Summary
Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere den chemotactic aktiviteten av blod monocytter i musemodeller, for å vurdere virkningene av ernæringsmessige, farmakologiske og genetiske intervensjoner på blod monocytt og å karakterisere blod monocytter avledet makrofager i musemodeller bruker monocytt-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-lastet kjeller membran-avledet gel plugger.
Abstract
Vev homeostase og reparasjon er kritisk avhengig av rekruttering av monocytt-avledede makrofager. Både under-og over-rekruttering av monocytt-avledede makrofager kan svekke sår helbredelse. Vi viste at høyt fett og høyt sukker dietter fremme monocytt grunning og dysfunksjon, konvertere sunne blod monocytter i en hyper chemotactic fenotype klar til å differensiere til makrofager med dysregulated aktivisering profiler og nedsatt fenotypiske Plastisitet. De over-rekruttering av monocytt-avledede makrofager og rekruttering av makrofager med dysregulated aktiverings profiler antas å være en stor bidragsyter til utviklingen av kroniske inflammatoriske sykdommer forbundet med metabolske forstyrrelser, inkludert åreforkalkning og fedme. Målet med denne protokollen er å kvantifisere chemotactic aktivitet av blod monocytter som en biomarkør for monocytt grunning og dysfunksjon og å karakterisere den macrophage fenotype blod monocytter er klar til å differensiere til i disse musemodeller. Ved hjelp av én celle Western Blot analyse, viser vi at etter 24 h 33% av cellene rekruttert til MCP-1-Loaded kjeller membran-avledet gel plugger injisert i mus er monocytter og makrofager; 58% etter dag 3. Men på dag 5 ble monocytt og macrophage tall betydelig redusert. Til slutt viser vi at denne analysene også gir mulighet for isolering av levende makrofager fra kirurgisk Hentet kjeller membran-avledet gel plugger, som deretter kan utsettes for påfølgende karakterisering av enkelt celle Western Blot analyse.
Introduction
Rekrutteringen av monocytt-avledet makrofager er viktig for utviklingen av kroniske inflammatoriske sykdommer forbundet med metabolske forstyrrelser, inkludert aterosklerose og fedme1,2,3, firetil. Antall monocytt-avledet makrofager på områder av vevskader, så vel som deres plastisitet er avgjørende for vevet homeostase og reparasjon. Både under-og over-rekruttering av monocytt-avledede makrofager kan svekke såret healing5. Utløse lokale vev betennelse, for eksempel ved akkumulering og oksidasjon av lav tetthet lipoprotein (LDL) i aorta veggen eller inflammatorisk aktivering av adipocytter av fettsyrer eller bakteriell lipopolysakkarid lekker gjennom intestinal barriere, fører til utgivelsen av inflammatoriske meglere, inkludert chemokiner som monocytt chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 er medlem av c-C chemokine-familien og en nøkkel chemoattractant som er ansvarlig for rekrutteringen av monocytt makrofager til områder av vevs betennelse og skade6,7,8, 9,10. Inflammatorisk aktivering av vaskulær endotelet resulterer i uttrykk for adhesjon molekyler som intercellulære vedheft molekyl 1 (ICAM-1) og vaskulær celle vedheft molekyl 1 (VCAM-1)11,12, slik at sirkulerende monocytter aktiveres av MCP-1 å rulle langs, fast holder seg til og deretter transmigrate inn i subendothelial plass12. Infiltrere monocytter differensiere til makrofager, som kan aktiveres i en proinflammatoriske fenotype, kjøring av akutt inflammatorisk prosess. Drevet av mikromiljøet, Pro-inflammatorisk makrofager kan konvertere til betennelser-løse makrofager, som spiller kritiske roller i clearing av inflammatoriske celler, fjerne Pro-inflammatoriske signaler og fullføre vev reparasjon og sår Healing12,13.
