Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de scheiding van epidermis van dermis om de productie van ontstekingsmediators te evalueren. Na ontsteking wordt de epidermis van de achterpoot van de rat gescheiden door thermolysine bij 4 °C. De epidermis wordt vervolgens gebruikt voor mRNA-analyse door RT-PCR en eiwitevaluatie door westerse vlek en immunohistochistry.
Abstract
Eenvoudig te gebruiken en goedkope technieken zijn nodig om de site-specifieke productie van ontstekingsmediators en neurotrofinen tijdens huidletsel, ontsteking en / of sensibilisatie te bepalen. Het doel van deze studie is om een epidermale-dermale scheidingsprotocol te beschrijven met behulp van thermolysine, een proteïnase dat actief is bij 4 °C. Om deze procedure te illustreren, worden Sprague Dawley-ratten verdoofd en worden rechterachterpoten geïnjecteerd met carrageen. Zes en twaalf uur na injectie worden ratten met ontstekingen en naïeve ratten geëuthanaseerd en een stukje achterpoot, glabroushuid wordt in het gemodificeerde adelaarsmedium van koude Dulbecco geplaatst. De epidermis wordt vervolgens in het keldermembraan van de dermis gescheiden door thermolysine in PBS met calciumchloride. Vervolgens wordt de dermis vastgezet door microdissectie-tang en wordt de epidermis voorzichtig weg geplaagd. Toluidine blauwe kleuring van weefselsecties tonen aan dat de epidermis netjes wordt gescheiden van de dermis op het keldermembraan. Alle keratinocytcellagen blijven intact en de epidermale reteruggen samen met inkepingen van dermale papillen worden duidelijk waargenomen. Kwalitatieve en real-time RT-PCR wordt gebruikt om zenuwgroeifactor en interleukine-6 expressieniveaus te bepalen. Westerse blotting en immunohistochie worden eindelijk uitgevoerd om hoeveelheden zenuwgroeifactor te detecteren. Dit rapport illustreert dat koude thermolysinevertering een effectieve methode is om epidermis van dermis te scheiden voor evaluatie van mRNA en eiwitveranderingen tijdens ontsteking.
Introduction
Evaluatie van inflammatoire mediatoren en neurotrofe factoren van de huid kan worden beperkt als gevolg van de heterogeniteit van celtypen gevonden in de ontstoken dermis en epidermis1,2,3. Verschillende enzymen, chemische, thermische of mechanische technieken waarbij de twee lagen worden gescheiden of voor het uitvoeren van celdissociatie voor evaluatie zijn onlangs herzien4. Zuur, alkali, neutraal zout en warmte kunnen de epidermis van dermis snel verdelen, maar cellulaire en extracellulaire zwelling treedt vaak op5,6. Trypsine, pancreatin, elastase, keratinase, collagenase, pronase, dispase en thermolysine zijn enzymen die zijn gebruikt voor epidermale-dermale scheiding4,7. Trypsine en andere proteolytische enzymen op grote schaal zijn actief bij 37-40 °C, maar moeten zorgvuldig worden gecontroleerd om dissociatie van epidermale lagen te voorkomen. Dispase splijt de epidermis bij de lamina densa, maar vereist 24 uur voor scheiding in de koude4,8 of kortere tijdspunten bij 37 °C4,9. Een beperkend kenmerk van al deze technieken is de mogelijke verstoring van weefselmorfologie en verlies van integriteit van mRNA en eiwitten.
