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Immunology and Infection

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Aquí describimos una inmunocaptura indirecta de sándwich ELISA para determinar el contenido de glicoproteína inmunogénica en las vacunas contra la rabia. Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) que reconoce los recortadores de glicoproteína. Es una alternativa a la prueba in vivo de NIH para seguir la consistencia de la potencia de la vacuna durante la producción.

Abstract

La creciente preocupación mundial por el bienestar animal está alentando a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (OMCL) a seguir la estrategia 3R s para la sustitución, reducción y refinamiento de las pruebas en animales de laboratorio. Se recomienda el desarrollo de enfoques in vitro a nivel de la OMS y europa como alternativas a la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia. En la superficie de la partícula del virus de la rabia (RABV), los recortadores de glicoproteína constituyen el principal inmunogen para inducir anticuerpos neutralizantes virales (VNAbs). Se ha desarrollado una prueba ELISA, en la que los anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb-D1) reconocen la forma trimérica de la glicoproteína, para determinar el contenido de la glicoproteína trimérica plegada nativa junto con la producción de los lotes de vacunas. Esta prueba de potencia in vitro demostró una buena concordancia con la prueba de NIH y se ha encontrado adecuada en ensayos colaborativos por fabricantes de vacunas RABV y CLUFs. Evitar el uso animal es un objetivo alcanzable en un futuro próximo.

El método presentado se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando el mAb-D1 que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína RABV trimérica, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. mAb-D1 se utiliza tanto para el recubrimiento como para la detección de recortadores de glicoproteína presentes en el lote de vacunas. Dado que el epítopo es reconocido debido a sus propiedades conformacionales, la glicoproteína potencialmente desnaturalizada (menos inmunogénica) no puede ser capturada y detectada por el mAb-D1. La vacuna a probar se incuba en una placa sensificada con el mAb-D1. Las glicoproteínas RABV recortadas enlazadas se identifican añadiendo el mAb-D1 de nuevo, etiquetado con peroxidasa y luego revelado en presencia de sustrato y cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica.

Introduction

Desde hace más de 50 años, la prueba1 de NIH se utiliza como método estándar de oro para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia antes de la liberación por lotes. Esta prueba consiste en una inmunización intraperitoneal de grupos de ratones con la vacuna que se va a probar seguida de un desafío intracerebral (IC) 14 días después con la cepa del virus Challenge (CVS) del virus de la rabia (RABV). La potencia se evalúa a partir de la proporción de ratones que sobreviven al desafío IC. Aunque la OMS2 y la Farmacopea Europea3 todavía requieren la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna, esta prueba sufre varios obstáculos: los resultados son muy variables4; RABV infeccioso se utiliza durante el desafío y esto requiere tanto la habilidad técnica como estrictas medidas de bioseguridad; se utilizan un gran número de animales, y la gravedad del desafío plantea serias preocupaciones éticas5. Se ha desarrollado una variación menos grave de esta prueba: dos semanas después de la inmunización intraperitoneal, los ratones no son desafiados por IC, sino que se desangran y se analizan para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) en su suero mediante una prueba de neutralización in vitro. Sin embargo, esta prueba todavía requiere sacrificar un gran número de ratones de laboratorio, aunque ya está en uso para las vacunas veterinarias6,7 y se ha considerado para vacunas humanas8.

A partir de ahora, tanto las recomendacionesInternacionales 9 como las10 Europeas alientan a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (Laboratorios Oficiales de Control de Medicina - Omcl) a implementar la estrategia de reemplazo, reducción y refinamiento de pruebas en animales de laboratorio, denominada estrategia 3R. La Directiva Europea 2010/63/UE (en vigor desde 2013/01/01) relativa a la protección y el bienestar de los animales también ha reforzado las limitaciones para los fabricantes de vacunas y los laboratorios que participan en el control de calidad de las vacunas contra la rabia, así como en la investigación de la rabia11. Como resultado, el desarrollo, la validación y el uso de enfoques in vitro alternativos se han convertido en una prioridad. Estos no sólo son éticamente sólidos, sino que también pueden reducir los costos de pruebas por lotes y acortar el tiempo para los resultados a horas en lugar de semanas3.

