Summary
यहां वर्णित मांसपेशियों क्रायोसेक्शन में परिगलित मायोफिकर्स के प्रत्यक्ष इम्यूनोलेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। नेक्रोटिक कोशिकाएं सीरम प्रोटीन के लिए पारगम्य हैं, जिनमें इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) शामिल हैं। मायोफिकर्स द्वारा आईजीजी के तेज होने का खुलासा करने से मांसपेशियों की स्थिति की परवाह किए बिना परिगलन से गुजरने वाले मायोफिकर्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति होती है।
Abstract
मांसपेशियों के रेशों (मायोन्क्रोसिस) का परिगलन मांसपेशियों की डिस्ट्रोफ्रोथ सहित कई मांसपेशियों की स्थितियों के रोगजनन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी रोगजनन के कारणों को संबोधित करने वाले चिकित्सीय विकल्पमांसपेशियों के पतन को कम करने की उम्मीद है। इसलिए, मांसपेशियों की बायोप्सी में कोशिका मृत्यु की सीमा को परखने और निर्धारित करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है। पारंपरिक तरीकों सीटू में मायोफाइबर पतन का पालन करने के लिए या तो खराब मात्रात्मक है या महत्वपूर्ण रंगों के इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं । इस लेख में, एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है कि माओफिकर्स द्वारा इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) तेज को लक्षित करके दाग परिगलित मायोफिकर्स। आईजीजी तेज विधि कोशिका सुविधाओं पर आधारित है, जिसमें 1) नुकसान से जुड़े आणविक पैटर्न और 2) प्लाजमैटिक प्रोटीन की रिहाई के साथ प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का नुकसान शामिल है। मूत्र क्रॉस-सेक्शन में, माओफीयर्स, एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन और माउस आईजीजी की सह-इम्यूनोलेबलिंग परिगलित भाग्य के साथ मायोफिकर्स की स्वच्छ और सीधी पहचान की अनुमति देती है। यह सरल विधि मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और मानव नमूनों सहित सभी प्रजातियों पर लागू होती है, और इसके लिए महत्वपूर्ण रंग के इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं होती है। आईजीजी तेज द्वारा परिगलित मायोफिकर्स के धुंधला होने को अन्य सह-इम्यूनोलेबलिंग के साथ भी जोड़ा जा सकता है।
Introduction
स्ट्राइएट कंकाल की मांसपेशी में मुख्य रूप से मांसपेशियों के रेशे (मायोफिकर्स) होते हैं, जो विशेषता स्वैच्छिक अनुबंध समारोह के लिए जिम्मेदार होते हैं। ये कोशिकाएं बहुआयामी, पोस्ट-माइटोटिक संरचनाएं हैं जो संकुचन के दौरान होने वाले यांत्रिक तनाव का समर्थन करती हैं। मायोफाइबर झिल्ली (सरकोलम्मा) और इसके बाह्य मेट्रिक्स की संरचनात्मक स्थिरता ऊतक होमोस्टोसिस के लिए महत्वपूर्ण है। उपग्रह कोशिकाओं परिपक्व कंकाल मांसपेशियों में मुख्य मांसपेशी जनक आबादी शामिल है और स्वस्थ मांसपेशियों में एक शांत राज्य में मौजूद हैं । मायोफाइबर मृत्यु के बाद, मांसपेशियों के उत्थान को एक मायोजेनिक कार्यक्रम के बाद उपग्रह कोशिकाओं द्वारा समर्थित किया जाता है जिसमें उपग्रह कोशिका सक्रियण, प्रसार, भेदभाव और संलयन शामिल है ताकि अंततः नए बहुआयामी मायोफिकर्स बन सके।
मायोफाइबर निधन यांत्रिक आघात, इस्केमिया-रिपरफ्यूजन चोटों, या मांसपेशियों की डिस्ट्रोफ्रोथ सहित कई मांसपेशियों की स्थितियों में हो सकता है, और यह मृत कोशिकाओं1,2के परिगलित आकृति विज्ञान से जुड़ा हुआ है। परिगलित मृत्यु प्लाज्मा झिल्ली की तेजी से सामर्थ्य और बाह्य डिब्बे3में कोशिका सामग्री को छोड़ने की विशेषता है। यह या तो एक अनियमित प्रक्रिया से परिणाम दे सकता है जिसमें कोई उचित सेल सिग्नलिंग (यानी, आकस्मिक परिगलन), या एक आर्केस्ट्रा इंट्रासेलुलर मार्ग (यानी, विनियमित परिगलन) शामिल है। मायोफिकर्स में, विनियमित4 और अनियमित5 प्रक्रियाएं दोनों परिगलन का कारण बन सकती हैं। myonecrosis का एक विशिष्ट परिणाम क्षति से जुड़े अणु पैटर्न की रिहाई है, एक शक्तिशाली भड़काऊ प्रतिक्रिया6को सक्रिय । 7चोटके बाद लगभग 48 घंटे और 72 घंटे में मैक्रोफेज की उपस्थिति देखी जाती है । परिगलित मलबे की मंजूरी में उनकी भूमिका के अलावा, वेमांसपेशियोंके उत्थान 8,9में भी महत्वपूर्ण हैं ।