Om de integriteit van mRNA en eiwitten te behouden, moet een huidscheidingsmethode gedurende een korte periode in de kou worden uitgevoerd. Bij het evalueren van huidscheidingstechnieken voor ontstekingsstudies is thermolysine een effectief enzym om de opperhuid van dermis te scheiden bij koude temperaturen4. Thermolysine is actief bij 4 °C, splijt epidermale hemidesmosomen van de lamina lucida en scheidt de epidermis van dermis binnen 1–3 h4,8,10. Het doel van dit rapport is om het gebruik van thermolysine te optimaliseren voor de scheiding van ontstoken rattenepidermis van dermis om mRNA- en eiwitniveaus voor ontstekingsmediators en neurotrofe factoren te detecteren. Er zijn verschillende voorlopige verslagen gepresenteerd11,12,13,14,15. Het doel van dit manuscript is om een optimale huidscheidingstechniek met thermolysine te beschrijven en de detectie van 1) markers van ontsteking, 2) interleukine-6 (IL-6) mRNA, en 3) zenuwgroeifactor (NGF) mRNA en eiwit in de epidermis van ratten met carrageen-geïnduceerde ontsteking (C-II)16,17. Een voorlopig rapport met behulp van het volledige Freund's adjuvansmodel geeft aan dat de NGF mRNA- en eiwitspiegels vroeg toenemen tijdens ontsteking15. Bij muizen veroorzaakt huidsensibilisatie met de topische toepassing van oxazolone een vroege stijging van het IL-6 mRNA met behulp van in situ hybridisatie36. Zowel IL-6 als NGF zijn betrokken bij C-II18,19, maar er zijn geen rapporten die mRNA- of eiwitniveaus voor IL-6 of NGF specifiek beschrijven vanuit de epidermis tijdens de acute stadia van C-II.
De thermolysinetechniek is goedkoop en eenvoudig uit te voeren. Bovendien maakt thermolysinescheiding van de epidermis van dermis mRNA, westelijke vlek en immunohistochemische analyse van ontstekingsmediators en neurotrofe factoren tijdens het ontstekingsprocesmogelijk 15. Onderzoekers moeten deze techniek gemakkelijk kunnen gebruiken in zowel preklinische als klinische studies naar huidontsteking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Door carrageen veroorzaakte ontsteking (C-II)
- Verdoof mannelijke en/of vrouwelijke Sprague Dawley ratten (200–250 g; 8–9 weken oud) met isofluraan (of injecteerbaar verdovingsmiddel).
- Controleer de diepte van de anesthesie door het hoornvlies aan te raken en de linker achterpoot lichtjes te knijpen. Wanneer het dier op de juiste manier wordt verdoofd, wordt geen hoornvlies- of pootrespons waargenomen.
- Subcutaan injecteren van de rechter glabrous, achterpoot met 100 μL van 1% (m/v) λ-carrageen verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)20.
- Zorg ervoor dat in dit rapport de juiste besturingselementen worden gebruikt, zoals naïeve ratten zonder isofluraan. Voorlopige studies tonen aan dat naïeve ratten met of zonder isofluraan dezelfde basale expressie van epidermale IL-6 en NGF hebben.
OPMERKING: Naïeve ratten hebben de voorkeur voor ontstekingsstudies, omdat onderhuidse zoutoplossing of PBS een lokale ontsteking veroorzaken23,37.
- Zorg ervoor dat in dit rapport de juiste besturingselementen worden gebruikt, zoals naïeve ratten zonder isofluraan. Voorlopige studies tonen aan dat naïeve ratten met of zonder isofluraan dezelfde basale expressie van epidermale IL-6 en NGF hebben.
- Evalueer het oedeem van C-II ratten om de werkzaamheid van het carrageen te garanderen (Figuur 1)20. Bepaal de hoeveelheid oedeem door de metatarsale dikte van de achterpoot te meten met remklauwen.
- Euthanaseer ratten met CO2 (of injecteerbare verdovingsoverdosis) en snijd 1 mm x 2 mm stukjes glabrous achterpoothuid met scherpe scalpel. Als een harige huid wordt gebruikt, scheer deze dan voordat u de 1 mm x 2 mm stukjes huid snijdt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de juiste tijdspunten worden gekozen op basis van de specifieke studies. - Breng de huid met behulp van microdissectie-tang over in 1 ml koude Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) in een microcentrifugebuis op ijs en houd deze 15-60 minuten koud.
2. Thermolysine scheiding van epidermis en dermis
- Thermolysine voorbereiden en activeren.