Kronisk metabolsk stress primtall monocytter for dramatisk forbedret respons til kjemoterapi-Oktenol og økt monocytt rekruttering, og vi viste at primet monocytter gi opphav til makrofager med dysregulated aktiverings programmer og polarisering statene14,15,16. Monocytt grunning fremmer aterosklerose, fedme, og muligens andre kroniske inflammatoriske sykdommer forbundet med metabolske forstyrrelser som steatohepatitis, nyre sykdommer og muligens kreft. For å vurdere og kvantifisere monocytt grunning i mus modeller av menneskelige sykdommer, utviklet vi en ny teknikk for å vurdere priming staten blod monocytter ved å måle chemotactic aktivitet i vivo14,15,16, 17av dem. Vår tilnærming innebærer injeksjon av kjelleren membran-avledet gel lastet med enten en chemoattractant-vi vanligvis bruker MCP-1-eller kjøretøy i venstre og høyre flanke, henholdsvis av mus. Når nøye injisert subkutant, kjelleren membran-avledet gel vil danne en enkelt plugg, som chemokiner kan spre og opprette en definert chemotactic gradient som ikke er påvirket av metabolsk eller inflammatorisk tilstand av de omkringliggende vev eller mottakerens mus.
Kjelleren membran-avledet gel vi bruker for våre analysen er en solubilized kjeller membran forberedelse Hentet fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom, en svulst rik på slike ekstracellulære matrise (ECM) proteiner. Denne komplekse protein blandingen inneholder laminin (60%), kollagen IV (30%), bygge bro molekylet entactin (8%), og en rekke vekstfaktorer. The Basement membran Matrix plugg analysen ble opprinnelig utviklet for å undersøke angiogenese som svar på ulike vekstfaktorer18,19. Men for å studere monocytt chemotaxis, er det viktig å bruke vekstfaktor-utarmet kjeller membran-avledet gel for å minimere endothelial celle rekruttering og angiogenese. Hva gjør Matrigel (referert til som kjeller membran-avledet gel heretter) unik og spesielt nyttig er at ved temperaturer under 10 ° c det blir flytende, slik at for chemokiner å bli oppløst. Ved temperaturer over 22 ° c gjennomgår den avledede løsningen i kjelleren raskt en faseovergang og danner en hydrogel. Pluggene kan kirurgisk excised, rengjøres og oppløses med en Bacillus nøytral metalloprotease for å gi enkel celle suspensjoner, som kan analyseres på en fluorescens celle Sorter (FACS), av RNAseq, Single-Cell RNA og en rekke andre omics teknikker. Her beskriver vi bruken av single-Cell Western Blot analyse for karakterisering av cellen populasjoner rekruttert inn i kjelleren membran-avledet gel plugger en, tre eller fem dager etter injeksjon.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet i denne protokollen har blitt godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee ved Wake Forest School of Medicine.
1. utarbeidelse av MCP-1-Loaded vekstfaktor-redusert Basement membran-avledet løsning
Merk: Dette er en steril prosedyre.
- Clean cellekultur hette med desinfeksjonsmiddel før du klargjør kjelleren membran avledet løsning (f. eks Matrigel).
- Forbered individuelt pakket steril 1 mL sprøyte og tørk toppen av kjelleren membran avledet løsnings hetteglass med en alkoholserviett før du legger den inn i sprøyten.
- Helt tine vekstfaktor-redusert kjeller membran-avledet løsning på isen.
Forsiktig: Hvis kjelleren membran matrise er tint ved romtemperatur (RT), sikre en liten is partikkel gjenstår å hindre at løsningen fra gelling. - Når tint, åpne hetteglasset og bland MCP-1 eller 1xPBS med 0,1% BSA i cellekultur panseret.
- Forbered en 1 mL av steril sprøyte med en 26 G nål og kjølig på isen.
- Forbered en lagerløsning av MCP-1 ved å oppløse MCP-1 til en endelig konsentrasjon på 50 μg/mL i 1x PBS med 0,1% BSA.
- Fortynne MCP-1 i 5 mL kald kjeller membran-avledet løsning til en endelig konsentrasjon av 500 ng/mL. Forbered en lik mengde kjeller membran-avledet løsning med kjøretøy bare (1x PBS inneholder 0,1% BSA).