En la superficie de la partícula RABV, la glicoproteína adopta una forma trimrica12,13,14,15,16. En la vacuna antirrábica, esta forma trimérica nativa constituye el principal vNAbs inductor de inmunogenes17, mientras que las glicoproteínas monoméricas, solubles o desnaturalizadas son poco inmunogénicas18,19. Por lo tanto, la preservación de los recortadores de la glicoproteína a lo largo del proceso de producción de la vacuna es un buen indicador para la preservación de un potencial inmunogénico óptimo. Varios métodos inmunoquímicos, como la prueba de unión de anticuerpos20,21, la prueba22 de inmunodifusión radial única y la prueba ELISA23,24,25,26,27 son recomendados por la serie2 de informes técnicos de la OMS y la monografía europea3 para cuantificar el contenido de antígeno según las vacunas contra la rabia. Estos son utilizados por los fabricantes para monitorear la consistencia de la producción de vacunas y por la OMCL para evaluar la formulación consistente de lotes de vacunas humanas28,, incluso si la prueba de NIH todavía se considera para la potencia.

Sin embargo, todos estos métodos inmunoquímicos no son equivalentes. La prueba DeSC requiere un pretratamiento que pueda alterar los trimers anclados por membrana y dar lugar a una forma soluble o desnaturalizada de la glicoproteína22,,29. Por lo tanto, la SRD no es muy eficiente para discriminar entre glicoproteínas inmunogénicas y no inmunogénicas, lo que resulta en una evaluación imperfecta de la inmunogenicidad de un lote de vacunas. Por el contrario, la prueba ELISA es más sensible22, conserva la estructura nativa de la glicoproteína, y es más apropiada para determinar el contenido de los trimers plegados de forma nativa de glicoproteína. La prueba ELISA puede utilizar anticuerpos antiglicoproteínamono monoclonales de conejo o monoclonales de ratón purificados o concentrados con sulfato de amonio. Los estudios han demostrado una buena concordancia entre la prueba de NIH y el contenido de antígeno evaluado por ELISA en vacunas y han concluido que los métodos ELISA son adecuados para la prueba de potencia in vitro. Esto aboga por que las pruebas ELISA puedan al menos complementar o incluso reemplazar la prueba4,26,27,30,31,32,33., Hoy en día, la Farmacopea Europea recomienda el uso de ensayos serológicos o inmunoquímicos validados como alternativas a la prueba3de los NIH. La evasión completa del uso animal para la potencia de la vacuna se ha convertido en una perspectiva realista.

El método que se presenta a continuación se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando un clon de anticuerpos monoclonales de ratón (mAb-D1) que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína rabórica15,,34. Este método fue desarrollado inicialmente en el Institut Pasteur26,30 luego optimizado y validado por el laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), es decir, el laboratorio francés OMCL4,,33. El mAb-D1 se utiliza tanto para sensibilizar la placa como para detectar posteriormente el antígeno capturado. Esto permite la cuantificación específica de los recortadores de glicoproteína, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. El mAb-D1 utilizado para la detección está etiquetado con peroxidasa, que se revela en presencia del sustrato y el cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica. Es de destacar que el mismo tipo de ensayo se puede aplicar para diferentes mAbs que reconocen diferentes sitios antigénicos de la glicoproteína RABV35. El método para obtener y purificar o concentrarse con globulinas policlonales de conejo policlonal de sulfato de amonio G (IgG) o monoclonales han sido ampliamente descritos anteriormente36 junto con el método para conjugar anticuerpos con peroxidasa37..

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Protocol

1. Precauciones de seguridad

NOTA: Este método es aplicable tanto a rabV vivo como a la vacuna inactivada.

  1. Utilice buenos procedimientos de práctica de laboratorio y seguridad.
  2. Use el equipo de protección personal (PPE) adecuado, incluyendo abrigo desechable, guantes, máscara, gafas, etc.
  3. Cuando el virus vivo esté valorado, utilice un armario de seguridad biológica de clase II.
    1. Considere cualquier material en contacto con las muestras (reactivos, soluciones de lavado, etc.) como material infeccioso.
    2. Tratar el material contaminado sumergiendo en la solución de lejía (2,5% de hipoclorito de sodio) durante 30 minutos para la descontaminación.
  4. Manipule los productos químicos de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio.