- Bereid een oplossing van thermolysine voor door 5 mg Geobacillus stearothermophilus toe te voegen aan 10 ml PBS, bij pH = 8 (concentratie 500 μg/ml).
- Bereid een 1 M oplossing van calciumchloride (CaCl2 watervrij) door 1,11 g toe te voegen aan 10 ml gedestilleerde H2O.
- Om autolyse van thermolysine te voorkomen, voegt u 10 μL calciumchloride toe aan 10 ml thermolysineoplossing. De calciumchloride eindconcentratie zal 1 mM zijn.
- Aliquot 1 ml geactiveerd thermolysine in 10 putten van een 24 putcelkweekplaat op ijs.
- Gebruik thermolysine enzymvertering om de epidermis van dermis te scheiden.
- Breng met behulp van microdissectie-tang één huidmonster over in elke put van geactiveerd thermolysine. Zorg ervoor dat u de huid niet onderdompelt in de thermolysineoplossing.
- Tik voorzichtig op de huid aan de zijkant van de put om te helpen bij het vrijgeven van het huidmonster van de tang om op de thermolysineoplossing te drijven.
- Drijf de huid in de thermolysineoplossing met de stratum corneum (buitenste epidermis) naar boven en dermis naar beneden. Het is van cruciaal belang dat de dermis naar beneden kijkt, anders zal de effectieve scheiding niet plaatsvinden.
OPMERKING: De tijdsduur voor thermolysine incubatie moet empirisch worden bepaald door de eindgebruiker. Glabrous, achterpoothuid van Sprague Dawley ratten (200-250 g; 8-9 weken oud) heeft vaak 2,0-2,5 uur nodig voor scheiding. De incubatietijd zal naar verwachting variëren afhankelijk van soort en leeftijd. - Gebruik na de juiste incubatietijd in thermolysine microdissection forceps om één huidmonster over te brengen in een put van een 6-put celkweekplaat met 7-8 ml koude (4 °C) DMEM. Hierdoor is er meer ruimte voor scheiding van de opperhuid van de dermis.
- Dompel de huid onder in de DMEM.
- Borstel de opperhuid voorzichtig met de tang rond de omtrek van de huid totdat de bijna doorschijnende epidermis aan de randen wordt waargenomen. Als dit niet kan worden bereikt, breng het huidmonster dan nog 15-30 minuten terug naar de thermolysineoplossing.
- Zodra de epidermis merkbaar van de dermis scheidt, houd dan voorzichtig zowel de epidermis als de dermis vast met microdissectie-tang en trek heel langzaam de epidermis uit de dermis.
- Evalueer de doorschijnendheid van de geïsoleerde epidermis en zorg ervoor dat deze optisch consistent is. Zie figuur 2 voor een voorbeeld van een monster van 1 mm x 2 mm rattenepidermis. Als er een variatie in de doorschijnendheid is, is er geen goede scheiding opgetreden.
- Inactiveer thermolysine met behulp van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in de gescheiden stukken epidermis en dermis.
LET OP: Het thermolysine dat in de opperhuid en dermis achter blijft, is nog steeds actief en kan de lagen beschadigen als het niet wordt geïnactiveerd.- Bereid een 0,5 M EDTA-voorraadoplossing voor. Voeg hiervoor langzaam 0,93 g EDTA toe aan 5 ml dubbel gedestilleerd water. Voeg natriumhydroxide toe aan de oplossing totdat het leeg is. Zorg ervoor dat de pH van de oplossing ~8,0 is.
- Maak een 5 mM EDTA oplossing in DMEM. Voeg 0,25 ml 0,5 m EDTA-stamoplossing toe aan 25 ml DMEM.
- Plaats de gescheiden epidermis en dermis gedurende 30 minuten in de 5 mM EDTA/DMEM-oplossing bij 4 °C om de activiteit van thermolysine te deactiveren.
- Evalueer de epidermis met tinctoriale histologie8,9,10.
- Fixeer een deel van de opperhuid in een 10% neutrale formaline, 4% paraformaldehyde of 0,25% paraformaldehyde met 0,8% picrinezuuroplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) met agitatie.
