Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לכמת את פעילות כימוטקטיק של דם מונוציטים בדגמי העכבר, כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות תזונתיות, תרופתי וגנטי על מונוציט דם ולאפיין את מונוציטים בדם נגזר מקרופאגים ב מודלים לעכבר באמצעות חלבון מונוציט-כימוסטנט-1 (MCP-1)-העמיסו במרתף ממברנה ממברנות ג'ל הנגזר.
Abstract
הומאוסטזיס רקמות ותיקון הם תלויים באופן קריטי על גיוס של מקרופאגים הנגזרים מונוציט. הן מתחת ומעבר גיוס של מקרופאגים נגזר מונוציט יכול לפגוע בריפוי הפצע. הראנו כי גבוהה שומן דיאטות גבוהה סוכר לקדם מונוציט הטרמה ותפקוד לקוי, המרת דם בריא מונוציטים לתוך פנוטיפים היפר כימוטקטיק צפוי להבדיל לתוך מקרופאגים עם פרופילי הפעלה מוסדרים ולקויי פנוטיפ פלסטיות. הגיוס החדש של המקפאגים הנגזרים מונוציט וגיוס של מקרופאגים עם פרופילי הפעלה לא מוסדרים הוא האמין להיות תורם העיקרי להתפתחות של מחלות דלקתיות כרוניות הקשורות בהפרעות מטבולית, כולל טרשת עורקים והשמנה. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הפעילות כימוטקטיק של דם מונוציטים כמו ביוטרקר עבור הטרמה מונוציט ותפקוד ולאפיין את מונוציטים מקרופאג המין הנכון הם עומדים להבדיל לתוך אלה מודלים העכבר. באמצעות תא בודד ניתוח כתמי אבן מערבית, אנו מראים כי לאחר 24 h 33% של תאים שגויסו ל MCP-1-טעון במרתף ממברנות ג'ל נגזר מוזרק לתוך עכברים מונוציטים ו מקרופאגים; 58% לאחר היום השלישי. עם זאת, ביום 5, מספר מונוציט ו מקרופאג פחתו באופן משמעותי. בסופו של דבר, אנו מראים כי מאמר זה מאפשר גם לבידוד של מקרופאגים חיים מתוך מרתף מאוחזרים בניתוח ממברנות ג'ל הנגזר ממברנה, אשר יכול להיות נתון לאפיון שלאחר מכן על ידי תא בודד ניתוח כתמי המערבי.
Introduction
גיוס של מקרופאגים הנגזרים מונוציט חיוני לפיתוח מחלות דלקתיות כרוניות הקשורות בהפרעות מטבולית, כולל טרשת עורקים והשמנה1,2,3, ד. מספר מקרופאגים הנגזרים מונוציט באתרים של פגיעה ברקמות, כמו גם הפלסטיות שלהם הם קריטיים עבור הומאוסטזיס רקמות ותיקון. הן מתחת ומעבר גיוס של מקרופאגים נגזר מונוציט יכול לפגוע בפצע ריפוי5. הפעלת דלקת רקמות מקומיות, למשל, על ידי הצטברות וחמצון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) בקיר אבי העורקים או הפעלה דלקתית של אדיפוציטים על ידי חומצות שומן או ליפופוליד חיידקי דולף דרך המעיים מכשול, המוביל לשחרור של מגשרים דלקתיים, כולל נוגדנים כימוט חלבון 1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 הוא חבר של משפחת כימוקין c-c ו כימוג מפתח אחראי גיוס של מקרופאגים נגזר מונוציט לאתרים של דלקת רקמות ופציעה6,7,8, 9,10. הפעלה דלקתית של תוצאות אנדותל של כלי הדם בביטוי של מולקולות הידסיות כגון המולקולה התרבות מולקולה 1 (icam-1) ו מולקולה תא כלי דם 1 (vcam-1)11,12, המאפשר במחזור מונוציטים מופעל על ידי MCP-1 כדי להתגלגל, בחוזקה לדבוק ולאחר מכן העברת לחלל תת הדרך12. החדירה מונוציטים להבדיל לתוך מקרופאגים, אשר ניתן להפעיל לתוך הפנוטיפים, נהיגה בתהליך דלקתי חריפה. מונע על ידי המיקרוסביבה, pro-דלקתיות מקרופאגים יכולים להמיר לתוך מקרופאגים לפתרון דלקת, אשר משחקים תפקידים קריטיים בניקוי של תאים דלקתיים, הסרת אותות אנטי דלקתיים ותיקון רקמות השלמת ופצע ריפוי12,13.