- Last 500 μL av kjeller membran-avledet oppløsning (med eller uten MCP-1) i den kalde sprøyten på 1 mL.
- Fjerne alle luftbobler fra kjelleren membran-avledet oppløsning-Loaded sprøyte før injeksjonen for å sikre en ensartet plugg formasjon.
2. injeksjon av kjeller membran-avledet løsning
- Spray 70% etanol rundt prosedyren området før og under injeksjoner å desinfisere miljøet.
- For å indusere anestesi, Plasser musen i en anestesi kammer og sett O2 Flow meter til 1 liter/min deretter justere fordamper til 2% isoflurane.
- Overvåk dybden av anestesi ved å overvåke respirasjonsfrekvensen (rate/min), hornhinne refleks og bevegelse av kinnskjegg.
- Under hele prosedyren, opprettholde anestesi ved hjelp av en nese kjegle.
- Under prosedyren holde overvåking av respirasjonsfrekvensen (rate/min), hornhinnen refleks og bevegelse av kinnskjegg for å verifisere dybden av anestesi.
- Etter å ha bekreftet mangel på respons på tå knipe, langsomt injisere (ca 100 μL/s) kjelleren membran-avledet løsning subkutant i høyre (ingen MCP-1) og venstre (med MCP-1) flanken av musen, henholdsvis. Hvis injeksjonen er for tregt, kan kjelleren membran-avledet gel plugger bli uregelmessig formet, eller til og med fragmentert, og vanskelig å fjerne.
- Hold sprøyten for 20-30 s etter injeksjonen for å hindre lekkasje av oppløsningen og for å tillate en enkelt myk gel-plugg for å danne.
- Etter injeksjon, plassere musen på oppvarmingen puten med overvåking til gjenvinning.
- Retur musa å originalen bur en gang musa er fullt ut kommet til hektene.
3. Harvest The Basement membran-avledet gel plugger
- Veie to separate 1,5 mL mikrosentrifugen rør for hver mus og merke dem.
- Tre dager etter injeksjon av kjelleren membran-avledet løsning, euthanize musen i anestesi kammeret ved hjelp av 3% isoflurane etterfulgt av cervical forvridning.
- Fjern musen rygg pels ved hjelp av hår Clippers eller Påfør hår Remover krem med bomull-tippet pinner i 5 min og tørk av.
- Hold musen huden ved hjelp av pinsett rundt nedre bryst og øvre korsrygg vertebra og gjøre en 2 mm lange innsnitt i huden.
- Skjær midtlinjen på baksiden av musen fra et snitt laget til cervical ryggrad og ned til 1 cm over caudal vertebra Junction (hale Junction) ved hjelp av kirurgisk saks.
- Skill huden fra muskelen laget og PIN-ned huden på en polystyren skum plattform.
- Hold forsiktig på fiber kapselen som inneholder kjelleren membran-avledet gel plugg ved hjelp av fine tang og fjerne fiber kapselen ved hjelp av fin saks for å rengjøre pluggen.
- Fjern den renset kjelleren membran-avledet gel plugg og overføre til 1,5 mL mikrosentrifugen (se 3,1).
- Veie mikrosentrifugen røret med rengjort kjelleren membran-avledet gel plugg og beregne vekten av kjelleren membran-avledet gel plugg.
4. fordøye kjelleren membran-avledet gel plugger
- Tin dispase (10 mL) på isen.
- Hakke kjelleren membran-avledet gel plugg i mikrosentrifugen røret ved hjelp av ren fin saks.
- Tilsett 800 μL av dispase i hvert mikrosentrifugen rør som inneholder kjeller membran avledet gel-plugg.
- Vortex med maksimal hastighet for 10 s for å forstyrre pluggen.
- Ruge den mikrosentrifugen rør for 2 h ved 37 ° c ved 1 400 RPM i en thermomixer å fullstendig oppløse kjelleren membran-avledet gel plugg.
