Summary
Der In-vitro-Zellinvasionstest wird verwendet, um das Potenzial von Krebsmetastasen zu messen, indem das zelluläre Potenzial für Invasion und Migration mithilfe von Zellkultureinsätzen, die Proteinmatrix enthalten, quantifiziert wird. Die Zellen werden herausgefordert, durch die Proteinmatrix und eine poröse Membran in Richtung eines Chemoattractants zu wandern und dann durch Lichtmikroskopie quantifiziert zu werden.
Abstract
Der In-vitro-Invasionstest verwendet eine proteinreiche Matrix in einer Boyden-Kammer, um die Fähigkeit kultivierter Zellen zu messen, die Matrix und eine poröse Membran in einem Prozess zu durchlaufen, der den anfangsen Schritten der Metastasierung von Krebszellen entspricht. Die getesteten Zellen können für die Genexpression verändert oder mit Inhibitoren behandelt werden, um Veränderungen im Invasionspotenzial zu testen. Dieses Experiment testet den aggressiven Phänotyp der Maus-Mammary-Tumorzellen, um die potenziellen Onkogene zu entdecken und zu charakterisieren, die die Zellinvasion fördern. Diese Technik kann jedoch vielseitig einsetzbar sein und an viele verschiedene Anwendungen angepasst werden. Das Experiment selbst kann an einem Tag durchgeführt werden und die Ergebnisse werden durch Lichtmikroskopie in weniger als einem Tag erfasst. Die Ergebnisse umfassen die Anzahl der eindringenden Zellen für den Vergleich und die Analyse. Der In-vitro-Invasionstest ist eine schnelle, kostengünstige und klare Methode zur Bestimmung des Zellverhaltens in einer Kultur, die als erste Bewertung verwendet werden kann, bevor sie mehr an vivo-Assays beteiligt ist.
Introduction
Der In-vitro-Invasionstest kann ein nützliches Werkzeug bei der Messung der Fähigkeit einer Zelle sein, durch eine proteinbeschichtete Membran zu wandern, analog zu den ersten Schritten in der Metastasierung. Ein Schlüsselmerkmal bösartiger Krebszellen ist ihre Fähigkeit, durch nahegelegene Gewebe zu wandern und einzudringen. Krebs, der sich ausgebreitet oder metastasiert hat, stellt mehr Behandlungsherausforderungen dar und hat niedrigere Raten des langfristigen Überlebens, während lokalisierte Tumoren leichter zu behandeln sind und höhere Raten des langfristigen Überlebens haben. Um metastasieren zu können, müssen Krebszellen den Primärtumor verlassen und in das Kreislauf- oder Lymphsystem wandern, ein Prozess, der den Übergang durch die extrazelluläre Matrix und Kellermembran1erfordert. Dabei müssen die Tumorzellen, die als epithelialer mesenchymaler Übergang (EMT) bezeichnet werden, Zellzellkontakte brechen, richtungsweisend migrieren und in nahegelegene Blut- oder Lymphgefäße eindringen. Die ersten Schritte dieser Metastasenkaskade sind von großem Interesse, da diese Schritte Krebs tödlicher machen können. Die genetischen und epigenetischen Faktoren, die an den frühen Schritten der Metastasierung beteiligt sind, stehen im Mittelpunkt einer großen Menge an Forschung, aber es sind genaue und zuverlässige experimentelle Werkzeuge erforderlich, um diese frühen Schritte sowohl in vivo als auch in vitro zu testen.
Werkzeuge zur Messung von Veränderungen in der Zellmigration wie Wundheilung (Kratz-)Assays oder Wachstum in 3D-Umgebungen wie Soft Agar Assays können teilweise die Notwendigkeit experimenteller Methoden zur Messung früher Metastasierungsschritte decken, aber ein Test zur Messung der Invasion ist schwieriger, da der Prozess im Körper in einer komplexen Tumormikroumgebung stattfindet. Für das Screening von Medikamenten oder Genveränderungen, um wichtige Faktoren bei Invasion und Metastasierung zu bestimmen, ist ein System, das in vitro mit kultivierten Zellen verwendet werden kann und die Herausforderungen nachahmt, denen metastasierende Zellen in vivo gegenüberstehen, der Invasionstest2, 3. Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebsart bei Frauen und die zweithäufigste Krebstodesursache bei Frauen, daher ist das Verständnis der Gene, die für die Invasion von Brustkrebszellen und Metastasen verantwortlich sind, von entscheidender Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Darüber hinaus sind Mauszellen ein nützliches Modellsystem zur Untersuchung von Brustkrebs und dessen Fortschreiten.
