Summary
Præsenteret her er en protokol for adskillelse af epidermis fra dermis at evaluere inflammatoriske mægler produktion. Efter betændelse adskilles rotte hindpote epidermis fra dermis ved termolysin ved 4 °C. Epidermis bruges derefter til mRNA-analyse af RT-PCR og proteinevaluering af vestlig blot og immunohistochemistry.
Abstract
Brugervenlige og billige teknikker er nødvendige for at bestemme den stedsspecifikke produktion af inflammatoriske mæglere og neurotrophins under hudskade, betændelse og / eller sensibilisering. Formålet med denne undersøgelse er at beskrive en epidermal-dermal separationsprotokol ved hjælp af termolysin, en proteinase, der er aktiv ved 4 °C. For at illustrere denne procedure bedøves Sprague Dawley-rotter, og højre bagpote injiceres med carrageenan. Seks og tolv timer efter injektionen aflives rotter med betændelse og naive rotter, og et stykke bagpote, glabrous hud placeres i kold Dulbeccos Modificerede Eagle Medium. Epidermis adskilles derefter ved kældermembranen fra dermis ved termolysin i PBS med calciumchlorid. Dernæst er dermis sikret af mikrodissection pincet, og epidermis er forsigtigt drillet væk. Toluidinblå farvning af vævssektioner viser, at epidermis adskilles rent fra dermis i kældermembranen. Alle keratinocytcellelag forbliver intakte, og de epidermale rete-højderygge sammen med fordybninger fra dermal papillae observeres tydeligt. Kvalitativ og real-time RT-PCR bruges til at bestemme nerve vækstfaktor og interleukin-6 udtryk niveauer. Vestlige blotting og immunohistochemistry er endelig udført for at opdage mængder af nerve vækstfaktor. Denne rapport illustrerer, at kold termolysin fordøjelsen er en effektiv metode til at adskille epidermis fra dermis til vurdering af mRNA og protein ændringer under inflammation.
Introduction
Evaluering af inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer fra huden kan begrænses på grund af heterogeniteten af celletyper, der findes i den betændte dermis og epidermis1,2,3. Flere enzymer, kemiske, termiske eller mekaniske teknikker, der involverer adskillelse af de to lag eller til udførelse af celleafkobling til evaluering, er for nylig blevet gennemgået4. Syre, alkali, neutralt salt og varme kan opdele epidermis fra dermis hurtigt, men cellulær og ekstracellulær hævelse forekommer ofte5,6. Trypsin, pancreatin, elastase, keratinase, collagenase, pronase, dispase og termolysin er enzymer, der er blevet brugt til epidermal-dermal separation4,7. Trypsin og andre proteolytiske enzymer i bred skala er aktive ved 37-40 °C, men skal overvåges nøje for at forhindre dissociation af epidermale lag. Dispase kløver epidermis på lamina densa, men kræver 24 timer for adskillelse i kulden4,8 eller kortere tidspunkter ved 37 °C4,9. Et begrænsende træk ved alle disse teknikker er den potentielle forstyrrelse af vævsmorfologi og tab af integritet af mRNA og protein.
For at opretholde integriteten af mRNA og protein skal der udføres en hudadskillelsesmetode i kulden i en kort periode. Ved evaluering af hudsepareringsteknikker til betændelsesundersøgelser er termolysin et effektivt enzym til at adskille epidermis fra dermis ved kolde temperaturer4. Termolysin er aktiv ved 4 °C, kløver epidermale hemidesmosomer fra lamina lucida og adskiller epidermis fra dermis inden for 1-3 h4,8,10. Målet med denne rapport er at optimere brugen af termolysin til adskillelse af betændt rotte epidermis fra dermis til at opdage mRNA og proteinniveauer for inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer. Flere foreløbige rapporter er blevet præsenteret11,12,13,14,15. Formålet med dette manuskript er at beskrive en optimal hudadskillelsesteknik ved hjælp af termolysin og demonstrere påvisning af 1) markører for inflammation, 2) interleukin-6 (IL-6) mRNA og 3) nervevækstfaktor (NGF) mRNA og protein i epidermis af rotter med carrageenan-induceret inflammation (C-II)16,17. En foreløbig rapport ved hjælp af den komplette Freunds adjuvansmodel indikerer, at NGF mRNA og proteinniveauer stiger tidligt underinflammation 15. Hos mus forårsager hud sensibilisering med den aktuelle anvendelse af oxazolone en tidlig stigning i IL-6 mRNA ved hjælp af in situ hybridisering36. Både IL-6 og NGF har været impliceret i C-II18,19, men der har ikke været nogen rapporter, der beskriver mRNA eller proteinniveauer for IL-6 eller NGF specifikt fra epidermis i de akutte stadier af C-II.
