina fluorescerande egenskaper. Fluorescensen mätt efter inkubations tiden korrelerar med mängden aktivt enzym som finns och är avläsning av glukuronidasanalysen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript presenterar vi ett omfattande protokoll för att studera stabiliteten hos EVs under olika lagrings förhållanden. Med en kombination av inkapslad glukuronidas som en funktionell avläsning och utvärdering av de fysikalisk-kemiska parametrarna hos de europeiska oberoende observatörs programmen, möjliggör protokollet en enkel bedömning av lagrings stabiliteten för EVs och jämförelsen mellan EVs från olika cell Linjer. SEM och TEM som komplementära metoder ger en inblick i förändringar av EVs på enpartikelnivå. De resultat som presenteras här visade en tendens av EVs och liposomer att aggregera på grund av frystorkad utan en kryoprotectant (figur 6). Detta observerades dock endast i SEM-experimenten. Medan EM Imaging inte genomfördes med prover som bevarades med trehalos, litteraturen tyder på att detta kryoprotectant kan faktiskt minska agg regering av EVs29. Det är också möjligt att bedöma, om ett givet lagrings tillstånd Differentiellt påverkar EV storlek, återvinnings graden och inkapslade molekyler. En sådan effekt exemplifieras av de resultat som erhållits för HUVEC EVs (figur 1). Medan partikel återvinningen för 4 ° c och-80 ° c var bättre än för de frystorkade proverna var återhämtningen av aktiv inkapslad glukuronidas bäst för de frystorkade proverna. Lyophilization av EVs kan vara mer gynnsamma lagrings förhållanden, till exempel när man analyserar EV bio markörer, där fokus är mer på att få och bevara intakt last snarare än på intakt blåsor.
I sin senaste artikel om den frystorkade av EVs22, charoenviriyakul et al. följt en jämförbar strategi. När det gäller de fysikalisk-kemiska parametrarna, fokuserade de på polydispertion index (PDI) och Zeta potential, som förändringar i Zeta potential kan korrelera med minskad kolloidal stabilitet. Dock kan Zeta potential inte enbart förklara observerade förändringar i stabilitet30, vilket också återspeglas i deras resultat. De jämförde också protein-och RNA-halten hos lagrade EVs av polyakrylamidelektrofores. Denna teknik kan mycket väl tyda på betydande förändringar i vesikelers protein-eller RNA-halt. Men det kräver mycket större mängder material än den metod som presenteras här. För att bedöma effekten av lagring på EV lasten, Charoenviriyakul et al. heterologously uttryckt ett enzym och DNA-arter vardera i sin EV producent cellinjen och övervakade deras verksamhet och integritet i EVs. Men sådana heterologa uttryck är inte lämpligt om EVs från olika källor ska jämföras, eftersom det kräver en avsevärd tid för varje ny cellinjen, medan den enkla saponin-medierad inkapsling kan lätt tillämpas.
Det är viktigt att ta bort alla icke inkapslat enzym, som visas i figur 3. EV-inkapslad glukuronidas reagerar mycket långsammare med sitt substrat än fritt enzym i lösning, vilket leder till en överskattning av inkapslings effektiviteten. Ren separation är särskilt viktigt för analysen efter lagring, eftersom lagrings förhållandena kan påverka aktiviteten av fritt glukuronidas i provet på olika sätt och kan leda till läckage från skadade EVs. Detta var uppenbart i våra experiment (figur 5), som tillämpningen av af4 innan glukuronidase analysen lyckades ta bort färgen inte inkapslad i vesikler. Således, det gjorde det möjligt att få tydliga resultat på effekten av de lagrings metoder som diskuteras här, medan utan AF4, den verksamhet förlust på grund av lagring skulle ha unders katt ATS.
En annan viktig faktor är isoleringen och karaktäriseringen av de EVs som ska testas för deras stabilitet. Även om den beskrivna tekniken möjliggör jämförelse av EVS från olika källor, är detta endast möjligt om alla av dem bereds av samma isolerings metod så att resultaten inte snedvrids18,31,32. I detta sammanhang måste även cell odlings förhållandena beaktas, eftersom de kan påverka mängden och bioaktiviteten hos de isolerade EVs33. För att få resultat som kan jämföras med andra publicerade resultat, är det lämpligt att konsultera den nyligen uppdaterade "minimal information för studier av extracellulär vesicles" som innehåller rikt linjer för harmonisering av EV forskning26.
I det protokoll som presenteras här, vi använde SEC eller AF4 för att ta bort det fria enzymet efter lagring. Andra metoder kan användas, såsom gradient ultracentrifugation, UC, eller ultrafiltrering34. Jämfört med centrifugalmetoder är SEC och AF4 mindre tids krävande (t. ex. ungefär 1,5 h för SEC inklusive kolonnjämvikt jämfört med upp till 16 timmar eller mer för lutning UC) och de kan helt separera fria proteiner från EVs i jämförelse med normal UC, där det alltid återstår restsupernatant med pelleten. Dessutom är SEC15 och af435 milda metoder, som inducerar mindre skjuvning stress på EVS. I jämförelse kan de krafter som läggs på EVS under UC leda till förändringar av partiklarna, såsom agg regering och förändringar i storlek34,36.
En nackdel med SEC och AF4 är utspädningen av proverna. Det är därför nödvändigt att isolera tillräckliga mängder av EVs för att bibehålla de koncentrationer som krävs för NTA-mätningar efter flera renings steg. EV fraktioner kan koncentreras med hjälp av centrifugalfilter, men beroende på filter material och protokollet, kan det finnas en förlust av vesikler37.
Begränsningen av protokollet som diskuteras här är att den endast övervakar enzym aktiviteten hos exogent inkapslat glukuronidas, varken med hänsyn till inkapslat RNA och DNA eller EV-ytproteiner som kan vara viktiga för funktionaliteten18 . För forskning av nya EV Therapeutics, denna teknik kan inte ersätta analyser på funktionalitet men komplimang dem och ge en indikation om vesikler stabilitet. Det kan vara till stor nytta om exempelvis EVs som härrör från biofluider skall lagras för senare analys av deras vesikelhalt.
I framtiden kan tillämpningsområdet för detta protokoll utvidgas till att även omfatta EVs som härrör från andra organismer, till exempel bakteriella yttre membran vesikler. Ett annat intressant nästa steg skulle vara att testa inkapsling av nukleinsyror genom saponin inkubation och att också undersöka stabiliteten i DNA eller RNA-laster.
Sammanfattnings vis erbjuder detta förfarande en enkel metod för bedömning av lagrings stabiliteten hos EVs från olika däggdjurs cells källor genom att integrera både en fysikalisk-kemisk och en funktionell avläsning. Detta detaljerade protokoll kommer att ge EV-forskare en enkel bestämning av lämpliga förvarings förhållanden för deras vesikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Den NanoMatFutur Junior forsknings programmet från det federala ministeriet för utbildning och forskning, Tyskland (Grant nummer 13XP5029A) stödde detta arbete. Maximilian Richter fick stöd av Studienstiftung des Deutschen Volkes (tyska akademiska stipendie stiftelsen) genom en Ph.D. gemenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