2. Preparación

  1. Utilice reactivos de grado analítico siempre que sea posible.
  2. Preparar soluciones frescas del tampón de recubrimiento/buffer de carbonato, tampón de pasivación, diluyente y tampón de citrato(Tabla 1),filtrar a través de filtros de 0,45 o 0,22 m y almacenar a 4 oC durante un día antes del uso para preservar su pureza analítica.
  3. Permita que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (+18 oC a +25 oC) 30 minutos antes del uso y homogeneizar mediante una mezcla suave antes del uso.

3. Sensibilización de microplacas

NOTA: Utilice 96 placas de inmunoensayo de adsorción de pozos que estén optimizadas para unir grandes cantidades de inmunoglobulinas (por ejemplo, véase Tabla de materiales).

  1. A cada pocto, añadir 200 l del anticuerpo monoclonal (mAb-D1) diluido en el tampón de carbonato.
    NOTA: Se ha determinado experimentalmente una concentración óptima de aproximadamente 1 g/ml que corresponde a una dilución aproximada de 1/2000 del mAb-D1 purificado. Esta concentración recomendada está indicada para cada lote mAb-D1 y debe verificarse periódicamente con el control positivo.
  2. Cubra la placa con una película adhesiva e incubar la microplaca durante 3 h a 37 oC en una atmósfera humidificada.
  3. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
  4. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 5 min.

4. Pasivación de microplacas

  1. A cada pocto, agregue 300 s de la zona de influencia de pasivación.
  2. Cubrir la placa con una película adhesiva e incubar durante 30 min a 37 oC.
  3. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
  4. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
    NOTA: La microplaca se puede utilizar o almacenar inmediatamente sellada a -20 oC durante un máximo de 3 meses hasta su uso.

5. Ensayo ELISA

NOTA: Para establecer la curva de control de la vacuna de referencia, no se requiere el paso 5.3; para valorar la vacuna probada todos los Pasos 5.1 a 5.6 son necesarios.

  1. Lavado de la microplaca sensituada
    1. A cada pocto, añada 300 s de la tampón de lavado.
    2. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    3. Repita los pasos 5.1.1 y 5.1.2 cinco veces más para lavar extensamente la placa sensituada.
    4. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
  2. Diluciones de la vacuna de referencia para la curva de control
    1. Reconstituir la vacuna de referencia (antígeno de validación Lote 09) en 1 ml de agua destilada correspondiente a una concentración de 10 g/ml de glicoproteína del virus de la rabia.
    2. Preparar una dilución de diez veces la vacuna de referencia reconstituida en el diluyente para alcanzar 1 g/ml de glicoproteína del virus de la rabia.
    3. Preparar 6 diluciones en serie dobles de esta vacuna de referencia en el diluyente, tal como se indica en la Tabla 1.
    4. Distribuir 200 l del diluyente por duplicado (pozos 1H/2H) para servir como control en blanco.
    5. Distribuir 200 ml por pozo de cada dilución de vacuna de referencia por duplicado (pozos G1/G2 a A1/A2).
  3. Diluciones de la vacuna probada para su valoración
    1. Preparar una dilución de diez veces la vacuna probada en el diluyente.
    2. Preparar 7 diluciones seriales dobles de la vacuna probada en diluyente como se indica en la Tabla 2.
    3. Distribuir 200 ml por pozo de cada dilución de vacuna probada por duplicado (pozos H3/H4 a A3/A4).
  4. Incubación/Lavado de la placa ELISA
    1. Cubra la microplaca con una película adhesiva e incubar durante 1 h a 37 oC.
    2. Retire la película, aspire cuidadosamente y transfiera el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga un 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    3. A cada pozo añadir 300 s de tampón de lavado.
    4. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    5. Repita los pasos 5.4.3 y 5.4.4 cinco veces para eliminar el antígeno no unido y conservar los recortadores de proteína G unidos al anticuerpo recubierto (mAb D1).
    6. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
  5. Encuadernación de la peroxidasa conjugada mAb-D1
    1. Distribuir 200 ml por pozo de la dilución recomendada (1/2000) de mAb-D1 etiquetado con peroxidasa en diluyente (concentración aproximada de 1 g/ml). Se indica una concentración recomendada para cada lote mAb-D1 y debe verificarse periódicamente con el control positivo.
    2. Cubra la microplaca con una película adhesiva e incubar durante 1 h a 37 oC.
    3. Retire la película, aspire cuidadosamente y transfiera el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga un 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    4. Añadir a cada pocá, 300 s de la tampón de lavado.
    5. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    6. Repita los pasos 5.5.4 y 5.5.5 cinco veces para eliminar el anticuerpo etiquetado con peroxidasa no unido (mAb D1).
    7. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
  6. Revelación usando un sustrato-cromógeno
    1. Distribuir 200 ml por pozo de solución de sustrato-cromógeno.
    2. Selle la microplaca con una película e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. Un color amarillo-naranja desarrolla la intensidad de la cual es proporcional a la cantidad de anticuerpo etiquetado peroxidasa (mAb D1).
    3. Detenga la reacción añadiendo 50 sl de solución de parada por pozo.
    4. Limpie cuidadosamente la parte inferior de la microplaca y colóquela en un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica (OD) a 492 nm de todos los pozos usados: control negativo (en blanco), vacuna de referencia y vacuna probada.
    5. Recopilar datos OD como formato de archivo .xls o .xlsx para su análisis.
  7. Dibujar la curva de la vacuna de referencia, el contenido de glicoproteína trimérica, en función de la densidad óptica (492 nm)
    1. Calcular la DoD media a 492 nm para cada duplicado en las diferentes diluciones de la vacuna de referencia (pozos G1/G2 a A1/A2 en la Tabla 2)
    2. Restar la Do media del espacio en blanco (pozos, H1/H2 en el Cuadro 2) de cada Do media calculada.
    3. Trazar los valores oD resultantes en el eje vertical (escala lineal) y la concentración correspondiente en los trimers de glicoproteína (ng/mL) en el eje horizontal (escala logarítmica).
    4. Dibuje la curva de referencia uniendo puntos (Figura 1).