Der In-vitro-Invasionstest basiert auf der Boyden Chamber Assembly, wo zweiKammern von Wachstumsmedien durch eine poröse Membran 3 getrennt sind. Um die Tumormikroumgebung nachzuahmen, ist ein proteinreiches Gel auch enthalten, um Zellen in einer Kammer von einem Chemoattractant in der anderen zu trennen und als Kellermembranbarriere zu fungieren. Um zum Chemoattractant zu wandern, müssen die Zellen zuerst die proteinreiche Barriere passieren und dann die poröse Membran passieren - ein Prozess, der der Art und Weise entspricht, wie metastasierende Zellen durch Stroma wandern. Das proteinreiche Gel kann je nach den Erfordernissen des Experiments verändert werden, besteht aber in der Regel aus Kollagen oder Kellermembranextrakt (z.B. Matrigel)4. Es ist eine komplexe Mischung aus Proteinen, Proteoglykanen und Wachstumsfaktoren, besteht aber hauptsächlich aus Lamininen und Kollagen IV 4,5. Die Zellen müssen dann eine poröse Membran passieren, die typischerweise aus Polycarbonat, Polyester oder Polytetrafluorethylen (PTFE) besteht. Membranen können kommerziell mit oder ohne Proteingel (typischerweise Kollagene) oder das Gel separat erworben und hinzugefügt werden. Die Porengröße kann basierend auf der Zellgröße angepasst werden. Während Porengrößen von 0,4 - 8,0 m erhältlich sind, sind nur Poren von 3,0 - 8,0 m groß genug für die Zellmigration. Der Invasionstest wurde verwendet, um die Wirksamkeit von Inhibitoren auf die Fähigkeit der Zellen zu migrieren und einzudringen zu bestimmen. Obwohl die genaue Tumor-Mikroumgebung fehlt, die in vivo vorhanden ist, ist der In-vitro-Invasionstest vorteilhaft beim Screening vieler Bedingungen in kurzer Zeit und minimiert gleichzeitig den Bedarf an Tiermodellen. Das Ziel dieser Experimente ist es, die Genexpression vermuteter Onkogene zu vergleichen und die Auswirkungen auf das Verhalten von Krebszellen und die Aggressivität von Krankheiten mithilfe des In-vitro-Invasionstests und anderer Tests zu bestimmen. Insgesamt liefert der Invasionstest konsistente, quantitative und schnelle Ergebnisse zur Bestimmung des metastasierenden Potenzials und ist gleichzeitig eine relativ kostengünstige, unkomplizierte und anpassungsfähige Methode.
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Protocol
Alle Experimente und Methoden wurden nach Genehmigung durch das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Villanova durchgeführt.
1. Genexpression in kultivierten Maus-Mammary-Tumorzellen
- Bereiten Sie zunächst die zu testenden Zelllinien vor.
-
Verwenden Sie eine Brutkolonie von BALB/cV-Mäusen. Diese Mäuse tragen den BALB/cV-Stamm des Maus-Mammary-Tumorvirus, übertragen an Welpen in Milch6,7. Fünfzig Prozent der Zuchtweibchen entwickeln bis zum Alter von 10 Monaten Brusttumoren.
- Um eine Tumorzelllinie zu etablieren, opfern Sie einen tumortragenden Damm mit einem IACUC-zugelassenen Protokoll. Die Bauchhaut in 70% EtOH einweichen und den Tumor unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Strömungshaube entfernen. Tumore sind subkutan, also achten Sie darauf, das Peritoneum nicht zu punktieren.
- Tumorfragmente aus nicht-nekrotischen Bereichen in eine Petrischale mit einer kleinen Menge steriler Hanks Balanced Saline Solution (HBSS) legen und mit einer sterilen Rasierklinge sehr fein zerkleinern.
- Übertragen Sie die dispergierten Zellklumpen in einen T25-Zellkulturkolben, der 5 ml Dulbeccoes Modified Eagle Medium oder DMEM (4,5 g/L Glukose, Phenolrot und L-Glutamin) enthält, ergänzt mit 50% Fetal Bovine Serum oder FBS und 1% Antibiotikum/Antimykotiklösung. Wachsen Sie Zellen in behandelten Zellkulturkolben in einem Inkubator mit 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit bei 37 °C.