- Plaats de vaste opperhuid in 10% sucrose in PBS gedurende 1 uur bij RT met agitatie.
- Bevries de opperhuid in een weefselinbeddingsmatrix voor doorsneden. Snijd 14 doorsneden van μm met behulp van een cryostaat en dooi-mount secties op gelatine-gecoate glazen microscoop dia's.
- Droge secties op een schuifwarmer en vlek met een werkoplossing van toluidineblauw (TB; 10% TB in 1% natriumchloride) gedurende 90 s. Appose coverslips met een waterig montagemedium.
- Observeer de epidermis met brightfield microscopie op 50x–250x.
OPMERKING: Als een goede scheiding heeft plaatsgevonden, wordt de epidermis netjes gescheiden van de dermis en worden de vijf lagen gedetecteerd: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum en stratum corneum. Een voorbeeld van gescheiden rattenhuideplicdermis is te zien in figuur 3.
3. Eiwitextractie en westerse vlekanalyse
- Voer western blotting uit op de gescheiden weefselmonsters met behulp van eerder gepubliceerd protocol21.
- Homogeniseer de epidermis in 50 μL lysisbuffer (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol en 1% Triton X-100) met een fosfatase- en proteaseremmercocktail.
- Centrifugeer monsters op een maximale snelheid gedurende 15 minuten bij 4 °C en evalueer het supernatant op eiwitconcentratie met behulp van een eiwittestkit.
- Laad gelijke concentraties eiwit (30 μg) op SDS-gels, voer elektroforese uit en breng eiwitten vervolgens over naar nitrocellulose of PVDF-membranen.
- Blokkeer membranen met 5% melk gedurende 2 uur en incubeer 's nachts in primair antilichaam (muis anti-NGF, E12, 1:1000).
- Was 3x met PBS met 0,3% tween gedurende elk 10 minuten en incubeer met een gelabeld secundair antilichaam (bijv. alkalische fosfatase gelabeld konijn antimuis IgG).
- Gebruik een scansysteem om het westelijke vleksignaal te evalueren (bijv. ECF-substraat en een beeldvormingsplatform).
4. Immunohistochie
- Plaats weefselmonsters in een fixatief voor optimale immunoreactiviteit: 0,96% (m/v) picrinezuur en 0,2% (m/v) formaldehyde in 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH = 7,321,22,23 gedurende 4 uur bij RT. Overdracht naar 10% sacharose in PBS 's nachts bij 4 °C.
- Voer standaard immunohistochie uit op de weefselsecties21,22,23.
- Integreer de opperhuid van dieren in één bevroren blok in de inbeddingsmatrix en snijd 10-30 μm secties op een cryostaat. Monteer de secties op gelatineomhulde, glazen microscoopglaasjes en droog gedurende 2 uur bij 37 °C.
- Was secties gedurende drie, 10 minuten spoelen in PBS en incubeer gedurende 24-96 uur in primaire antisera, [bijv. muis anti-NGF (E12, 1:2000)] en konijn anti-eiwit genproduct 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) verdund in PBS met 0,3% (m/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 0,5% runderserumalbumine (BSA).
- Spoel na primaire antiserum incubatie driemaal gedurende 10 minuten secties in PBS en incubeer 1 uur bij RT in Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn IgG (1:1000) en Alexa Fluor 555 ezel anti-muis IgG (1:1000) verdund in PBS-T.
- Spoel secties driemaal in PBS gedurende 10 minuten en breng coverslips aan met een niet-vervagend montagemedium om het vervagen van immunofluorescentie te vertragen.
5. RNA-isolatie en cDNA-synthese
- Voer standaard reverse transcriptase polymerase kettingreactie (RT-PCR) uit op de huidmonsters21. Isoleer totaal RNA met behulp van een fenol, guanidine isothiocyanaat oplossing.
- Voer aanvullende DNA-synthese uit door Moloney murine leukemie virus reverse transcriptase.