כרונית מתח מטבולית מושלמים מונוציטים עבור תגובתיות משופרת באופן דרמטי כדי כימותרפיה-מושכים וגיוס מונוציט גדל, ואנו הראו כי מונוציטים מ, לתת מקרופאגים עם תוכניות הפעלה מוסדר ומלא מוסדרים . מדינות14,15,16 הטרמה מונוציט מקדמת טרשת עורקים, השמנת יתר, ואולי אחרים מחלות דלקתיות כרוניות הקשורות בהפרעות מטבולית כגון steatohepatitis, מחלות כליות ואולי סרטן. כדי להעריך ולכמת הטרמה מונוציט בדגמי העכבר של מחלות האדם, פיתחנו טכניקה חדשה כדי להעריך את מצב הטרמה של דם מונוציטים על ידי מדידת פעילות כימוטקטיק ב vivo14,15,16, . שבע עשרה הגישה שלנו כרוכה הזרקה של המרתף ממברנה הנגזר ג'ל שנטען עם מכשיר כימוג-אנחנו בדרך כלל להשתמש MCP-1-או רכב לאגף שמאל וימין, בהתאמה, של עכברים. כאשר הזריק בזהירות תת-עורי, הממברנה ממברנה נגזר ג'ל יהיה ליצור תקע אחד, שממנו נוגדנים יכול לפזר וליצור מעבר הדרגתי כימוטקטיק מוגדר כי אינו מושפע מהמצב מטבולית או דלקתית של הסביבה רקמה או עכבר הנמען.
המרתף ממברנה נגזר ג'ל שאנו משתמשים עבור הצורך שלנו הוא מרתף במרתף מסיסות הכנה המופק מתוך אנגלברב-הולם-נחיל (EHS) עכבר סרקומה, גידול עשיר בתוך מטריצה מחלץ כזה (ECM) חלבונים. תערובת חלבון מורכבת זו מכילה למינציה (60%), קולגן IV (30%), המולקולה המגשר entactin (8%), ומספר גורמי גדילה. מרתף ממברנה ממברנת מטריקס הוקם במקור כדי לחקור אנגיוגנזה בתגובה לגורמי צמיחה שונים18,19. עם זאת, כדי ללמוד כימוט מונוציט, חשוב להשתמש בגורם הצמיחה ממברנה מרתף מרוקנת ג'ל נגזר כדי למזער את הגיוס של תא אנדותל ואנגיוגנזה. מה שהופך את מטריג'ל (המכונה ג'ל מרתף הנגזר למטה) ייחודי ושימושי במיוחד הוא כי בטמפרטורה מתחת 10 ° c זה ממוסס, המאפשר נוגדנים להיות התפרקה. בטמפרטורות מעל 22 ° c, התמיסה הנגזרת מהמרתף עוברת במהירות מעבר פאזה ויוצרת במהירות הידרוג'ל. אטמי ניתן להיות בניתוח, ניקה והומס עם מטפרוטאז באקלוס נגזר מטלוזיה נייטרלי כדי להניב השעיות תא בודד, אשר ניתן לנתח על הפעלה פלואורסצנטית תא (FACS), על ידי RNAseq, בודד תא RNA ומגוון של אחרים טכניקות omics. כאן נתאר את השימוש בניתוח כתמי האבן המערבי של תא יחיד לאפיון אוכלוסיות התאים שגויסו לתוך המרתף ממברנה המופק ג'ל מחבר אחד, שלושה או חמישה ימים לאחר ההזרקה.
Protocol
כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים בבית הספר לרפואה ביער התעוררות.