- Nicht-haftende Zellen nach 24-48 h abwaschen und das DMEM durch 50% FBS und 1% Antimykotische Lösung ersetzen. Geben Sie die Zellen an den Inkubator zurück.
- Ersetzen Sie flüssige Kulturmedien alle 3 Tage.
- Teilen oder durchgehen sie die Zellen, wenn sie zu 90 % konfluent sind. Entfernen Sie Kulturmedien und waschen Sie haftende Zellen mit HBSS (ohne Kalzium oder Magnesium). Inkubieren Sie Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für 1-5 min bei 37 °C, bis die Zellen gerundet und abgetrennt sind. Zellen 1:10 in frischen Kulturmedien verdünnen und zu einem neuen Kolben hinzufügen. Ein T-25-Zellkulturkolben benötigt 5-8 ml Kulturmedien, 5 ml HBSS zum Waschen und 1 ml Trypsin-EDTA zum Durchführen. Geben Sie den Kolben an den Inkubator zurück.
- Reduzieren Sie die FBS-Konzentration auf 40% nach dem ersten Durchgang, dann 30% nach dem zweiten Durchgang, dann 20% nach dem dritten Durchgang und schließlich 10% für alle nachfolgenden Passagen. Der Prozess der Etablierung des Wachstums in Standard DMEM Medium mit 10% FBS erfordert vier Passagen und 2 - 8 Monate.
-
Sobald die Zelllinie(n) etabliert ist, verändern Sie die Expression vermuteter Onkogene durch Transfektion von shRNA, das auf mRNA oder CRISPR für nicht-essentielle Gene abzielt.
- Etablieren Sie antibiotikaresistente stabile Zelllinien mit einzelnen Klonen, die durch Western Blot und/oder RT-qPCR für konsistente Ergebnisse verifiziert werden, aber transiente Transfektionen können auch funktionieren, da der Test nur 22 h benötigt. unspezifische Zielsequenzen sind ebenfalls erforderlich.
2. In Vitro Invasion Assay
- Wachsen Sie anhantibe Maus-Mammary-Tumorzellen in einem T25-Kolben bis 70-90% konfluent für Tag 1 des Experiments.
HINWEIS: Andere Zelllinien oder experimentelle Bedingungen erfordern möglicherweise unterschiedliche Zellkulturmedien. Zum Beispiel, wenn hormonresponsive Brustkrebszellen getestet werden, Holzkohle-gefiltertes Serum kann benötigt werden, um Verbindungen zu entfernen, die Östrogen oder andere Hormonrezeptoren aktivieren. - Bereiten Sie die Boyden-Kammereinsätze vor, indem Sie sie auf Raumtemperatur (von -20 °C Lagerung) für ca. 20 min in einer Zellkulturhaube wärten. Vermeiden Sie Freeze-Tau-Zyklen für unbenutzte Einsätze. Verwenden Sie drei Einfügungen (Replikationen), um statistisch gültige Daten für jede Zelllinie für jedes Experiment zu generieren.
- Vorgewärmten 37 °C serumfreien DMEM-Medien in den Brunnen und dann den Einsatz geben. Für Einsätze, die für 24-Well-Gerichte entwickelt wurden, fügen Sie dem Brunnen 500 l serumfreies DMEM und dann 500 l serumfreies DMEM zum Einsatz hinzu, so dass die poröse Membran und das Gel beidseitig hydratisiert sind.
HINWEIS: Für größere Einsätze, die für eine 6-Well-Schale entwickelt wurden, verwenden Sie 2 ml serumfreies DMEM auf beiden Seiten.
- Vorgewärmten 37 °C serumfreien DMEM-Medien in den Brunnen und dann den Einsatz geben. Für Einsätze, die für 24-Well-Gerichte entwickelt wurden, fügen Sie dem Brunnen 500 l serumfreies DMEM und dann 500 l serumfreies DMEM zum Einsatz hinzu, so dass die poröse Membran und das Gel beidseitig hydratisiert sind.
- Legen Sie die Schale mit Einsätzen in einen 37 °C Zellkultur-Inkubator mit 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit für mindestens 2 h, um gründlich zu hydratisieren und zu akklimatisieren.