- Etter 2 timer, sentrifuger på 400 x g i 10 min ved RT. Fjern og kast supernatanten forsiktig.
- Resuspend pellet i 1 mL 1x PBS ved invertere eller tapping.
- Gjenta sentrifugering ved 200 x g i 10 min ved RT. Fjern og kast supernatanten forsiktig.
- Resuspend pellet i 300 av PBS.
- Ta 50 μL av celle fjæring i et separat mikrosentrifugen rør.
- Tilsett 0,5 μL av calcein AM (1 M) i celle fjæringen.
Merk: Calcein AM er en grønn fluorescerende celle levedyktighet fargestoff som bare akkumuleres i levende celler. - Ruge cellene i en CO2 inkubator ved 37 ° c i 10 min.
- Count grønne fluorescerende (live) og ikke-fluorescerende (døde) celler ved hjelp av en automatisert celle teller.
5. fastsettelse celle sammensetning i Cell suspensjon ved hjelp av single-Cell Western Blot (scWB) analyse
- Rehydrate scWB-brikken før bruk i 15 mL 1x suspensjon buffer i en Petri parabolen i minst 10 min ved RT.
- Tilsett 1 mL av den fortynnede enkelt celle suspensjonen (10000-100000 celler/mL) til rehydrert chip. Sett overflaten på bunnen av en 10 cm Petri parabolen. Sørg for at overflaten er satt flatt.
- Dekk Petri parabolen med et lokk for å hindre tørking og la cellene bosette seg i 5-15 min med gradient.
- Plasser brikken under et lys-felt mikroskop og inspisere brønnene ved 10x forstørrelse.
Merk: Omtrent 15-20% microwells bør være okkupert av en enkelt celle, færre enn 2% av brønnene bør inneholde 2 eller flere celler - Vipp 10 cm Petri parabolen inneholder chip av 45 grader.
- Vask brikken med 1x suspensjon buffer for å fjerne fanges celler fra overflaten av brikken ved milde pipettering fra topp til bunn av brikken. Gjenta tre ganger.
- Klargjør ett enkelt celle-vestlig instrument.
- Angi lyseringstid, elektroforese tid og UV-fangst tid. Å analysere rekruttert makrofager utvinnes fra kjelleren membran-avledet gel plugg, bruk følgende innstillinger: lyseringstid: 0 s; elektroforese tid: 160 s; UV fangst tid 240 s.
- Forsiktig belaste det flis inn i elektroforese cellen av enkeltcellen Villvestfilm instrument, gel-side fasadeforkledning. Vær forsiktig så du ikke skader gel-siden av brikken.
- Hell lyse/kjører buffer i kammeret og helt dekker hele enkelt celle vestlig chip. Start cellen lyse.
- Kjør scWB instrument ved hjelp av innstillingen som er oppført i 5,8.
- Når kjøringen er fullført, overføre chip til en 10 cm Petri parabol og vaske chip to ganger med 1x vaskebuffer for 10 min ved RT.
- Forbered fortynninger av primær antistoff (anti-vinculin: 1:10; anti-CD45:1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80:1:10) i et samlet volum på 80 μL av antistoff fortynningsmiddel (bland 8 μL av antistoff 1 pluss 8 μL av antistoff 2 pluss 64 μL av fortynningsvæske).
- Tilsett 80 μL av den primære antistoff løsningen til antistoff undersøkelser kammeret og senk chip gel-side ned slik at antistoff løsningen transporterer over brikken.
- Ruge med den primære antistoff løsningen for 2 timer ved RT.
- Vask brikken tre ganger i 10 minutter i 1x vaskebuffer på shaker.
- Vask brikken en gang i 10 min i vannet på shaker å avsalte gelen.
- Klargjør en 1:20 fortynning av sekundært antistoff i et total volum på 80 μL (bland 2 μL av sekundær antistoff pluss 78 μL av fortynningsvæske).
- Ruge brikken med sekundært antistoff for 1 h ved RT beskyttet mot lys.
- Vask brikken tre ganger i 10 minutter med 1x vaskebuffer på shaker.