1. הכנת מקדם הצמיחה של MCP-1-מופחתת-ממברנה מרתף-פתרון נגזר
הערה: . זה הליך סטרילי
- נקיון כיפה של תרבות התא עם חיטוי לפני הכנת קרום המרתף הפתרון הנגזר (למשל, מטריצות).
- להכין ארוז בנפרד סטרילי מזרק 1 מ ל ולנגב את החלק העליון של קרום המרתף הנגזר בקבוקון פתרון עם ספוגית אלכוהול לפני טעינת אותו לתוך המזרק.
- לחלוטין להפשיר את פקטור הצמיחה-מופחתת ממברנה המרתף הפתרון הנגזר על הקרח.
זהירות: אם מטריצת קרום המרתף מופמסת בטמפרטורת החדר (RT), להבטיח חלקיקי קרח קטן נשאר כדי למנוע את הפתרון מפני הגלינג. - לאחר הסדר, לפתוח את המבחנה לערבב MCP-1 או 1xPBS עם 0.1% BSA במכסה של תרבות התא.
- הכינו 1 מ ל של מזרק סטרילי עם מחט G 26 ו קריר על הקרח.
- הכנת פתרון מניות של MCP-1 על ידי המסת MCP-1 לריכוז הסופי של 50 μg/mL ב-1x PBS עם 0.1% BSA.
- לדלל MCP-1 ב 5 מ"ל מרתף קר ממברנה הפתרון הנגזר לריכוז הסופי של 500 ng/mL. הכינו כמות שווה של הפתרון הכולל של קרום המרתף עם הרכב בלבד (1x PBS מכילים 0.1% BSA).
- טען 500 μL של מרתף ממברנה הפתרון הנגזר (עם או בלי MCP-1) במזרק 1 mL.
- להסיר את כל בועות האוויר מן המרתף ממברנה נגזר הפתרון מזרק הטעון לפני ביצוע הזריקה כדי להבטיח מערך תקע אחיד.
2. הזרקת ממברנה במרתף-הפתרון הנגזר
- תרסיס 70% אתנול סביב אזור השגרה לפני ובמהלך הזריקות כדי לחטא את הסביבה.
- כדי לגרום להרדמה, למקם את העכבר בתא הרדמה ולהגדיר את מטר הזרימה2 כדי 1 ליטר/דקה ולאחר מכן להתאים את האידוי ל 2% isofהלביאן.
- עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי ניטור קצב הנשימה (קצב/מזערי), רפלקס המצמוץ ותנועה של שפם.
- במהלך כל ההליך, לשמור על הרדמה באמצעות קונוס האף.
- במהלך ההליך להמשיך לעקוב אחר קצב הנשימה (קצב/מזערי), רפלקס הקרנית ותנועה של שפם כדי לוודא את עומק ההרדמה.
- לאחר אישור היעדר תגובה צביטה בבוהן, לאט להזריק (כ 100 μL/s) המרתף ממברנה הנגזר הפתרון תת-עורי לימין (אין MCP-1) ושמאלה (עם MCP-1) האגף של העכבר, בהתאמה. אם הזריקה איטית מדי, אטמי הקרום הנגזר מהממברנה עשויים להיות בעלי צורה אסימטרית, או אפילו מפוצלים, וקשה להסרה.
- להחזיק את המזרק עבור 20-30 s לאחר ההזרקה כדי למנוע את הדליפה של הפתרון וכלה לאפשר ליצור חלק ג'ל יחיד לטופס.
- לאחר ההזרקה, הצבת העכבר על משטח ההתחממות עם ניטור עד התאוששות.
- להחזיר את העכבר לכלוב המקורי פעם העכבר הוא התאושש לחלוטין.
3. בציר ממברנה מרתף-מצתים הנגזרים
- שוקלים שתי שפופרות נפרדות 1.5 mL עבור כל עכבר ולתייג אותם.
- שלושה ימים לאחר הזרקה של המרתף ממברנה הפתרון הנגזר, המתת החסד את העכבר בתא הרדמה באמצעות 3% isof, ואחריו פריקה צוואר הרחם.
- להסיר את הפרווה של העכבר באמצעות קוצץ שיער או להחיל קרם מסיר שיער עם מקלות משופעת כותנה עבור 5 דקות ולאחר מכן לנגב.