मस्कुलर डिस्ट्रोफिक (एमडी) विकृतियों का एक विषम समूह है जो अक्सर सरकोलमसंरचना में दोष से परिणाम देता है। ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) एक किशोर एक्स-लिंक्ड रोग है जो दुनिया भर मेंहर3,500 पुरुष जन्मों में से लगभग 1 को प्रभावित करता है, और यह सरकोलेमा में डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति के अभाव के कारण होता है। डीएमडी लड़कों में मांसपेशियों के ऊतकों का पुराना पतन अत्यधिक मांसपेशियों की कमजोरी और प्रारंभिक मृत्यु दर की ओर जाता है। परिगलित मृत्यु के परिणामस्वरूप सूजन साइटोटॉक्सिकिसिटी को बढ़ाती है, और मांसपेशियों के फाइब्रोसिस और मांसपेशियों के कार्य11,12के नुकसान को बढ़ावा देती है। वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में उपचार ऐसे जीन थेरेपी के रूप में मांसपेशियों अपक्षयी विकारों की जड़ों को लक्षित, myonecrosis कम करने की उम्मीद कर रहे हैं । इसलिए मांसपेशियों के पतन की सटीक मात्रा निर्धारित करने के लिए सरल तकनीकों की आवश्यकता है।
वीवो में मायोफाइबर नुकसान की निगरानी के लिए नियमित रूप से कई तरीकों का उपयोग किया जाता है। रक्त में क्रिएटिन किनेज (सीके) की एंजाइमैटिक गतिविधि की माप मांसपेशियों और दिल के ऊतकों में चल रहे परिगलन के विश्वसनीय मात्राकरण की अनुमति देती है। सीटू में, हीमेटॉक्सीलिन और ईसिन (एच एंड ई) धुंधला सबसे लोकप्रिय विधि है जो वर्तमान में निदान में उपयोग की जाने वाली सबसे लोकप्रिय विधि है जो पतन-पुनर्जनन पुनर्मॉडलिंग का आकलन करने के लिए है। हालांकि, मृत कोशिकाओं की एच एंड ई लेबलिंग का आणविक आधार अस्पष्ट बना हुआ है। इसके अलावा, एच एंड ई धुंधला में मायोफाइबर मौत का सुझाव देने वाले रंग संशोधन अपेक्षाकृत सूक्ष्म हैं और विश्वसनीय और प्रजनन योग्य मात्राकी की सुविधा नहीं देते हैं। डीएनए विखंडन का खुलासा करने वाले तरीके, जैसे टर्मिनल डिऑक्सीन्यूक्लियोटिल ट्रांसफरेज़ डीयूटीपी निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल), एपूरी तरह से परिगलित मृत्यु3लेबल। उन्हें मायोफ़ियर्स जैसी सिंकिल कोशिकाओं की मौत की निगरानी करने के लिए खराब रूप से अनुकूलित किया जाता है। इवान के ब्लू डाये (ईबीडी) जैसे महत्वपूर्ण रंगों का इंजेक्शन, मायोफिकर्स का आकलन करने के लिए एक उपयोगी विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है जो सरकोलेमा की अखंडता खो चुके हैं, लेकिन कुछ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में जरूरी सुविधाजनक नहीं है। उदाहरण के लिए, रक्त के नमूनों में ईबीडी की उपस्थिति सीके माप, एक रंगीन परख के परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इसके अलावा, ईबीडी का इंट्रासेलर तेज सह-इम्यूनोलेबलिंग को चुनौतीपूर्ण बनाता है। इसलिए, परिगलन के दौर से गुजर रहे मायोफिकर्स की सीधी लेबलिंग की अनुमति देने वाली एक वैकल्पिक विधि ब्याज की है ।
महत्वपूर्ण रंगों की कार्रवाई का तंत्र परिगलित मायोफिकर्स में प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान और इंजेक्शन डाइज के निष्क्रिय तेज पर निर्भर करता है। इसी तरह, नेक्रोटिक मायोटिकर्स एल्बुमिन जैसे रक्त प्रोटीन को तेज करते हैं, जिसके लिए ईबीडी में एक मजबूत आत्मीयता13,14,इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी), और आईजीएम15है। इसलिए मायोफिकर्स के भीतर रक्त प्रोटीन की असामान्य उपस्थिति सीटू में मायोनक्रोसिस के लिए सुविधाजनक मार्कर का प्रतिनिधित्व करती है। इन प्रोटीन धुंधला महत्वपूर्ण रंगों के उपयोग के लिए एक विकल्प हो सकता है।