- Spinn brikken med en skyve spinner for å fjerne eventuell gjenværende vaskebuffer.
- Skann brikken på en dual-laser Microarray Scanner på 5 μm oppløsning på Spectral kanal av fluoroforen koplet til sekundære antistoffer.
- Analyser data ved hjelp av scWB-spesifikk programvare.
6. stripping av scWB chip
- Oppbevar den skannede brikken i vaskebuffer til den er klar til å strippe.
- Plasser vannbadet i en avtrekksvifte.
- Plasser en 50 mL tube rack i vannbad med vannet bare 1 cm over stativet og sett vanntemperaturen ved 60 ° c.
- Klargjør stripping buffer. For 1 L av stripping buffer løsning, oppløse 9,85 g av Tris-HCl (pH 6,8) og 20 g av SDS i 900 mL destillert vann og justere pH. Deretter fylles med destillert vann til 1L. Tilsett 0,8% (v/v) av β-mercaptoethanol (β-ME; 14,3 M) rett før hver bruk.
- Etter den første skanningen, plasserer chip i en 10 cm Petri parabolen før stripping.
- For hver chip, ta 40 mL stripping buffer og tilsett 320 μL av β-ME.
Advarsel: β-Me er giftig og farlig for mennesker og miljø. Følgende prosedyre bør gjøres i en avtrekksvifte. - Plasser brikken i beholderen og forsegle beholderen med parafilm for å hindre at vann lekker inn i beholderen.
- Plasser beholderen inne i røret rack i pre-varmet vannbad.
- Ruge for 90 min.
- Forsiktig fjerne chip fra canister og sted i en fersk Petri parabolen.
- Vask brikken kort én gang med 1x vaskebuffer. Deretter tilsett 15 mL 1x vaskebuffer til Petri parabolen.
- Vask brikken i 15 minutter på en shaker. Gjenta vaske trinnet fire ganger.
Merk: Chip er klar for neste primære antistoff (se trinn 5,12-5,21).
Representative Results
For å få tilgang til respons av blod monocytter til chemoattractants, injisert vi kjøretøy-lastet og MCP-1 lastet kjeller membran-avledet løsning i venstre og høyre flanken av hver mus. Kjeller membran-avledet gel plugger ble fjernet 1, 3 og 5 dager etter injeksjoner, oppløst og celler rekruttert i hver plugg ble talt (figur 1a). Ved å trekke celle tellingen i bilen-lastet plugg (åpne barer) fra celle tellingen i MCP-1 lastet plugg (lukkede barer), fikk vi antall celler spesielt rekruttert som svar på MCP-1 (Δ celle nummer, figur 1B). Vi observerte en akselerert MCP-1-spesifikk rekruttering og akkumulering av celler over 5-dagers perioden, med priser som øker fra 31 000 celler/dag (dag 1) til 78 000 celler/dag (dag 3) og 136 000 celler/dag på dag 5 (figur 1B).
For å identifisere celletyper som kom inn i kjelleren membran-avledet gel plugger, vi utsatt cellene isolert fra hver plugg til enkelt celle Western Blot analyse (scWB), undersøkelser for CD45, CD11b og F4/80 uttrykk for å identifisere monocytter (CD11b+F4/80 -), makrofager (CD11b+F4/80 + Plus CD11b-F4/80 +) og gjenværende ikke-monocyttisk leukocytter (CD45+CD11b-F4/80-) (figur 2). Det scWB chips var så analysert for vinculin å avgjøre det sum cellen numrene opp på hver gel og å anerkjenne enkeltcellen Occupancy av det microwells på scWB flis. Prosentandelen av monocytter i MCP-1-Loaded kjeller membran-avledet gel plugger var lav på dag 1, 20%, toppet på dag 3 til 47%, henholdsvis før slippe til 14% på dag 5 (figur 2D). Macrophage tall innenfor MCP-1-Loaded kjeller membran-avledede gel plugger økte jevnt fra 13% på dag 1, til 22% på dag 3 og 23% på dag 5. For MCP-1-lastede plugger var prosentandelen monocytter pluss makrofager i den isolerte celle populasjonen høyest på dag 3, 31% i kjøretøy lastede plugger (figur 3a) og 58% i MCP-1-lastede plugger (figur 3b), noe som indikerer at etter 3 dager de aller fleste celler rekruttert av MCP-1-avhengige chemotaxis er monocytter og makrofager. Selv om det totale antall monocytter pluss makrofager var høyere på dag 5 sammenlignet med dag 3 (figur 3c og D), på grunn av betydelig høyere andel av monocytter og makrofager i den totale celle populasjonen (figur 3a og B), celle tellingen på dag 3 mer nøyaktig reflekterer blod monocytt chemotaxis og rekruttering. Vi derfor rutinemessig injisere kjelleren membran-avledet løsning tre dager før å ofre dyrene. Hvorvidt alle makrofager rekruttert av MCP-1 er monocytt-avledet eller bosatt makrofager rekruttert fra nabolandet vev bidratt ble ikke bestemt.