- החזק את העור העכבר באמצעות מלקחיים סביב בית החזה התחתון וחוליה המותני העליון ולעשות חתך 2 מ"מ לאורך העור.
- חותכים את קו האמצע של החלק האחורי של העכבר מתוך חתך שנעשו לחוליות צוואר הרחם עד 1 ס מ מעל הצומת חוליה caudal (הצומת הזנב) באמצעות מספריים כירורגי.
- הפרידו את העור משכבת השריר והצמד את העור על מצע פוליסטירן מוקצף.
- החזק בקפידה את הקפסולה הסיבית המכילה את התקע מרתף ממברנה נגזר ג'ל באמצעות מלקחיים עדינים ולהסיר את הקפסולה סיבי באמצעות מספריים עדינים כדי לנקות את התקע.
- הסר את המרתף מנוקה ממברנה הנגזרת ג'ל התקע והעבר אל 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה (ראה 3.1).
- שוקלים את שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם התקע מרתף מנוקה המופק ג'ל ממברנה ולחשב את המשקל של התקע המרתף ממברנה נגזר ג'ל.
4. לעכל את קרום המרתף-מצתים הנגזרים
- הפשרת dispase 10 מ ל) על הקרח.
- הגון מרתף ממברנה הנגזרת ג'ל התקע בצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות מספריים נקיים נקי.
- הוסף 800 μL של dispase לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה כל המכיל מרתף ממברנה הנגזרת ג'ל התקע.
- מערבולת עם מהירות מקסימלית 10 s לשבש את התקע.
- מודקות את הצינורות מיקרוצנטריפוגה עבור 2 h ב 37 ° c ב 1,400 rpm ב thermomixer כדי לפזר לחלוטין את התקע המרתף הנגזר ג'ל ממברנה.
- לאחר 2 h, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 10 דקות ב-RT. בזהירות להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט.
- להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של 1x PBS ידי היפוך או הקשה.
- חזור על צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב-RT. בזהירות להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט.
- השהה מחדש את הגלולה ב-300 μL של PBS.
- קח 50 μL של השעיית תאים בשפופרת מיקרוצנטריפוגה נפרדת.
- הוסף 0.5 μL של calcein AM (1 מ ') אל ההשעיה התא.
הערה: Calcein אם הוא צבע ירוק הכדאיות של תא פלורסנט אשר מצטבר רק בתאי החיים. - מודיית את התאים באינקובטור CO2 ב 37 ° c עבור 10 דקות.
- הרוזן פלורסנט ירוק (חי) ותאים שאינם פלורסנט (מת) באמצעות מונה תאים אוטומטי.
5. קביעת הרכב התא בהשעיה של תא באמצעות תא בודד (scWB) ניתוח מערבי
- מימה את שבב ה-scWB לפני השימוש ב-15 מ ל של מאגר ההשעיה של 1x בצלחת פטרי לפחות 10 דקות ב-RT.
- הוסף 1 מ ל של ההשעיה התא מדולל בודד (10000-100,000 תאים/mL) לשבב מחדש. הגדר את פני השטח בתחתית צלחת פטרי בגודל 10 ס מ. ודא שהמשטח מוגדר כשטוח.
- מכסים את צלחת פטרי עם מכסה כדי למנוע ייבוש ולתת לתאים להתיישב 5-15 דקות על ידי הדרגתי.
- מניחים את השבב תחת מיקרוסקופ שדה בהיר ולבדוק את הבארות בהגדלה 10x.
הערה: כ 15-20% המיקרוגל צריך להיות מאוכלס על ידי תא בודד, פחות מ 2% של בארות צריך להכיל 2 או יותר תאים - הטה את צלחת הפטרי בגודל 10 ס מ המכילה את השבב ב-45 מעלות.
- לשטוף את השבב עם מאגר ההשעיה של 1 x כדי להסיר תאים שנתפסו מפני השטח של השבב על ידי ליטוף עדין מלמעלה למטה של השבב. . אני חוזר 3 פעמים
- הכן את התא היחיד לכלי מערבי.