Termolysinteknikken er billig og ligetil at udføre. Desuden giver termolysinadskillelse af epidermis fra dermis mulighed for mRNA, vestlig blot og immunohistokemisk analyse af inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer under betændelsesprocessen15. Efterforskere bør være i stand til nemt at bruge denne teknik i både prækliniske og kliniske undersøgelser af hudbetændelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne for dyrepleje i Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Carrageenan-induceret inflammation (C-II)
- Bedøve mandlige og/eller kvindelige Sprague Dawley rotter (200-250 g; 8-9 uger gamle) med isofluran (eller injicerbar bedøvelse).
- Kontroller anæstesiens dybde ved at røre ved hornhinden og let klemme venstre bagpote. Når dyret er passende bedøvet, vil der ikke blive observeret nogen hornhinde- eller poterespons.
- Injektion under subkutant af den rigtige glabrød bagpote med 100 μL på 1% (w/v) λ-carrageenan fortyndet i fosfatbufferet saltvand (PBS)20.
- Sørg for, at der anvendes passende kontroller, f.eks. Foreløbige undersøgelser viser, at naive rotter med eller uden isoflurane har samme basale udtryk for epidermal IL-6 og NGF.
BEMÆRK: Naive rotter foretrækkes til betændelsesundersøgelser, da subkutan saltvand eller PBS forårsager en lokalbetændelse 23,37.
- Sørg for, at der anvendes passende kontroller, f.eks. Foreløbige undersøgelser viser, at naive rotter med eller uden isoflurane har samme basale udtryk for epidermal IL-6 og NGF.
- Edema af C-II rotter evalueres for at sikre carrageenanens effektivitet (figur 1)20. Bestem mængden af ødem ved at måle bagpote metatarsaltykkelsen med calipre.
- Ved 6-12 timer aflives rotter med CO2 (eller injicerbar bedøvelsesoverdosis) og skæres 1 mm x 2 mm stykker glabrous bagpote hud med skarp skalpel. Hvis der anvendes behåret hud, skal du barbere den, før du skærer de 1 mm x 2 mm stykker hud.
BEMÆRK: Sørg for, at de relevante tidspunkter vælges i henhold til de specifikke undersøgelser. - Brug mikrodissection pincet, overføre huden til 1 mL kold Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) i en mikrocentrifuge rør på is og holde koldt i 15-60 min.
2. Termolysin adskillelse af epidermis og dermis
- Forbered og aktivér termolysin.
- Der fremstilles en opløsning af termolysin ved at tilsætte 5 mg Geobacillus stearothermophilus til 10 ml PBS ved pH = 8 (koncentration 500 μg/mL).
- Der fremstilles en 1 M opløsning calciumchlorid (CaCl2 vandfri) ved at tilsætte 1,11 g til 10 ml destilleret H2O.
- For at undgå autolyse af termolysin tilsættes 10 μL calciumchlorid til 10 ml termolysinopløsning. Den endelige koncentration af calciumchlorid vil være 1 mM.
- Aliquot 1 mL aktiveret termolysin i 10 brønde af en 24 godt cellekultur plade på is.
- Brug termolysin enzym fordøjelsen til at adskille epidermis fra dermis.
- Brug microdissection pincet, overføre en hudprøve i hver brønd af aktiveret termolysin. Sørg for ikke at nedsænke huden i termolysinopløsningen.
- Bank forsigtigt på huden på siden af brønden for at hjælpe med at frigive hudprøven fra tangen for at flyde på termolysinopløsningen.
- Luft huden ind i termolysinopløsningen med stratum corneum (ydre epidermis) side op og dermis nedad. Det er afgørende, at dermis vender nedad, eller den effektive adskillelse vil ikke finde sted.