- Gebruik de volgende primersequenties voor NGF- en IL-6-versterking:
NGF (ZinTUIG) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
IL-6 (Betekenis) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG - Vergelijk de niveaus van NGF en IL-6 mRNA met β-actine huishoudgen:
β-ACTIN (Betekenis) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - Evalueer met kwalitatieve RT-PCR met behulp van thermische cycler en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) met behulp van een qRT-PCR-systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Carrageeninjectie in de achterpoot van de rat veroorzaakte klassieke symptomen van ontsteking zoals roodheid en oedeem16,17. De zwelling van de achterpoot werd gemeten met mechanische remklauwen20. Een basiswaarde van de dikte van de poot werd voor elke rat vóór de behandeling met carrageen verkregen en opnieuw gemeten bij 6 uur en 12 uur. De pootdikte is aanzienlijk toegenomen in vergelijking met de uitgangswaarden (figuur 1).
Thermolysine incubatie van de rat glabrous achterpoothuid produceerde een vel epidermis. Brightfield-microscopie werd gebruikt om de effectiviteit van thermolysinescheiding van de epidermis en dermis te evalueren (figuur 2). De lagen van de opperhuid konden worden bepaald terwijl ze bij een hogere vergroting door het blad scherpstelden. Toluidineblauwe kleuring van epidermale doorsneden toonde aan dat de opperhuid gescheiden was van de dermis in het keldermembraan (figuur 3). De epidermale reteruggen (epidermale haringen) samen met de inkepingen van dermale papillen waren intact. Alle keratinocyt cellagen werden waargenomen.
Westerse blotting van thermolysine-gescheiden epidermis leverde consistente resultaten op die wijzen op stabiele eiwitniveaus tijdens de techniek bij 4 °C. Zeer weinig NGF-eiwit werd gedetecteerd in naïeve rattenepidermis, maar de NGF-eiwitniveaus werden geherreguleerd (250%) na 6 uur C-II in vergelijking met naïeve dieren (Figuur 4). Na 12 uur C-II werden de NGF-spiegels verlaagd ten opzichte van 6 uur, maar bleven ze verhoogd (55%) ten opzichte van de controles. Immunohistochie voor NGF in de gescheiden epidermis leverde betrouwbare immunostaining en bevestigde de resultaten van westerse vlekken (Figuur 5). NGF-immunoreactiviteit (ir) werd niet gedetecteerd bij naïeve controle-epidermis, maar bij 6 uur C-II was er NGF-ir in de meeste keratinocyten van het stratum granulosum en stratum lucidum. Enkele cellen voor het stratum spinosum waren NGF-immunoreactief (IR) bij 6 h C-II. Bij 12 h C-II trad NGF-ir op in keratinocyten van het stratum granulosum en stratum lucidum met sommige cellen in stratum granulosum intens NGF-IR. Op geen enkel moment werd NGF-ir gedetecteerd in stratum basale of stratum corneum. PGP9.5-IR intra-epiepiderale, spataderzenuwvezels waren aanwezig in de gescheiden epidermis van naïeve en C-II ratten (Figuur 5).
Kwalitatieve RT-PCR toonde aan dat er mRNA van goede kwaliteit was uit thermolysine-gescheiden epidermis (figuur 6A, figuur 7A). Met actine als huishoudgen voor kwantitatieve real-time PCR was de NGF mRNA-expressie in epidermis tijdens C-II significant verhoogd (>3-voudig) bij 6 uur in vergelijking met naïeve ratten (figuur 6B). Om 12 uur keerde NGF mRNA terug naar baseline niveaus (Figuur 6B). Met actine als huishoudgen voor kwantitatieve real-time PCR was IL-6 mRNA in epidermis tijdens C-II significant verhoogd (>6-voudig) bij 6 uur in vergelijking met naïeve ratten (Figuur 7B). Bij 12 uur daalden de IL-6 mRNA-spiegels aanzienlijk ten opzichte van de hoeveelheden van 6 uur, maar bleven verhoogd (2-voudig) in vergelijking met naïeve ratten (figuur 7B).
Figuur 1: Carrageeninjectie veroorzaakt pootoedeem.