- קביעת זמן הפירוק, זמן האלקטרופורזה וזמן לכידת ה-UV. כדי לנתח את מקרופאגים ששוחזרו התאושש מתוך המרתף ממברנה נגזר התקע ג'ל, השתמש בהגדרות הבאות: זמן לפירוק: 0 s; זמן האלקטרופורזה: 160 s; לכידת UV זמן 240 s.
- לטעון בזהירות את השבב לתא האלקטרופורזה של תא יחיד הכלי המערבי, הפנים ג'ל צד. להשתמש בזהירות לא לפגוע בצד ג'ל של השבב.
- יוצקים את הליזה/הפעלת החוצץ לתוך החדר ומכסים לחלוטין את השבב המערבי של כל תא יחיד. הפעל את הפירוק התאים.
- הפעל כלי scWB באמצעות ההגדרה המפורטת ב-5.8.
- לאחר ההפעלה הושלמה, להעביר את השבב 10 ס מ צלחת פטרי ולשטוף את השבב פעמיים עם מאגר כביסה 1x עבור 10 דקות ב RT.
- הכנת דילול של נוגדן ראשוני (אנטי vinculin: 1:10; anti-CD45:1:15, אנטי CD11b: 1:20, anti-F4/80:1:10) בנפח כולל של 80 μL של נוגדן דילול (לערבב 8 μL של נוגדן 1 ועוד 8 μL של נוגדן 2 בתוספת 64 μL של דילול).
- הוסף 80 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לחדר הבדיקה נוגדן והנמך את השבב ג'ל בצד למטה כך פתרון הנוגדן פתיל על פני השבב.
- דגירה עם פתרון הנוגדן העיקרי עבור 2 h ב RT.
- לשטוף את השבב שלוש פעמים עבור 10 דקות ב-1x מאגר כביסה על שייקר.
- לשטוף את השבב פעם במשך 10 דקות במים על השייקר לשפוך את הג.
- הכנת דילול 1:20 של נוגדן משני בנפח כולל של 80 μL (לערבב 2 μL של נוגדן משני בתוספת 78 μL של דילול).
- מודגנת את השבב עם נוגדן משני עבור 1 h ב RT מוגן מפני אור.
- לשטוף את השבב שלוש פעמים עבור 10 דקות עם מאגר כביסה 1x על שייקר.
- סובב את השבב באמצעות טווה שקופית כדי להסיר את כל מאגר הכביסה הנותר.
- סריקת השבב על סורק מיקרוarray לייזר כפול ברזולוציה של 5 יקרומטר בערוץ ספקטרלי של fluorophore מצמידים את הנוגדנים המשני.
- נתח נתונים באמצעות תוכנה ספציפית ל-scWB.
6. להפשיט את שבב scWB
- אחסן את השבב הסרוק במאגר הכביסה עד שהוא מוכן להתפשט.
- הניחו את מרחץ המים בתוך מכסה המנוע.
- מניחים מתלה צינור 50 mL באמבט המים עם המים רק 1 ס מ מעל הארון ומניחים את טמפרטורת המים ב-60 ° c.
- . הכן את מאגר החשפנות עבור 1 L של פתרון מאגר להתפשט, לפזר 9.85 g של טריס-HCl (pH 6.8) ו 20 גרם של SDS ב 900 mL של מים מזוקקים ולהתאים pH. ואז למלא עם מים מזוקקים ל 1L. הוסף 0.8% (v/v) של β-mercaptoethanol (β-ME; 14.3 M) מיד לפני כל שימוש.
- לאחר הסריקה הראשונית, מניחים את השבב בצלחת פטרי בגודל 10 ס מ לפני החשפנות.
- עבור כל שבב, לקחת 40 mL של להתפשט מאגר ולהוסיף 320 μl של β-ME.
זהירות: β-ME הוא רעיל ומסוכן לאדם ולסביבה. ההליך הבא צריך להיעשות בתוך מכסה המנוע. - הניחו את השבב במיכל ואטמו את המיכל בעזרת parafilm כדי למנוע דליפת מים למיכל.