BEMÆRK: Den tid, det tager for termolysininkubationen, skal bestemmes empirisk af slutbrugeren. Glabrous, bagpoteskind fra Sprague Dawley rotter (200-250 g; 8-9 uger gammel) kræver ofte 2,0-2,5 timer for adskillelse. Inkubationstiden forventes at variere afhængigt af art og alder. - Efter den relevante inkubationstid i termolysin skal der anvendes mikrodissection-pincet til at overføre en hudprøve til en brønd med en 6-cellekulturplade med 7-8 mL kulde (4 °C) DMEM. Dette giver mere plads til adskillelse af epidermis fra dermis.
- Fordyb huden ind i DMEM.
- Børst forsigtigt epidermis med pincet omkring hudens omkreds, indtil den næsten gennemskinnelige epidermis observeres ved grænserne. Hvis dette ikke kan opnås, returneres hudprøven til termolysinopløsningen i yderligere 15-30 minutter.
- Når epidermis mærkbart adskiller sig fra dermis, så hold forsigtigt både epidermis og dermis med microdissection pincet og meget langsomt trække epidermis fra dermis.
- Vurder den isolerede epidermis translucence, og sørg for, at den er optisk konsistent. Se figur 2 for et eksempel på en prøve på 1 mm x 2 mm af rotte epidermis. Hvis der er en variation i translucence, så korrekt adskillelse har ikke fundet sted.
- Inaktiver termolysin ved hjælp af ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) i adskilte stykker epidermis og dermis.
ADVARSEL: Termolysinen, der forbliver i epidermis og dermis, er stadig aktiv og kan beskadige lagene, hvis de ikke inaktiveres.- Forbered en 0,5 M EDTA lagerløsning. For at gøre dette tilsættes langsomt 0,93 g EDTA i 5 mL dobbeltdestilleret vand. Tilsæt natriumhydroxid til opløsningen, indtil den rydder. Sørg for, at opløsningens pH-time er ~8.0.
- Lav en 5 mM EDTA løsning i DMEM. Der tilsættes 0,25 ml 0,5 M EDTA-lageropløsning til 25 ml DMEM.
- Den adskilte epidermis og dermis anbringes i 5 mM EDTA/DMEM-opløsningen ved 4 °C i 30 minutter for at deaktivere termolysinens aktivitet.
- Vurder epidermis med tinctorial histologi8,9,10.
- En del af epidermis fikseres i en 10% neutral formalin, 4% paraformaldehyd eller 0,25% paraformaldehyd med 0,8% picrinsyreopløsning i 1 time ved stuetemperatur (RT) med omrøring.
- Den faste epidermis anbringes i 10% saccharose i PBS i 1 time ved RT med omrøring.
- Frys epidermis i en vævsintegreringsmatrix til sektionsopdelning. Skær 14 μm tværsnit ved hjælp af en kryostat og optøningssektioner på gelatinebelagte glasmikroskopdias.
- Tørre sektioner på en slidevarmer og plet med en arbejdsopløsning af toluidinblå (TB; 10% TB i 1% natriumchlorid) i 90 s. Appose coverslips med et vandigt monteringsmedium.
- Overhold epidermis med brightfield mikroskopi ved 50x-250x.
BEMÆRK: Hvis der er sket korrekt adskillelse, vil epidermis blive opdelt rent fra dermis, og de fem lag vil blive opdaget: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum og stratum corneum. Et eksempel på adskilt rottehud epidermis kan ses i figur 3.
3. Proteinudvinding og analyse af vestlige pletter
- Udfør vestlig blotting på de adskilte vævsprøver ved hjælp af tidligere offentliggjort protokol21.
- Epidermis homogeniseres i 50 μL lysis buffer (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol og 1% Triton X-100), der indeholder en fosfatase- og proteasehæmmercocktail.
- Centrifugeprøver ved en maksimal hastighed i 15 minutter ved 4 °C og evaluerer supernatanten for proteinkoncentration ved hjælp af et proteinanalysesæt.
- Der indlæses lige store koncentrationer af protein (30 μg) på SDS-geler, elektrophoresis, og overfør derefter proteiner til nitrocellulose- eller PVDF-membraner.
- Blokmembraner med 5% mælk i 2 timer og inkuber natten over i primært antistof (mus anti-NGF, E12, 1:1000).