Voor elke rat werd een uitgangswaarde verkregen voorafgaand aan de behandeling met carrageen. Na 6 uur en 12 uur behandeling nam de pootdikte aanzienlijk toe in vergelijking met de uitgangswaarden. De resultaten worden uitgedrukt als de SEM met zes ratten per behandeling (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; de t-test van de student, ongepaard, tweestaarts, werd op elk tijdstip uitgevoerd). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Thermolysine produceert een vel epidermis.
Brightfield microscopie onthulde een doorschijnend epidermaal blad van ongeveer 1 mm x 2 mm groot. De lagen van de opperhuid konden worden bepaald terwijl ze bij een hogere vergroting door het blad scherpstelden. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Toluidine blauwe kleuring van de opperhuid.
Brightfield microscopie bepaalde dat thermolysine een effectieve scheiding van de opperhuid van dermis veroorzaakte. Epidermale reteruggen (epidermale pinnen; pijlpunten) werden waargenomen samen met inkepingen van dermale papillen (pijlen). Alle keratinocyt cellagen waren intact. SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum, SC: stratum corneum. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: NGF eiwitexpressie in epidermis tijdens carrageen-geïnduceerde ontsteking.
De NGF-spiegels werden verhoogd (250%) na 6 uur ontsteking in vergelijking met naïeve dieren. Na 12 uur werden de niveaus verlaagd ten opzichte van 6 uur, maar verhoogd (55%) in tegenstelling tot naïeve dieren. De resultaten worden uitgedrukt als de SEM met drie ratten per groep (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; de t-toets van de student, ongepaard, tweestaartig werd op elk tijdstip uitgevoerd) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: NGF en PGP9.5 immunoreactiviteit (ir) tijdens C-II.
Kolommen A,B,C tonen NGF-ir, PGP9.5-ir en DAPI nucleaire kleuring, terwijl kolommen A1-C1 alleen NGF-ir weergeven. In alle afbeeldingen is stratum corneum naar links en stratum basale naar rechts. NGF-ir werd niet gedetecteerd in naïeve controle-epidermis (A, A1). Bij 6 h C-II (B,B1)was NGF-ir aanwezig in de meeste keratinocyten van het stratum granulosum (korte pijlen) en stratum lucidum (lange pijlen). Enkele cellen voor het stratum spinosum waren NGF-ir bij 6 h C-II (grote pijlpunten). Bij 12 h C-II (C,C1) trad NGF-ir op in keratinocyten van het stratum granulosum en stratum lucidum (lange pijlen) met sommige cellen in stratum granulosum intens NGF-ir (korte pijlen). Op geen enkel moment werd NGF-ir gedetecteerd in stratum basale of stratum corneum. PGP9.5-ir intraepidermal zenuwvezels waren aanwezig in de gescheiden epidermis van naïeve en C-II ratten (kleine pijlpunten, A-C). SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: NGF mRNA tijdens carrageen-geïnduceerde ontsteking.
NGF mRNA expressie in thermolysine-gescheiden epidermis tijdens C-II werd geëvalueerd door kwalitatieve PCR (A) en kwantitatieve real-time PCR (B). Kwalitatieve mRNA-vlekken (A) voor NGF en actine toonden aan dat er mRNA van goede kwaliteit was dat tijdens ontstekingen kon worden geëvalueerd. NGF mRNA expressie in epidermis tijdens C-II werd geëvalueerd door kwantitatieve real-time PCR met behulp van actine als een housekeeping gen (B). NGF mRNA was significant verhoogd (>3-voudig) na 6 uur C-II in vergelijking met naïeve onbehandelde ratten, maar de niveaus keerden terug naar de uitgangswaarde na 12 uur (B). De resultaten worden uitgedrukt als de SEM met drie ratten per groep (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; de t-test van de student, ongepaard, tweestaart werd op elk tijdstip uitgevoerd). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: IL-6 mRNA tijdens carrageen-geïnduceerde ontsteking.