- מניחים את המיכל בתוך מתלה הצינור באמבט המים שחומם מראש.
- מודטה עבור 90 דקות.
- הסירו בזהירות את השבב מהמיכל והניחו בצלחת פטרי טרייה.
- שטוף בקצרה את השבב פעם אחת עם מאגר שטיפת 1 x. ואז להוסיף 15 מ ל של מאגר כביסה 1x לצלחת פטרי.
- לשטוף את השבב עבור 15 דקות על שייקר. חזור על שלב השטיפה ארבע פעמים.
הערה: שבב מוכן הנוגדן העיקרי הבא (ראה שלבים 5.12-5.21).
Representative Results
כדי לגשת לתגובתיות של דם מונוציטים כדי כימומי, אנו הזריקו רכב טעון ו MCP-1 טעון מרתף ממברנה הפתרון לתוך האגף השמאלי והימני של כל עכבר. המרתף ממברנה מצתים הנגזרים הוסרו 1, 3 ו 5 ימים לאחר זריקות, מומס ותאים מגויס לכל תקע נספרו (איור 1A). על-ידי הפחתת ספירת התאים בתקע הטעון לרכב (קווים פתוחים) מספירת התאים בתקע הטעון של MCP-1 (ברים סגורים), הצלחנו להשיג את מספר התאים שגויסו במיוחד בתגובה ל-MCP-1 (מספר תא Δ, איור 1B). הבחנו האצת MCP-1-ספציפי גיוס והצטברות של תאים על פני תקופה של 5 ימים, עם התעריפים הגדלים מ 31,000 תאים/יום (יום 1) כדי 78,000 תאים/יום (יום 3) ו 136,000 תאים/יום ביום 5 (איור 1B).
כדי לזהות את סוגי התאים שנכנסו לתוך המרתף מאטמי ג'ל שמקורם ברפידים, אנו מודדים את התאים מבודדים מכל תקע לניתוח כתמי אבן בודד (scWB), בודק עבור CD45, CD11b ו-F4 ביטוי לזיהוי מונוציטים (CD11b+f4/80 -), מקרופאגים (CD11b+f4/80+ פלוס CD11b-f4/80+) ונותרים לוקיציטים לא-מונוציטוטיות (CD45+CD11b-f4/80-) (איור 2). שבבי scWB נחקר לאחר מכן עבור vinculin כדי לקבוע את מספרי התאים הכולל על כל ג'ל ולאשר תפוסת תא בודד של המיקרוגל על שבב scWB. האחוז של מונוציטים בתוך קרום MCP-1-המרתף הטעון הממברנה ג'ל הנגזר היה נמוך ביום 1, 20%, לשיא ביום 3 ב 47%, בהתאמה לפני שחרור 14% ביום 5 (איור 2D). מספרים מקרופאג בתוך המרתף MCP-1 טעון הממברנה ג'ל הנגזרות מוגברת בהתמדה מ 13% ביום 1, עד 22% ביום 3 ו -23% ביום 5. עבור התקעים MCP-1-טעון, את אחוז מקרוציטים פלוס בתוך האוכלוסייה התא המבודד היה הגבוה ביותר ביום 3, 31% ברכב טעון תקעים (איור 3A) ו 58% ב MCP-1-טעון תקעים (איור 3a), המציין כי לאחר 3 ימים הרוב המכריע של תאים שגויסו על ידי MCP-1-התלויים מוניות כימוציטים מונופאגים. למרות המספר הכולל של מקרוציטים פלוס המקפאגים היה גבוה יותר ביום 5 בהשוואה ליום 3 (איור 3C ו D), בשל היחס הגבוה ביותר של מונוציטים מקרופאגים באוכלוסיית הכולל תא (איור 3c ו-B), ספירת התא ביום 3 משקפת באופן מדויק יותר דם מונוכימוטקט וגיוס. אנו, לפיכך, מזריקים באופן שגרתי את התמיסה הנגזרת למרתף שלושה ימים לפני הקרבת החיות. אם כל מקרופאגים שגויסו על-ידי MCP-1 הם מונופאגים שמקורם ברקמות השכנות תרם לא נקבע.