- Vask 3x med PBS med 0,3% tween i 10 min hver og inkuber med et mærket sekundært antistof (f.eks. alkaliske fosfatase mærket kanin anti-mus IgG).
- Brug et scanningssystem til at evaluere western blot-signalet (f.eks.
4. Immunohistochemistry
- Vævsprøver anbringes i et fiksativ for optimal immunoreaktivitet: 0,96 % (w/v) picrinsyre og 0,2 % (w/v) formaldehyd i 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH = 7,321,22,23 for 4 timer ved RT. Overførsel til 10 % saccharose i PBS natten over ved 4 °C.
- Udfør standard immunohistochemistry på vævssektionerne21,22,23.
- Indlejring af epidermis fra dyr i en enkelt frossen blok i indlejringsmatrixen og skær 10-30 μm sektioner på en kryostat. Afsnittene monteres på gelatinebelagte, glasmikroskopdias og tørres ved 37 °C i 2 timer.
- Vask sektioner i tre, 10 minutters skylninger i PBS og inkuberes i 24-96 timer i primær antisera ,[f.eks. mus anti-NGF (E12, 1:2000)] og kanin antiprotein genprodukt 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) fortyndet i PBS indeholdende 0,3% (w/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T med 0,5% kvæg serum albumin (BSA) og 0,5% polyvinylpyrrolidone (PVP).
- Efter primær antiserum inkubation skylles sektioner tre gange i 10 minutter i PBS og inkuberes 1 time ved RT i Alexa Fluor 488 æsel anti-kanin IgG (1:1000) og Alexa Fluor 555 æsel anti-mus IgG (1:1000) fortyndet i PBS-T.
- Skyl afsnit tre gange i PBS i 10 min og anbringe coverslips med ikke-fading montering medium til retard fading af immunfluorescens.
5. RNA-isolation og cDNA-syntese
- Udfør standard omvendt transskriptionsom polymerasekædereaktion (RT-PCR) på hudprøverne21. Isoler total RNA ved hjælp af en phenol, guanidin isothiocyanatopløsning.
- Udfør supplerende DNA syntese af Moloney murine leukæmi virus omvendt transcriptase.
- Brug følgende primersekvenser til NGF- og IL-6-forstærkning:
NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
IL-6 (Sense) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG - Sammenlign niveauerne af NGF og IL-6 mRNA med β-actin husholdning gen:
β-ACTIN (Sense) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGATGA - Vurder med kvalitativ RT-PCR ved hjælp af termisk cyklus og kvantitativ pcr i realtid (qRT-PCR) ved hjælp af et qRT-PCR-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Carrageenan injektion i rotten bagpote forårsaget klassiske symptomer på betændelse såsom rødme og ødem16,17. Hævelsen af bagpoten blev målt med mekaniske calipre20. En basisværdi af potens tykkelse blev opnået for hver rotte før carrageenanbehandling og målt igen ved 6 timer og 12 timer. Potetykkelsen blev øget betydeligt i forhold til basisværdierne (figur 1).
Termolysin inkubation af rotte glabrous bagpote huden produceret et ark epidermis. Brightfield mikroskopi blev brugt til at vurdere effektiviteten af termolysin adskillelse af epidermis og dermis (Figur 2). Lagene i epidermis kunne bestemmes, mens der fokuseres gennem arket ved højere forstørrelse. Toluidinblå farvning af epidermale tværsnit viste, at epidermis var adskilt fra dermis i kælderenmembranen (Figur 3). De epidermale rete højderygge (epidermale pløkker) sammen med fordybningerne fra dermal papillae var intakte. Alle keratinocytcellelag blev observeret.