Statistisk analyse av dataene som vises her, ble utført med analyseprogramvare (f.eks. SigmaPlot 14). ANOVA etterfulgt av Fischer LSD-testen ble brukt til å sammenligne middelverdier mellom eksperimentelle grupper. Alle data presenteres som gjennomsnittet ± SD på minst 3 uavhengige eksperimenter. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant på P < 0,05-nivå.
Figur 1 : Kvantifisering av celler rekruttert til subkutan kjeller membran-avledet gel plugger. (A) absolutte celle tall for kjøretøy-lastet (åpne barer) og MCP-1-Loaded kjeller membran-avledet gel plugger (lukkede barer). (B) antall celler rekruttert til kjeller membran-avledet gel plugger av MCP-1 beregnet som forskjellen i celle tall mellom MCP-1-lastet og kjøretøy-lastet plugger. Resultatene vises som gjennomsnittet ± SD (n = 4) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Analyse av celle populasjoner rekruttert til kjeller membran-avledet gel plugger av enkelt celle Western Blot analyse. (A + B) Representative eksempler er vist for scWB analyse av en kjøretøy-lastet (kontroll) og en MCP-1-blyholdig plugg (MCP-1) isolert fra en mus tre dager etter injeksjon. Chips merket med antistoffer rettet mot CD45, CD11b og F4/80 etterfulgt av fluorescerende sekundære antistoffer som beskrevet i protokollen. Den fluorescens intensiteten til det merkede båndet for hver enkelt celle vises som topp område. (C + D) Celle populasjoner ble identifisert som monocytter (CD11b+F4/80-, 
), makrofager (CD11b+F4/80+ pluss CD11b-F4/80+, 
) eller som ikke-monocyttisk leukocytter (CD45+ , 
). De resterende cellene var merket "andre" (
). Resultatene vises som gjennomsnittet ± SD (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Monocytt og macrophage innhold av kjelleren membran-avledet gel plugger. Kvantitativ analyse av rekruttert monocytt og macrophage innhold i kjøretøy-lastet og MCP-1-lastet plugger fjernet på dag 1, 3 og 5 etter injeksjon. Verdiene vises som prosent av den totale celle populasjonen (A + B) og i absolutte celle tall per plugg (C + D). Resultatene vises som gjennomsnittet ± SD (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi utviklet en in vivo chemotaxis analysen, gjør bruk av de unike fysiske egenskapene til kjelleren membran-avledet matrise og evnen til å laste denne unike matrise med chemokiner og injisere den i mus. Analysen tillater oss å vurdere i levende mus responsen av monocytter (og makrofager) til chemokiner, som illustrert her for MCP-1, og virkningene av enten genetisk manipulasjon eller farmakologiske, kosttilskudd og andre miljømessige eksponeringer på monocytt chemotaxis. Fordi chemokine gradient vi skaper i disse musene er i hovedsak upåvirket av genetiske, farmakologiske, kosttilskudd eller miljømessige eksponering, endringer i monocytt chemotactic aktivitet faktisk reflekterer funksjonelle endringer i disse monocytter og, som vi viste tidligere også omprogrammering på både protein og transcriptional Level17,20. Vi rapporterte at metabolsk stress hos mus øker monocytt respons til chemoattractant, og at denne Hyper-chemotactic aktiviteten samsvarer med økt protein S-glutathionylation, en reversibel, Redox avhengig posttranslational protein modifikasjon, som i de fleste tilfeller fører til tap av enzymatisk og protein funksjon21,22, og i noen tilfeller selv fremmer protein degradering16,23.