- Bereiten Sie Zellen vor, indem Sie die Wachstumsmedien entfernen und die Zellen mit 5 ml HBSS spülen.
- Entfernen Sie den HBSS und fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für 1 - 5 min bei 37 °C hinzu oder bis Zellen gerundet erscheinen oder Anzeichen einer Ablösung vom Kolben zeigen.
- Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um alle Zellen zu lösen. Die Zellen in 5 ml DMEM + 10% FBS wieder aussetzen und in ein steriles 15 ml Zentrifugenrohr übertragen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 5 min, um die Zellen sanft zu pellet. Entfernen Sie das Medium, und ersetzen Sie es durch 5 ml serumfreies DMEM, um die Zellen wieder aufzuhängen.
- Wiederholen Sie die Zentrifugation und Suspension in serumfreien Medien zweimal für insgesamt 3 Wäbungen.
- Setzen Sie die Zellen in den letzten 5 ml serumfreiem DMEM gründlich aus und stellen Sie sicher, dass es keine Zellklumpen gibt.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer. Zählen Sie nur lebensfähige Zellen. Die Zellsuspension in 5 ml serumfreiem DMEM auf 5 x 104 Zellen/ml verdünnen.
HINWEIS: Diese Konzentration ergibt 2.500 Zellen pro Einsatz in einer 24-Well-Schale. Diese Anzahl von Zellen ist genug für aggressive Krebszellen mit hohen Migrations- und Invasionsraten. Weniger aggressive Zelllinien können mehr Zellen erfordern, bis zu 10.000 Zellen pro Einsatz für beobachtbare eindringende Zellen. Wenn eine reduzierte Zellinvasion erwartet wird, sollten Sie die Maximierung der eindringenden Zellen durch Erhöhung der Zellzahl in Betracht ziehen. Wenn eine erhöhte Zellinvasion erwartet wird, beginnen Sie mit weniger Zellen. - Entfernen Sie die Zellkulturschale aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem Insert. Heben Sie den Einsatz an und aspirieren Sie die Medien aus dem Brunnen. Schnell arbeiten, fügen Sie das Chemoattractant in die untere Kammer. Für eine 24-Well-Schale 750 l DMEM mit 5% FBS hinzufügen.
- Legen Sie die Einfügung in den Brunnen und fügen Sie die Zellen zur Einfügung hinzu. Für eine 24-Well-Schale verwenden Sie 500 l Zellsuspension. Für einen 6-Well-Tellereinsatz 2,5 ml Chemolock und 2 ml Zellen verwenden. Stellen Sie sicher, dass auf beiden Seiten der Membran keine Luftblasen vorhanden sind.
- Bringen Sie das Gericht für 22 h in den Zellkultur-Inkubator zurück.
- Nach 22 h die Zellen fixieren und färben. Bereiten Sie eine Lösung von 1% Paraformaldehyd in 1x Phosphat gepufferter Saline (PBS) zur Fixierung vor.
- In einer sauberen 24-Well-Zellkulturschale, fügen Sie 1 ml Fixativ zu einzelnen Brunnen, so gibt es eine gut für jeden Einsatz.
- Bereiten Sie die Färbelösung (frisch hergestellt) von 0,1% Kristallviolett (w/v) in einer Lösung von PBS mit 10% Ethanol (v/v) vor. In ähnlicher Weise fügen Sie 1 ml Färbelösung zu einem sauberen Brunnen in einem 24-Well-Kulturgericht für jeden Einsatz hinzu.
- Entfernen Sie jeden Einsatz nacheinander mit Zangen und legen Sie einen sterilen Wattestäbchen in den Einsatz und wischen Sie die Oberseite der Membran ab, um nicht migrierte Zellen zu entfernen.
- Wiederholen Sie dies mit einem zweiten Wattestäbchen. Die Membran ist ziemlich stark, so dass sanfter Druck beim Abwischen die Integrität der Membran nicht beeinträchtigt.
- Entfernen Sie alle verbleibenden Medien von der Innenseite des Einsatzes, und fügen Sie 750 L PBS hinzu, um getrennte Zellen abzuwaschen.
- Entfernen Sie die PBS und wiederholen Sie die Wäsche. Legen Sie den Einsatz in einen Brunnen, der Fixativ enthält, um die migrierten Zellen auf der Unterseite der Membran zu fixieren. Wiederholen Sie dies für alle Einfügungen.