Vestlig blotting af termolysinsepareret epidermis gav ensartede resultater, der indikerede stabile proteinniveauer under teknikken ved 4 °C. Der blev påvist meget lidt NGF-protein i naiv rotte-epidermis, men NGF-proteinindholdet blev reguleret (250%) efter 6 timer C-II sammenlignet med naive dyr (figur 4). Efter 12 timer af C-II blev NGF-niveauerne reduceret sammenlignet med 6 timer, men forblev forhøjede (55%) i forhold til kontrollerne. Immunohistochemistry for NGF i den adskilte epidermis gav pålidelig immunostaining og bekræftede resultaterne fra vestlige blots (Figur 5). NGF-immunoreactivity (ir) blev ikke påvist i naiv kontrol epidermis, men ved 6 timer C-II var der NGF-ir i de fleste af keratinocytterne i stratum granulosum og stratum lucidum. Nogle få celler til stratum spinosum var NGF-immunoreaktive (IR) ved 6 h C-II. Ved 12 timer C-II, fandt NGF-ir i keratinocytter af stratum granulosum og stratum lucidum med nogle celler i stratum granulosum intenst NGF-IR. På intet tidspunkt blev NGF-ir opdaget i stratum basale eller stratum corneum. PGP9.5-IR intraepidermal, var åreknuder nervefibre til stede i den adskilte epidermis fra naive og C-II rotter (Figur 5).
Kvalitativ RT-PCR viste, at der var mRNA af god kvalitet fra termolysinsepareret epidermis (Figur 6A, Figur 7A). Ved hjælp af actin som husholdningsgen for kvantitativ PCR i realtid blev NGF mRNA-ekspressionen i epidermis under C-II betydeligt forhøjet (>3 gange) ved 6 timer sammenlignet med naive rotter (Figur 6B). Ved 12 timer vendte NGF mRNA tilbage til basisniveauet(figur 6B). Ved hjælp af actin som husholdningsgen for kvantitativ real-time PCR blev IL-6 mRNA i epidermis under C-II betydeligt forhøjet (>6 gange) ved 6 timer sammenlignet med naive rotter (Figur 7B). Ved 12 timer faldt IL-6 mRNA-niveauet betydeligt fra de 6 timers mængder, men forblev forhøjet (2 gange) sammenlignet med naive rotter(figur 7B).
Figur 1: Carrageenan injektion producerer pote ødem.
Der blev opnået en basisværdi for hver rotte før carrageenanbehandling. Efter 6 timer og 12 timers behandling steg potetykkelsen betydeligt sammenlignet med basisværdierne. Resultaterne udtrykkes som SEM med seks rotter pr. behandling (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; studerendes t-test, uparret, to-hale, blev udført på hvert tidspunkt). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Termolysin frembringer et ark epidermis.
Brightfield mikroskopi afslørede en gennemskinnelig epidermal ark ca 1 mm x 2 mm i størrelse. Lagene i epidermis kunne bestemmes, mens der fokuseres gennem arket ved højere forstørrelse. Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Blå pletter af toluidin af epidermis.
Brightfield mikroskopi fastslået, at thermolysin forårsaget en effektiv adskillelse af epidermis fra dermis. Epidermal rete højderygge (epidermale pløkker; pilespidser) blev observeret sammen med fordybninger fra dermal papillae (pile). Alle keratinocytcellelag var intakte. SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum, SC: stratum corneum. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: NGF-proteinudtryk i epidermis under carrageenan-induceret inflammation.
NGF-niveauet blev forhøjet (250%) efter 6 h inflammation sammenlignet med naive dyr. Efter 12 timer blev niveauerne reduceret sammenlignet med 6 timer, men blev forhøjet (55%) i modsætning til naive dyr. Resultaterne udtrykkes som SEM med tre rotter pr. gruppe (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; studerendes t-test, uparret, to-hale blev udført på hvert tidspunkt) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: NGF og PGP9.5 immunoreaktivitet (ir) under C-II.
Kolonne A, B, C viser NGF-ir, PGP9.5-ir og DAPI atombegæring, mens kolonne A1-C1 kun viser NGF-ir. I alle billeder er stratum corneum mod venstre og stratum basale mod højre. NGF-ir blev ikke opdaget i naiv kontrol epidermis (A, A1). Ved 6 timer C-II (B, B1)var NGF-ir til stede i de fleste keratinocytter af stratum granulosum (korte pile) og stratum lucidum (lange pile). Et par celler til stratum spinosum var NGF-ir på 6 h C-II (store pilespidser). Ved 12 timer C-II (C, C1) fandt NGF-ir sted i keratinocytter af stratum granulosum og stratum lucidum (lange pile) med nogle celler i stratum granulosum intenst NGF-ir (korte pile). På intet tidspunkt blev NGF-ir opdaget i stratum basale eller stratum corneum. PGP9.5-ir intraepidermale nervefibre var til stede i adskilt epidermis fra naive og C-II rotter (små pilespidser, A-C). SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: NGF mRNA under carrageenan-induceret inflammation.