ניתוח סטטיסטי של הנתונים המוצג כאן נערך עם תוכנת ניתוח (למשל, SigmaPlot 14). בעקבות בדיקת ה-LSD של פישר שימש להשוואת ערכי ממוצע בין קבוצות נסיוניות. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD של 3 ניסויים עצמאיים לפחות. תוצאות נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית ברמה P < 0.05.
איור 1 : כימות של תאים מגויס לתוך מרתף תת עורית ממברנה מצתים הנגזרים. (א) מספרי טלפון מוחלטים לרכב הטעון (ברים פתוחים) וממברנות MCP-1-הטעונים ממברנה (ברים סגורים). (ב) מספר התאים שגויסו לתוך מרתף ממברנה הנגזר מאטמי ג'ל על ידי mcp-1 מחושב כהפרש במספרי התאים בין mcp-1-טעון הרכב שנטען. תוצאות מוצגות כממוצע ± SD (n = 4) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : ניתוח של אוכלוסיות תאים שגויסו לתוך מרתף ממברנה מאטמי ג'ל שנגזר על ידי תא בודד ניתוח כתמי אבן מערבית. (A + B) דוגמאות מייצגים מוצגות עבור ניתוח scWB של רכב טעון (פקד) ותקע MCP-1-(mcp-1) מבודד מעכבר שלושה ימים לאחר ההזרקה. שבבים מסומנים בנוגדנים המכוונים נגד CD45, CD11b ו-F4/80 ואחריו נוגדנים משניים פלורסנט כפי שמתואר בפרוטוקול. העוצמה הפלואורסצנטית של הרצועה המסומנת בתווית עבור כל תא בודד מוצגת כאזור השיא. (C + D) אוכלוסיות תאים זוהו כמונציטים (CD11b+f4/80-, 
), מקרופאגים (CD11b+f4/80+ CD11b-F4/80+,) או כמו לוקיציטים 
לא-מונוציטוטיות (CD45+ , 
). התאים הנותרים סומנו כ"אחר" (
). תוצאות מוצגות כממוצע ± SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : תוכן מונוציט ומקרופאג של אטמי מרתף ממברנה ממברנות ג'ל. אנליזה כמותית של התוכן המונונוציט והמקרופאג ברכב טעון ו-MCP-1 טעון הוסרו ביום 1, 3 ו-5 לאחר ההזרקה. ערכים מוצגים כאחוזים מאוכלוסיית התאים הכוללת (A + B) ובמספרי תאים מוחלטים לכל תקע (C + D). תוצאות מוצגות כממוצע ± SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פיתחנו בvivo מוניות כימוכתרפיה, עשיית שימוש בתכונות הפיזיות הייחודיות של מטריצה ממברנה נגזרת המרתף ואת היכולת לטעון מטריצה ייחודית עם נוגדנים ולהזריק אותו לתוך עכברים. הטיפול מאפשר לנו להעריך בעכברים חיים את התגובה של מונוציטים (ו מקרופאגים) כדי נוגדנים, כפי שמודגם כאן עבור MCP-1, ואת ההשפעות של מניפולציה גנטית או תרופתי, תזונתיים וחשיפות סביבתיות אחרות על מונוציט כימוטקסיס. בגלל הדרגתי כימוקין שאנחנו יוצרים בעכברים האלה הוא בעצם מושפע גנטית, תרופתי, תזונה או הסביבה החשיפה, שינויים בפעילות כימוציט גנטי, למעשה משקפים שינויים פונקציונליים אלה מונוציטים, כפי שראינו בעבר, גם התיכנות משני ברמת החלבון וההמרה17,20. אנו דיווחו כי הלחץ מטבולית בעכברים מגביר את התגובה המונבציט לשיטת כימוסטנט וכי זו פעילות hyper-כימוטקציה מתאים עם חלבון מוגבר S-גלוטטימלציה, הפיך, התלות מחדש תלוי-התקשרות שינוי חלבון, אשר ברוב המקרים מוביל לאובדן של תפקוד אנזימטי וחלבון21,22, ובמקרים מסוימים גם מקדם השפלה חלבון16,23.