- Fixieren Sie die Einsätze für 15 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie nach der Fixierung den Einsatz. Waschen Sie den Einsatz erneut mit 750 l PBS.
- Legen Sie den Einsatz in den Brunnen mit der Färbelösung, um alle migrierten und festen Zellen zu färben. Färben Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Für 6-Well-Schaleneinsätze 2 ml fixative Lösung, 2 ml Färbung Lösung und 2 ml PBS Waschen verwenden.
- Verwenden Sie ein Bechermitglas mit destilliertem Wasser, um die Einsätze zu entsalzen. Entfernen Sie die Einsätze und tauchen Sie in das destillierte Wasser ein, bis das Wasser, das vom Einsatz abfließt, klar ist.
- Entfernen Sie überschüssige Wassertröpfchen und legen Sie die Einsätze seitlich auf ein Filterpapier, um lufttrocken zu sein (in der Regel über Nacht).
- Bereiten Sie die Membran für die Bildgebung vor, indem Sie für jeden Einsatz ein sauberes Glasmikroskopdia beschriften und einen kleinen Tropfen Mikroskop-Tauchöl in die Mitte des Dias legen.
- Lösen Sie die Membran vom Einsatz mit einem Skalpell, um den Umfang der Membran auf der Innenseite des Kunststoffeinsatzes zu schneiden.
- Entfernen Sie die Membran mit Zangen und legen Sie sie auf die Oberseite des Öltropfens auf der Rutsche, um sie an Ort und Stelle zu halten.
HINWEIS: Die Membranen sind sehr dünn und sehr leicht, so dass sie leicht durch sanften Luftstrom verloren gehen können.
3. Bildgebung und Analyse
- Da die porösen Membranen klar sind und Färbezellen mit Kristallviolett ihnen Kontrast verleihen, verwenden Sie ein zusammengesetztes Lichtmikroskop, um die Zellen zu betrachten. Verwenden Sie eine Kamera und/oder Software, um für viele Samples zu quantifizieren, ist aber nicht erforderlich. Zellen mit 5x, 10x oder 20x Vergrößerung anzeigen. Verwenden Sie für die Quantifizierung mehrere, nicht überlappende Bilder bei 10-facher Vergrößerung. Alternativ können Sie alle migrierten Zellen auf der Membran mit der 10-fachen Vergrößerung zählen.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der einfallenden Zellen oder Zellen pro Fläche für alle Proben. Führen Sie für jedes Experiment jede Bedingung im Test mit drei Replizierenvoneinsätzen aus und wiederholen Sie sie mehrmals, um statistisch nützliche Ergebnisse zu erzielen.
- Wenn Sie verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen Wachstumsraten und Migrationsraten vergleichen, führen Sie ein paralleles Experiment durch, um Zellen zu vergleichen, die durch eine Proteinmatrix eindringen, und vergleichen Sie sie mit einer Boyden Chamber-Assembly ohne Proteinmatrix (nur migrierte Zellen). Berechnen Sie prozentuale Invasion für jede Zelllinie (Anzahl der eingedrungenen Zellen/Anzahl der migrierten Zellen x 100%).
HINWEIS: Dieser Ansatz kann helfen, die Invasionsrate mit den Migrationsraten zu vergleichen. Vergleicht man verschiedene Bedingungen, die auf dieselbe Zelllinie angewendet werden, ist die Berechnung der Invasion allein relevantere Berechnungen. Der äußere Rand der Membran hat manchmal eine höhere Anzahl von Zellen als die zentralen Bereiche und ist daher weniger genau. Wenn dies der Fall ist, schließen Sie diese Zellen aus der Quantifizierung aus und stellen Sie sicher, dass alle Zellen in einem Wiederholungsexperiment durch einen Wattestäbchen entfernt werden.
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Representative Results
Diese Methode der In-vitro-Invasion durch eine Proteinmatrix wurde verwendet, um die aggressiven Phänotypen und das onkogene Zellverhalten von Maus-Mamma-Tumorzellen mit veränderter Expression des Zinkfingerproteins ZC3H88zu bewerten. In Verbindung mit anderen Ansätzen, die auch die Zellmigration und das Wachstum in 3D-Umgebungen untersuchen, wurde festgestellt, dass höhere Expressionsniveaus von Zc3h8 in Tumorzelllinien oder durch promotoriver vermittelte Expression eines Plasmids zu schnellen Raten von Verbreitung, schnelle Migration, Wachstum in 3D-Umgebungen und erhöhte Invasion in der In-vitro-Invasion Assay8. Umgekehrt führte eine verminderte Expression durch shRNA-Konstrukte zu weniger aggressiver Proliferation, Migration und Invasion8. Diese Ergebnisse wurden in vivo bestätigt, wo eine höhere Expression von Zc3h8 größere Tumore produzierte, die schnell auftraten, während eine verminderte Expression weniger Tumore produzierte, die kleiner und seltener8waren.