For å kunne utføre denne prosedyren, og for å oppnå optimale resultater med denne analysen er det avgjørende at nøyaktige volumer av kjelleren membran-avledet løsning injiseres langsomt for å lage en entall-formet plugg og fiber kapsler bør fjernes helt for å få rene plugger når innhøstingen kjeller membran-avledet gel plugger, forenkler oppløsningen av hele pluggen i dispase løsningen. Våre data viser at å forlate pluggen i dyr i tre dager optimaliserer 1) signalet intensitet, det vil si antall monocytter og makrofager rekruttert inn i hver plugg, 2) selektivitet av signalet, dvs, innholdet av monocytter og makrofager i Totalt celle populasjoner og 3) det spesielle ved signalet, det vil si økningen i monocytter og makrofager som svar på MCP-1 sammenlignet med kjøretøy. Til slutt viser vi hvordan State-of-the-art enkelt celle-baserte tilnærminger i forbindelse med kjelleren membran-avledet gel plug analysen kan brukes til å karakterisere monocytter rekruttert inn i pluggene og dermed få et øyeblikksbilde av den potensielle fenotype av den monocytt-avledede makrofager blir rekruttert til nettsteder for skade i en gitt mus modell som svar på spesifikke genetiske, farmakologiske, kosttilskudd eller miljømessige intervensjoner.
Det finnes en rekke begrensninger av analysen som skal vurderes. Først, mus håndtering, inkludert anestesi, injeksjon av kjeller membran-avledet løsning, og kirurgiske disseksjon krever praksis for å generere enkelt plugger og reproduserbar data. Andre, mens de fleste cellene rekruttert i MCP-1 lastet plugger er monocytter og makrofager, et betydelig antall er det ikke. Dette kan påvirke tolkningen av andre, ikke-single-Cell basert analytiske analyser utført på denne cellen befolkningen. Til slutt, siden cellelyse Rings betingelsene for scWB er milde, kan overførings avstander av proteiner avvike fra standard WB og kan ikke relateres til protein størrelsen. Derfor må både cellelyse og operasjonstider valideres for hvert nye protein som skal testes, og hvert primære antistoff brukes.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd til R.A. fra NIH (AT006885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
| 10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
| 15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
| 2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
| 5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
| Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
| Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
| Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 mL |
| CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
| CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
| CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
| Cellometer Vision | Nexcelom | ||
| Dispase | BD | 354235 | 100 mL |
| Dissecting sissor | |||
| Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
| F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
| Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
| Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
| Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
| Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
| Milo | proteinsimple | Single cell western | |
| Needle | BD | 305111 | 26 G |
| Parafilm | |||
| Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
| Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
| scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
| Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
| Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
| Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
| Syringe | BD | 309602 | 1 mL |
| Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
| Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
| Water bath | ThermoFisher |
References
- Moore, K. J., Tabas, I.
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Akiyama, T., et al. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).
- Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction. Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).
- Gosling, J., et al. MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B. Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).
- Fantuzzi, L., et al. Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response. Blood. 94 (3), 875-883 (1999).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).
- Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Davies, M. J., et al. The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis. Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).
- Anderson, T. J., et al. The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments). New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).
- Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair. Frontiers in Immunology. 2, (2011).
- Qiao, M., et al. Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).
- Ullevig, S., et al. NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).
- Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).
- Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis. Scientific Reports. 6, 34223 (2016).
- Ponce, M. L. Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay. Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).
- Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).
- Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).
- Tavakoli, S., Asmis, R. Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis. Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).
- Ullevig, S. L., et al. Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).