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Representative Results

En el siguiente ejemplo se utiliza la vacuna de referencia Lote 09, que consiste en partículas purificadas del virus de la rabia inactivadas (cepa de vacuna PV). El contenido de los recortadores de glicoproteína (10 g/ml) en esto se ha establecido después de la determinación de la cantidad total de proteínas virales (prueba BCA) y la evaluación del porcentaje de la glicoproteína por electroforesis de gel de sDS-poliacrilamida. Alternativamente, se puede utilizar una vacuna de referencia calibrada, por ejemplo, la6a Norma Internacional (IS) de la OMS para la Vacuna contra la Rabia (código NIBSC: 07/162).

La Tabla 3 muestra los valores de OD (492 nm) para un experimento típico. Utilizando estos valores, la curva de la vacuna de referencia se dibujó trazando (1) la DO media (menos la DoC media del espacio en blanco) en las diferentes diluciones de la vacuna de referencia en el eje vertical (escala lineal); 2) la concentración de los recortadores de glicoproteína (ng/mL) en el eje horizontal (escala logarítmica) (Figura 1).

El contenido de glicoproteína de la vacuna probada se estima en comparación con esta curva de vacuna de referencia. La evaluación es precisa para la dilución de la vacuna probada dando un valor medio de DO en la parte lineal de la curva de la vacuna de referencia. En el experimento presentado(Figura 1), la parte lineal es de aproximadamente 1 a 2 OD(Tabla 3).

La dilución 1/40 de la vacuna analizada, con una DO media para muestras duplicadas de 1.534, es apropiada para una evaluación adicional. Cuando esta DoS se traza horizontalmente hasta el punto de intersección con la curva de la vacuna de referencia, la proyección vertical en el eje X corresponde a 500 ng/ml de glicoproteína. Teniendo en cuenta la dilución, la vacuna probada contiene

40 x 500 ng/mL a 20 g/ml de glicoproteína trimérica.

Actualmente, no existe una unidad internacional ELISA para el contenido de glicoproteína RABV. Sin embargo, la potencia in vivo de la vacuna de referencia, en unidades internacionales (UI/ml), se ha establecido utilizando la prueba NIH en comparación con la6a Norma Internacional de la OMS (código NIBSC: 07/162)4. Por consiguiente, la comparación de las DO medias entre la vacuna de referencia y la vacuna analizada no sólo permite medir la cantidad de glicoproteína trimérica de la vacuna analizada, sino que también evalúa la potencia in vitro estimada en la Unidad Internacional Equivalente (EIU/ml).