Um diese Arbeit zu erweitern, wurden Expressionsplasmide, die shRNA-vermittelten Knockdown der Zc3h8-Expression retten können, in Maus-Mammazellen stabil transfiziert, um zu beurteilen, ob aggressives Zellwachstum und -verhalten in diesen Zellen wiederhergestellt werden konnten. Alle Knockdown und Rettung von Ausdrücken wurden durch Western Blot oder RT-qPCR8überprüft. Ein Invasionstest wurde mit 5.000 Zellen pro Kammer in einer 24-Well-Schale verwendet und mit Fotografien dokumentiert, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse des Invasions-Assays, die zeigen, wie die Zellinvasion nach shRNA-Knockdown des Zc3h8-Ausdrucks abnahm, aber diese Invasion gerettet wird, wenn der Ausdruck gerettet wird. Diese Daten zeigen, dass der Invasionstest eine schnelle Methode zum Testen von Zelllinien in vitro bieten kann, bevor er sich auf teurere und langwierige Ansätze einlässt.
Abbildung 1: Invasions-Assay-Komponenten. (A) Boyden Kammereinsatz für eine 24-Well-Gewebekulturschale. (B) Eine 24-Well-Gewebekulturschale, die zur Fixierung, Färbung und Zum Waschen nach 22 h Inkubation mit Zellen verwendet wird. Die Zahlen 1, 2 und 3 sind Replikationen einer einzelnen Zellenlinie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Invasions-Assay-Flussdiagramm mit der Zeitskala. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Probeninvasions-Assay-Ergebnisse einer Maus-Mammary-Tumorzellen, die zur Expression von Zc3h8 verändert wurden, was den onkogenen Phänotyp verändert. (A, B) Zellen, die von Maus-Mammatumoren isoliert wurden, wurden stabil mit shRNA transfiziert, die auf eine Kontrollsequenz von mRNA oder auf Zc3h8 mRNA abzielte. (C) Die spätere Zelllinie wurde dann durch Exzess von rekombinantem Zc3h8 gerettet, das von shRNA nicht beeinflusst werden sollte. Die Zellen werden mit Kristallviolett gebeizt und mit einer 10-fachen Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Skala bar = 500 m. (D) Quantifizierung zeigt, dass reduzierte Expression von Zc3h8 die Anzahl der eindringenden Zellen und das Metastasenpotential verringert. Die Rettung der Genexpression rettet höhere Raten der Zellinvasion. Werte stellen die Gesamtzahl der eindringenden Zellen aus einem 24-Well-Invasions-Assay-Einsatz dar. Für jede Replikation im Experiment wurde die durchschnittliche Anzahl der eindringenden Zellen berechnet. Dies wurde bei drei Experimenten wiederholt. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der In-vitro-Invasionstest ist eine kostengünstige, schnelle, quantitative und unkomplizierte Methode, um die Faktoren zu untersuchen, die die Invasion von Krebszellen fördern. Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebsbeilage bei Frauen. Von den drei Hauptsubtypen von Brustkrebs ist das dreifach negative (oderER-, PR-, HER2/neu -) der aggressivste, am ehesten metastasierende und tödlichste9. Daher kann das Verständnis der Gene und der Expression, die zu Metastasen führen, helfen, neue therapeutische Ziele und genetische Marker für die Krankheit zu finden. Während viele der Gene, die für die Invasion von Krebszellen und Metastasen wichtig sind, identifiziert und charakterisiert wurden, können Expressionsniveaus und Aktivität von Metastasentreibern im Vergleich zu Metastasensuppressoren ein kritischer Aspekt des Krankheitsverlaufs sein9, 10.