IL-6 mRNA expressie in thermolysine-gescheiden epidermis tijdens C-II werd geëvalueerd door kwalitatieve PCR (A) en kwantitatieve real-time PCR (B). Kwalitatieve mRNA-vlekken (A) voor IL-6 en actine toonden aan dat er mRNA van goede kwaliteit was voor evaluatie tijdens ontsteking. IL-6 mRNA expressie in epidermis tijdens C-II werd geëvalueerd door kwantitatieve real-time PCR met behulp van actine als een housekeeping gen (B). IL-6 mRNA was significant verhoogd (>6-voudig) na 6 uur C-II in vergelijking met naïeve onbehandelde ratten (B). Na 12 uur werden de IL-6 mRNA-spiegels significant verlaagd van 6 uur, maar bleven ze verhoogd (2-voudig) in vergelijking met naïeve ratten (B). De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde S.E.M. met twee ratten per groep (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, student's t-test, ongepaard, tweestaart werd uitgevoerd op elk tijdstip). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De studie stelde vast dat de epidermis van de glabroushuid van de achterpoot van ratten gemakkelijk van dermis kon worden gescheiden met behulp van thermolysine (0,5 mG/ml) in PBS met 1 mM calciumchloride bij 4 °C gedurende 2,5 uur. Histologische evaluatie wees uit dat de epidermis gescheiden was van de dermis op het keldermembraan en dat de epidermale reteruggen intact waren. Thermolysine is een extracellulair metalloendopeptidase geproduceerd door Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. De activiteit is stabiel bij 4 °C , maar is functioneel over een breed scala van temperaturen10,24,25. Dit enzym is uitgebreid gebruikt voor eiwitchemie24,25, maar verschillende groepen hebben de toepassing ervan aangetoond voor huidscheiding in epidermale en/of huidbladen4,8,10,26,27. Walzer et al. waren de eersten die epidermale-dermale scheiding van de menselijke huid rapporteerden met thermolysine bij 4 °C (250–500 μg/ml gedurende 1 uur)10. Bij licht- en elektronenmicroscopie werd vastgesteld dat er een scheiding zou optreden in het epidermale keldermembraan tussen laminine en de bulleuze pemphigoïde antigeenplaats10.
Bovendien werden hemidesmosomen, de aanhechtingen van basale keratinocyten aan het keldermembraan, selectief verstoord10,29. Rakhorst et al. vergeleken thermolysine (4 °C, 500 μg/ml, 's nachts) met dispase voor epidermale-dermale scheiding van konijnensuccale slijmvlies8. Thermolysine was onvolledig in het scheiden van de mucosale epidermis van dermis, wat betekent dat verschillen kunnen optreden voor soorten, incubatietijd, oplossingssamenstelling (geen CaCl2 om thermolyse autolyse24), bron van thermolysine en/of plaatsspecifieke verschillen aangegeven uit andere studies10,26,27te voorkomen . Eindgebruikers van het huidige protocol moeten ervoor zorgen dat ze verse thermolysine gebruiken en altijd calciumchloride bevatten, maar moeten zich ook bewust zijn van deze mogelijke beperkingen.
Hoewel sommige onderzoekers thermolysine hebben gebruikt bij 37 °C26,29, moeten gebruikers van dit protocol er rekening mee houden om huidweefsel op 4 °C te houden om de stabiliteit van eiwitten en mRNA te behouden. We gebruikten DMEM bij 4 °C als oplossing voor de huid voor en na thermolysinescheiding vanwege het nut ervan bij het behoud van cellen in cultuur28, en het is eerder gebruikt voor huidscheiding met thermolysine8,26,27,30,31. Walzer et al. gebruikten echter steriel PBS aangevuld met 200 μG/ml streptomycine, 200 U/ml penicilline en 2,5 μg/ml fungizone10, terwijl anderen verschillende media hebben gebruikt (bijv. keratinocytcultuurmedia vrij van epidermale groeifactor), gevolgd door PBS-spoeling29.