Utilizando el método ELISA descrito aquí, la OMCL francesa (ANSM) ha monitoreado el contenido de glicoproteína de más de 1000 lotes de vacuna contra la rabia humana que se liberarán en el mercado y se ha comparado con la prueba de NIH realizada en el sitio 4 delfabricante. La alta variabilidad de la prueba de NIH, debido a la heterogeneidad en ratones de cepa y procedimiento de desafío38, impidió una correlación estadística entre las dos pruebas. Sin embargo, se obtuvo una concordancia en el perfil de los resultados y las mismas conclusiones de pase/fallo utilizando ensayos in vitro e in vivo4. Esta concordancia confirma que los recortadores nativos de la glicoproteína reconocida por el mAb-D134,39 constituyen el principal inmunogen del virus de la rabia que induce AVNAbs durante la vacunación17. Estos VNAbs son capaces de proteger a los ratones del desafío intracerebral de la prueba de NIH. En conclusión, la evaluación in vitro del contenido de glicoproteína de la rabia es una alternativa atractiva a la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia.

Búferes y reactivos Preparación
Tampón de recubrimiento
(Búfer de carbonato 50mM pH-9.6)		 Añadir carbonato de sodio 50 mM (Na2CO3-10H2O) al bicarbonato de sodio 50 mM (NaHCO3) hasta el pH deseado (alrededor de 1/10 volumen de bicarbonato sódico)
Búfer de pasivación 0.3% Albúmina sérica bovina (BSA, fracción V), 5% sacarosa en tampón de carbonato 50 mM pH 9,6
10x Fosfato tamponado salino pH-7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g en 1L de agua destilada. Ajuste el pH 7 con 4N NaOH
Tampón de lavado 0.05% Tween en 1x PBS
Diluyente                                                  0.5% Albúmina de suero bovino (Fracción V), 0.05% Tween en 1x PBS (ajustar el pH a 7 debido a la acidificación por BSA)
Tampón de citrato pH-5.6
(para sustrato de peroxidasa)		 11,67 g Citrato trisódico-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2,17 g de ácido cítrico-1H20 en 1L de agua destilada
Solución de sustrato-cromógeno 50 mg Comprimido de ortho-phenylene diamine, 0,1% Peróxido de hidrógeno 30% (110 vol) en 25 ml Tampón de citrato pH 5.6
Solución de parada
(4N ácido sulfúrico)		 10 ml de H2SO4 36N en 80 ml de agua destilada enfriada. La dilución debe llevarse a cabo en un baño de hielo

Tabla 1. Búferes utilizados en el ensayo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un Vacuna 1/640 Vacuna 1/640 Vacuna probada 1/1280 Vacuna probada 1/1280
B Vacuna 1/320 Vacuna 1/320 Vacuna probada 1/640 Vacuna probada 1/640
C Vacuna 1/160 Vacuna 1/160 Vacuna probada 1/320 Vacuna probada 1/320
D Vacuna 1/10 Vacuna 1/10 Vacuna probada 1/160 Vacuna probada 1/160
E Vacuna 1/40 Vacuna 1/40 Vacuna probada 1/80 Vacuna probada 1/80
F Vacuna 1/20 Vacuna 1/20 Vacuna probada 1/40 Vacuna probada 1/40
G Vacuna 1/10 Vacuna 1/10 Vacuna probada 1/20 Vacuna probada 1/20
H Blanco Blanco Vacuna probada 1/10 Vacuna probada 1/10
Vacuna de referencia Lote 09 dilución Concentración (ng/mL)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tabla 2: Plan de microplacas para el ensayo de valoración de la glicoproteína de la rabia y las diluciones para las vacunas de referencia y probadas utilizadas en el ensayo.

Vacuna de referencia Lote 09 dilución Concentración (ng/mL) Dilución de vacunas probada Columna OD 1 Columna OD 2 Media de OD Media de OD de referencia- Media de OD en blanco
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Blanco Blanco 1/10 0.078 0.087 0.0825

Cuadro 3. Resultados obtenidos en OD492 nm para trazar la curva de referencia

Figure 1
Figura 1: Curva de referencia que muestra el contenido deglicoproteína trimérica en función de la densidad óptica (492 nm) de la vacuna de referencia.