Jenseits der Genexpression wurde der In-vitro-Invasionstest auch verwendet, um die Rolle von microRNA und anderen Regulatoren bei der Förderung oder Verhinderung von Krebszellinvasionen zu untersuchen11,12. Die In-vitro-Invasions-Setup-Methode kann für die Untersuchung von Inhibitoren, Tumorumgebungen vom Typ multi-Cell, VON CRISPR bearbeiteten Zellen oder kurzfristigen Veränderungen in zellulären Wachstumsumgebungen verwendet werden. Die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit machen diesen Test sehr vorteilhaft.
Der Invasionstest kann in einem ersten Schritt bei der Analyse von Genen und Faktoren verwendet werden, die zur Tumorprogression beitragen oder diese verhindern. Zum Beispiel verwendeten Yan et al. (2010) die In-vitro-Invasions-Assays, um die Rolle von GATA-3 bei der Unterdrückung der EMT durch die hochaggressive Brustkrebszelllinie MDA-MB 23113zu definieren. Sie konnten dann zeigen, dass diese Unterdrückung mit einer verminderten Fähigkeit korrelierte, Metastasen in einem in vivo-Assay zu bilden13. Potenzielle therapeutische Strategien können zunächst durch die Fähigkeit von Signalweghemmern charakterisiert werden, die Invasion durch Matrigel zu begrenzen, was auch mit der Wirkung dieser Inhibitoren auf die Tumorbildung in Tiermodellen korreliert. Der In-vitro-Invasionstest kann für eine eingehendere Analyse bekannter und potenzieller Onkogene und interagierender Partner verwendet werden. Beispielsweise kann die molekulare Zerlegung bekannter funktioneller Motive eines Onkoproteins oder eine schnelle Analyse von Mutationen mit dem In-vitro-Invasionstest als Erstbild oder Signifikanzbewertung durchgeführt werden. Dies kann wertvolle Einblicke in kritische Bereiche sowie ein funktionelles Verständnis von Zellphänotypen auf molekularer Ebene bieten.
Während die Boyden Chamber Invasion Assay hat viele Vorteile, gibt es Einschränkungen. Zum Beispiel befasst sich der Invasionstest nur mit der Intravasation, einem der ersten Schritte der Metastasierung, aber nicht den späteren Schritten, wenn Krebszellen sekundäre Standorte besiedeln. Daher kann nur eine partielle Sicht des Metastasenpotenzials abgeschlossen werden. Die 22 h Länge des Assays, obwohl flexibel, kann nicht ausschließen, dass einige Zellteilung, die subtile Veränderungen bei der Messung der Invasion von asynchronen Zellpopulationen verzerren könnte. Inhibitoren wie Mitomycin C können verwendet werden, um eine Zellteilung bei schnell tauchenden Zellen zu verhindern. Schließlich wird die Verwendung von 5% FBS-Lösung für Chemotaxis im Laufe der Zeit langsam diffundieren und zwischen den oberen und unteren Kammern aushalten. Die Dichte des Proteingels verlangsamt diese Diffusion und stellt die Zelle mit der Möglichkeit dar, seitlich über das Gel und die Membran (Haplotaxis) oder durch die Proteinmatrix und durch die Poren zu den höheren Konzentrationen von FBS (Chemotaxis) zu wandern. Alternative Chemotaxis-Agenten können ersetzt werden oder kürzere Zeitzulagen für Invasionen können verwendet werden, um nur die Zellen zu messen, die vor dem Ausgleich eingedrungen sind. Es ist die Flexibilität, nicht die Starrheit des In-vitro-Invasions-Assays, die eine Anpassung ermöglicht, die diesen Assay so nützlich macht. Zukünftige Anpassungen dieses Tests umfassen ein groß angelegtes Screening von Verbindungen, Veränderungen der Genexpression und die Bewertung der allelespezifischen Wirksamkeit von Arzneimitteln. Darüber hinaus könnte ein duales Kammersystem mit zirkulierenden Medien Zellen herausfordern, durch eine Proteinmatrix einzudringen, eine flüssige Umgebung zu durchqueren und sich an einer sekundären Stelle wieder auf einer zweiten Proteinmatrix zu etablieren. Schließlich kann eine anspruchsvollere Membran mit dem In-vitro-Invasions-Assay-System verwendet werden, wie z. B. eine Monoschicht nicht-invasiver Zellen, die für Krebszellen schwieriger zu kreuzen wäre.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss R15CA169978 von den National Institutes of Health unterstützt. Zusätzliche Mittel kamen von der Universität Villanova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
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