NGF mRNA-ekspression i termolysinsepareret epidermis under C-II blev evalueret af kvalitativ PCR (A) og kvantitativ real-time PCR (B). Kvalitative mRNA blots (A) for NGF og actin viste, at der var god kvalitet mRNA, der kunne evalueres under inflammation. NGF mRNA udtryk i epidermis under C-II blev evalueret af kvantitative realtid PCR bruger actin som en husholdning gen (B). NGF mRNA var betydeligt forhøjet (>3 gange) efter 6 timer af C-II sammenlignet med naive ubehandlede rotter, men niveauerne vendte tilbage til baseline ved 12 timer (B). Resultaterne udtrykkes som SEM med tre rotter pr. gruppe (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; studerendes t-test, uparret, to-hale blev udført på hvert tidspunkt). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: IL-6 mRNA under carrageenan-induceret inflammation.
IL-6 mRNA-ekspression i termolysinsepareret epidermis under C-II blev evalueret af kvalitativ PCR (A) og kvantitativ real-time PCR (B). Kvalitative mRNA blots (A) for IL-6 og actin viste, at der var god kvalitet mRNA til evaluering under inflammation. IL-6 mRNA-ekspression i epidermis under C-II blev evalueret af kvantitativ pcr i realtid ved hjælp af actin som husholdningsgen (B). IL-6 mRNA var signifikant forhøjet (>6 gange) efter 6 timer af C-II sammenlignet med naive ubehandlede rotter (B). Ved 12 timer blev IL-6 mRNA-niveauet reduceret betydeligt fra 6 h niveauer, men forblev forhøjet (2 gange) sammenlignet med naive rotter (B). Resultaterne udtrykkes som middelSE.M. med to rotter pr. gruppe (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, studerendes t-test, uparret, to-hale blev udført på hvert tidspunkt). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelsen fastslog, at epidermis af rotte bagpote glabrous hud let blev adskilt fra dermis ved hjælp af termolysin (0,5 mG/mL) i PBS med 1 mM calciumchlorid ved 4 °C i 2,5 timer. Histologiske evaluering viste, at epidermis var adskilt fra dermis i kælderen membranen, og at den epidermale rete kamme var intakte. Thermolysin er en ekstracellulær metalloendopeptidase produceret af Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Dens aktivitet er stabil ved 4 °C , men er funktionel over en lang række temperaturer10,24,25. Dette enzym er i vid udstrækning blevet anvendt til proteinkemi24,25, men flere grupper har vist, at det anvendes til hudadskillelse i epidermale og/eller dermale plader4,8,10,26,27. Walzer et al. var de første til at rapportere epidermal-dermal adskillelse af menneskers hud ved hjælp af termolysin ved 4 °C (250-500 μg/mL i 1 time)10. Med lys og elektronmikroskopi blev adskillelsen bestemt til at forekomme ved den epidermale kældermembran mellem laminin og det bulløse pemphigoidantigensted10.
Desuden blev hemidesmosomes, vedhæftede filer af basale keratinocytter til kælderen membranen, forstyrret selektivt10,29. Rakhorst et al. sammenlignet termolysin (4 °C, 500 μg/mL, natten over) for at sprede sig til epidermal-dermal adskillelse af kanin buccal slimhinde8. Termolysin var ufuldstændig med hensyn til at adskille slimhinde-epidermis fra dermis, hvilket betyder, at der kan forekomme forskelle for arter, inkubationstid, opløsningssammensætning (ingen CaCl2 for at forhindre termolysin autolyse24), termolysinkilde og/eller stedspecifikke forskelle angivet fra andre undersøgelser10,26,27. Slutbrugere af den nuværende protokol bør sørge for at bruge frisk termolysin og altid medtage calciumchlorid, men bør også være opmærksomme på disse potentielle begrænsninger.