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Discussion

El epítopo reconocido por el mAb-D1 se encuentra en el sitio antigénico III de la glicoproteína RABV, que no sólo es inmunodominante para la inducción de VNAbs, sino que también participa en neurovirulencia, patogenicidad40,,41 y reconocimiento de receptores42. Hay otro sitio antigénico importante a lo largo de la glicoproteína, sitio II43, contra el cual se han aislado varios MAbs como mAb-WI-111235. Estos también se pueden utilizar en el tipo similar de experimentos.

Una limitación de este método in vitro por ELISA reside en la necesaria conservación del epítopo reconocido por el mAb utilizado en la cepa del virus de la rabia que se va a probar. Hasta ahora, todas las cepas clásicas utilizadas para las vacunas contra la rabia humana son reconocidas por el mAb-D1. La mayor diversidad de cepas de rabia utilizadas en las vacunas animales puede constituir un problema en el futuro. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el mismo ensayo se puede aplicar utilizando diferentes mAbs reconociendo diferentes sitios antigénicos de la glicoproteína RABV para el recubrimiento y la detección. Esto permitirá eludir el problema35.

Otro punto sensible de este método, cuantificando la forma trimérica de la glicoproteína RABV, es el posible efecto del pH y la temperatura en la conversión de conformación reversible14. Estos parámetros se tienen en cuenta en el protocolo propuesto.

En resumen, la cuantificación de un epítopo altamente inmunogénico de recortadores de glicoproteína correctamente plegados por el método ELISA in vitro parece tan eficaz como la prueba de NIH para medir la capacidad de un lote de vacunas para inducir inmunidad humoral contra la infección por el virus de la rabia. Además, el método ELISA puede discriminar los lotes de vacunas subpotentes, en calidad o en cantidad, de los potentes4,,35. El último paso antes de proponer un ensayo ELISA in vitro para reemplazar la prueba NIH es la organización de un estudio colaborativo internacional para su mejora y estandarización.

Un taller del Comité De Coordinación Interagencial para) la Validación de Métodos Alternativos (ICCVAM) titulado Taller Internacional sobre Métodos Alternativos para Reducir, Refinar y Reemplazar el Uso de Animales en Pruebas de Potencia y Seguridad de Vacunas (Ames, septiembre de 2010)44, concluyó que la prueba de NIH debería sustituirse por una prueba in vitro alternativa que evalúe la inmunogenicidad vacunal y pueda discriminar entre lotes potentes y subpotentes4. Otro taller de la Asociación Europea de Alternativas a los Ensayos Animales (EPAA) en 201245 decidió que un sándwich estandarizado ELISA calibrado con respecto a la norma internacional de referencia de la rabia actual sería una alternativa ideal para las pruebas de potencia de la vacuna contra la rabia. A continuación, un estudio de prevalidación colaborativo internacional, en el que se encontraban tanto fabricantes como organismos reguladores, comparó varios diseños elISA utilizados por los fabricantes y sus Laboratorios Nacionales de Control para la liberación por lotes por su capacidad de discriminar subpotentes de los potentes lotes de diferentes marcas de vacunas35. La Dirección Europea para la Calidad de los Medicamentos y la Salud (EDQM) propuso un diseño ELISA que combinaba mAb-D1 (sitio antigénico III) y un mAb-WI-1112 diferente (sitio antigénico II) para un próximo estudio colaborativo internacional bajo el paraguas del Programa de Normalización Biológica (BSP). Esto muestra (1) que varias combinaciones de mAbs para el recubrimiento y detección de microplacas se pueden utilizar como alternativa in vitro a la prueba in vivo de NIH y (2) que estas combinaciones pueden depender de la cepa de la vacuna RABV que se va a probar.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La Dra. Sylvie Morgeaux y la Dra. Jean-Michel Chapsal deben ser reconocidas por su participación clave para establecer el ensayo ELISA sobre lotes de vacunas y para organizar talleres internacionales y estudios colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali por la lectura crítica del manuscrito. El Dr. Pierre Perrin fue responsable del aislamiento y caracterización de mAb-D1. Este trabajo ha sido apoyado principalmente por la financiación del Instituto Pasteur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

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Inmunología e infección Número 159 Potencia de la vacuna contra la rabia prueba de NIH método ELISA anticuerpo monoclonal mAb-D1 Trimers de glicoproteína Contenido de glicoproteína
Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia
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Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

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