כדי לבצע הליך זה בהצלחה וכיצד להשיג תוצאות אופטימליות עם הטיפול הזה הוא קריטי כי אמצעי אחסון מדויקים של מרתף ממברנה הפתרון הנגזר מוזרק באיטיות כדי ליצור כמוסות היטב בנוי ומסיבי הפקק להיות מוסרים לחלוטין כדי לקבל תקעים נקיים כאשר מרתף הקציר ממברנה הנגזרת ג'ל תקעים, מקלה על פירוק של התקע כולו בפתרון dispase. הנתונים שלנו מראים כי להשאיר את התקע בעלי חיים במשך שלושה ימים מיטוב 1) עוצמת האות, כלומר, מספר מונוציטים ו מקרופאגים מגויס לכל תקע, 2) בסלקטיביות של האות, כלומר, התוכן של מונוציטים ומקרופאגים בתוך ה סך כל אוכלוסיית התאים ו-3) הספציפיות של האות, כלומר העלייה ב מונוציטים ומקרופאגים בתגובה ל MCP-1 לעומת הרכב. בסופו של דבר, אנו מדגימים כיצד המדינה-of-the-art בודד הגישות המבוססות בשילוב עם מרתף ממברנה הנגזרת הפקק ג'ל ניתן להשתמש כדי לאפיין את המונולוציטים מגויס התקעים ובכך לקבל תמונה של הפנוטיפ הפוטנציאלי של המקרופגים הנגזרים מונוציט להיות מגויס לאתרים של פציעה בכל מודל העכבר נתון בתגובה גנטית ספציפית, תרופתי, תזונתיים או התערבויות סביבתיות.
יש מספר מגבלות של האפשרות להיחשב. ראשון, הטיפול בעכבר, כולל הרדמה, הזרקה של מרתף ממברנה הפתרון הנגזר, ניתוח כירורגי דורש בפועל כדי ליצור תקעים בודדים ונתונים להפקת. שנית, בעוד שרוב התאים שגויסו לתוך התקעים MCP-1 הטעונים הם מונוציטים ו מקרופאגים, מספר משמעותי אינם. הדבר עלול להשפיע על הפרשנות של הפרט האנליטי האחר, שאינו תא יחיד, המבוסס על אוכלוסיית תאים זו. לבסוף, מאחר שתנאי הפירוק של התאים עבור scWB הם קלים, מרחקים הגירה של חלבונים עשויים להיות שונים מ-WB סטנדרטי וייתכן שלא לתאם עם גודל החלבון. לכן, שניהם לפירוק תאים וזמני הפעלה צריך להיות מאומת עבור כל חלבון חדש להיבדק כל נוגדן ראשוני בשימוש.
Disclosures
לא.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי מענקים ל-ר. מ-NIH (AT006885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
| 10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
| 15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
| 2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
| 5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
| Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
| Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
| Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 mL |
| CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
| CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
| CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
| Cellometer Vision | Nexcelom | ||
| Dispase | BD | 354235 | 100 mL |
| Dissecting sissor | |||
| Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
| F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
| Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
| Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
| Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
| Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
| Milo | proteinsimple | Single cell western | |
| Needle | BD | 305111 | 26 G |
| Parafilm | |||
| Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
| Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
| scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
| Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
| Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
| Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
| Syringe | BD | 309602 | 1 mL |
| Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
| Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
| Water bath | ThermoFisher |
References
- Moore, K. J., Tabas, I.
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Akiyama, T., et al. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).
- Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction. Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).
- Gosling, J., et al. MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B. Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).
- Fantuzzi, L., et al. Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response. Blood. 94 (3), 875-883 (1999).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).
- Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Davies, M. J., et al. The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis. Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).
- Anderson, T. J., et al. The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments). New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).
- Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair. Frontiers in Immunology. 2, (2011).
- Qiao, M., et al. Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).
- Ullevig, S., et al. NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).
- Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).
- Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis. Scientific Reports. 6, 34223 (2016).
- Ponce, M. L. Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay. Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).
- Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).
- Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).
- Tavakoli, S., Asmis, R. Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis. Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).
- Ullevig, S. L., et al. Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).