Selv om nogle efterforskere har anvendt termolysin ved 37 °C26,29, bør brugerne af denne protokol være opmærksomme på at holde hudvæv ved 4 °C for at bevare stabiliteten af protein og mRNA. Vi brugte DMEM ved 4 °C som en opløsning til huden før og efter termolysinadskillelse på grund af dets anvendelighed til at opretholde celler ikultur 28, og det har tidligere været brugt til hudadskillelse med termolysin8,26,27,30,31. Walzer et al. brugte steril PBS suppleret med 200 μG/mL streptomycin, 200 U/mL penicillin og 2,5 μg/mL svampezone10, mens andre har brugt forskellige medier (f.eks. keratinocytkulturmedier fri for epidermal vækstfaktor) efterfulgt af PBS-skylning29.
I protokollen blev termolysinadskillelse udført i 500 μg/mL termolysin og 5 mM calciumchlorid i PBS (pH = 8), svarende til den oprindelige metode10. DMEM er blevet anvendt som opløsning til termolysinadskillelse ved 4 °C (natten over)8, og HEPES-bufferen er blevet anvendt effektivt med 500 μG/mL termolysinopløsning ved 37 °C i 2 h29. Vi undersøgte dog ikke, hvordan kulturmediet eller andre buffere påvirker termolysinens aktivitet for epidermal-dermal adskillelse. Calciumchlorid er et vigtigt supplement til at reducere autolyse af termolysin24,32 og sletning af dette trin kan føre til ufuldstændig kavalergang af epidermis fra dermis8.
Hudprøvens størrelse synes at påvirke den tid, der er nødvendig for termolysininkubation, og effektiviteten af epidermisens enzymatiske kavalergang fra dermis. Efterforskere skal vurdere den passende prøvestørrelse og inkubationstid for deres eget væv. Flydende prøverne på termolysinopløsningen med epidermis opad er vigtig for optimal enzymeffektivitet10. Som tidligere nævnt er handlingsstedet for termolysin ved keratinocyte hemidesmosomer og kældermembran4,10,29; derfor virker termolysin indad fra hudens kanter. Fra vores erfaring adskilles hudkanterne tidligere end midten af prøven, og det er vigtigt at give tilstrækkelig tid til fuldstændig enzymatisk kavalergang. Når kavalergangen er færdig, skal epidermis trække sig let væk fra dermis. Hvis den stadig er fastgjort, kan træk på lagene forårsage dele af dermis at komme væk med epidermis.
En begrænsning af termolysinteknikken er den tid, det tager. En forøgelse af termolysinkoncentrationen ud over 500 μG/mL reducerer ikke tiden for adskillelse, og epidermis bevares dårlige ved højerekoncentrationer 10. Epidermal-dermale separationsmetoder er for nylig blevet gennemgået4, og mange metoder tager 30-60 min ved 20-40 °C. Varme (50-60 °C) adskillelse af huden sker hurtigt (30 s til 10 min)4, men proteiner og mRNA er kendt for at nedbrydes hurtigt ved så høje temperaturer. Alternativt kan natriumthocyanat (2 N) ved RT være en acceptabel hurtig separationsteknik (5 min.4,6, men protein- og mRNA-integritet er ikke blevet undersøgt med denne metode6. Den kolde termolysinmetode blev valgt til konservering af protein og mRNA, men der blev ikke foretaget nogen direkte sammenligninger mellem protein og mRNA-integritet ved hjælp af andre teknikker.
I denne undersøgelse, kold thermolysin fordøjelsen er påvist at være en effektiv metode til at adskille epidermis fra dermis for vurdering af mRNA og protein ændringer under inflammation. Under carrageenan-induceret inflammation blev NGF mRNA og proteinniveauer og IL-6 mRNA-niveauer forhøjet ved 6 timer og vendte tilbage tæt på baseline med 12 timer. Med immunhistokemi blev NGF immunoreaktiviteten øget i keratinocytter ved 6 timer og 12 timer. En fordel ved termolysinmetoden er evnen til at udføre stedselektiv analyse. For eksempel er den øgede produktion af NGF og IL-6 i den aktuelle undersøgelse fra keratinocytter, da dermale celler er udelukket fra assays. Denne metode giver mulighed for indsigt i placering og mæglertyper til sensibilisering af primære afferente terminaler33. Derudover giver denne metode mulighed for bedre forståelse af tidsforløbet for neurotropinproduktion sammen med optagelse og transport i primære afferenter underinflammation 34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Finansieringen af denne forskning blev ydet af National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