In het protocol werd thermolysinescheiding uitgevoerd in 500 μg/ml thermolysine en 5 ml calciumchloride in PBS (pH = 8), vergelijkbaar met de oorspronkelijke methode10. DMEM is gebruikt als oplossing voor thermolysinescheiding bij 4 °C ('s nachts)8, en HEPES-buffer is effectief gebruikt met 500 μG/ml thermolysineoplossing bij 37 °C gedurende 2 uur29. We hebben echter niet onderzocht hoe cultuurmedium of andere buffers de activiteit van thermolysine voor epidermale-dermale scheiding beïnvloeden. Calciumchloride is een belangrijke toevoeging aan de afname van de autolyse van thermolysine24,32 en verwijdering van deze stap kan leiden tot onvolledige decolleté van de epidermis van dermis8.
De grootte van het huidmonster lijkt van invloed te zijn op de tijd die nodig is voor thermolysine incubatie en de effectiviteit van enzymatisch decolleté van de epidermis van dermis. Onderzoekers moeten de juiste monstergrootte en incubatietijd voor hun eigen weefsels evalueren. Het drijven van de monsters op de thermolysineoplossing met de epidermis naar boven is belangrijk voor een optimale enzymeffectiviteit10. Zoals eerder opgemerkt, bevindt de plaats van actie voor thermolysine zich bij de keratinocyt hemidesmosomen en keldermembraan4,10,29; daarom werkt thermolysine naar binnen vanaf de randen van de huid. Uit onze ervaring scheiden de huidranden eerder dan het midden van het monster en is het belangrijk om voldoende tijd te hebben voor een volledig enzymatisch decolleté. Wanneer het decolleté is voltooid, moet de opperhuid gemakkelijk van de dermis wegtrekken. Als het nog steeds is bevestigd, kan het trekken aan de lagen ervoor zorgen dat delen van dermis wegkomen met de epidermis.
Een beperking van de thermolysinetechniek is de tijd die nodig is. Het verhogen van de thermolysineconcentratie boven 500 μG/ml vermindert de tijd voor scheiding niet en er is een slechte conservering van de epidermis bij hogere concentraties10. Epidermale-dermale scheidingsmethoden zijn onlangs herzien4, en veel methoden duren 30-60 minuten bij 20-40 °C. Warmte (50-60 °C) scheiding van de huid vindt snel plaats (30 s tot 10 min)4, maar van eiwitten en mRNA is bekend dat ze snel afbreken bij zulke hoge temperaturen. Als alternatief kan natriumthiocyanaat (2 N) bij RT een aanvaardbare snelle scheidingstechniek zijn (5 min)4,6, maar de integriteit van eiwitten en mRNA is met deze methode niet onderzocht6. De koude thermolysinemethode werd gekozen voor het behoud van eiwitten en mRNA, maar er werden geen directe vergelijkingen gemaakt tussen eiwit- en mRNA-integriteit met behulp van andere technieken.
In deze studie is aangetoond dat koude thermolysinevertering een effectieve methode is om de epidermis van de dermis te scheiden voor evaluatie van mRNA en eiwitveranderingen tijdens ontstekingen. Tijdens carrageen-geïnduceerde ontsteking werden de NGF mRNA- en eiwitspiegels en IL-6 mRNA-niveaus verhoogd met 6 uur en keerden ze met 12 uur terug in de buurt van de uitgangswaarde. Bij immunohistochie werd de NGF-immunoreactiviteit verhoogd in keratinocyten met 6 uur en 12 uur. Een voordeel van de thermolysinemethode is de mogelijkheid om siteselectieve analyse uit te voeren. De verhoogde productie van NGF en IL-6 in de huidige studie is bijvoorbeeld afkomstig van keratinocyten, omdat huidcellen zijn uitgesloten van de assays. Deze methode geeft inzicht in de locatie- en bemiddelaarstypen voor sensibilisatie van primaire afferenteterminals33. Bovendien maakt deze methode een beter begrip mogelijk van het tijdsverloop van de productie van neurotrofinen, samen met opname en transport in primaire afferents tijdens ontsteking34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
De financiering van dit onderzoek werd verstrekt door de National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