सीटू में मायोनेक्रोसिस के मार्कर के रूप में आईजीजी तेज का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल का उपयोग एमडीएक्स डिस्ट्रोफिन-कमी वाले चूहों के टिबिलिस पूर्वकाल (टीए) में मांसपेशियों के पतन का आकलन करने के लिए किया जाता है। यह विधि वैकल्पिक तकनीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करती है: 1) यह इसके निष्पादन में प्रजनन योग्य और सरल है; 2) यह मांसपेशियों के संग्रह से पहले किसी भी पशु उपचार की आवश्यकता नहीं है, जैसे महत्वपूर्ण रंगों परिसंचारी के इंजेक्शन के रूप में, और 3) किसी भी पारंपरिक इम्यूनोलेबलिंग के रूप में, यह सह लेबलिंग के साथ संगत है ।
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Protocol
प्रयोग फ्रांसीसी और यूरोपीय समुदाय कानून (लाइसेंस संख्या 11-00010) के अनुसार किया गया ।
1. ट्रागकैंथ गम की तैयारी
- एक ग्लास बीकर में, 6 ग्राम ट्रागाकैंट पाउडर को 100 मीटर के डिओनाइज्ड पानी में भंग कर दें। पन्नी के साथ कवर करें और कम से कम 3 घंटे के लिए छोड़ दें। कभी-कभी धातु के स्पैटुला के साथ मैन्युअल रूप से हलचल करें क्योंकि मिश्रण तेजी से चिपचिपा हो जाता है।
- ट्रागकैंट मिश्रण को पानी के स्नान में या ओवन में रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें। सूखने से बचने के लिए बीकर को सावधानी से सील करें। अलीकोट करने से पहले कम से कम एक बार हिलाएं।
- अलीकोट और 2 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. मांसपेशी संग्रह
नोट: इस प्रयोग के लिए, एक 4 सप्ताह पुराने पुरुष mdx माउस गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान किया गया था । इस प्रक्रिया में एनेस्थीसिया की आवश्यकता नहीं है और यह स्थानीय कानून के अनुसार एक मानवीय हत्या विधि है ।
- टिबियालिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशी का विच्छेदन
- माउस पैर शेविंग के बाद, माउस को अपनी पीठ पर रखें और सुइयों के साथ कॉर्कबोर्ड पर पैरों को पिन करें। सटीक कैंची (या एक स्केलपेल) और संदंश का उपयोग करना, टिबिया और टीए की पूरी लंबाई को बेनकाब करने के लिए पैर की त्वचा को घुटने तक पैर की त्वचा को हटा दें।
- कैंची से टिबिया और टीए के बीच चीरा लगा लें। इससे टीए को हड्डी से अलग करने में आसानी होगी और एपिमिनियम को आसानी से पकड़ मिलेगी। सटीक संदंश का उपयोग करके, टीए की सतह से एपिमिज़ियम परत को ध्यान से हटा दें।
नोट- इस स्टेप से टीए सूखने की संभावना ज्यादा हो सकती है, जिससे बचना चाहिए। - टखने के क्षेत्र में, टा टेंडन को अन्य टेंडन से संदंश के साथ अलग करें। धीरे-धीरे टीए टेंडन को टिबिया और आसपास की मांसपेशियों से अलग करने के लिए खींचें।
- जब टीए पेट पूरी तरह से अलग हो जाए, तो टेंडन को ऊपर रखें ताकि केवल टीए मांसपेशी का समीपस्थ हिस्सा घुटने से जुड़ा रहे। धीरे-धीरे घुटने की हड्डी के जितना संभव हो उतना निकट समीपस्थ कण्डरा तोड़ दें।
- टीए को एक धुंध में रखें जो मांसपेशियों को ठंडा करने से पहले सूखने से बचने के लिए खारे से हल्के से घटा दिया जाता है।
- प्लास्टिक या पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन बीकर में इसोपेन का प्री-कूल 70−100 मीटर आंशिक रूप से तरल नाइट्रोजन में डुबोकर। इसे ठंडा होने दें जब तक कि बीकर के तल पर आइसोपेनटैन एक सफेद ठोस न हो जाए।
- कॉर्क के एक गोलाकार टुकड़े (20 मिमी x 11 मिमी x 8 मिमी) पर, ट्रागाकैंट गम के ~ 0.5 मिमी रखें। ध्यान से कॉर्क के दूसरे पक्ष को पूर्व-लेबल करें ताकि ठंड के चरण के बाद बायोप्सी की ठीक से पहचान की जा सके।
- संदंश, डिस्टल कण्डरा के साथ गम में टीए एंबेड । मांसपेशियों के उपयुक्त क्रॉस वर्गों की अनुमति देने के लिए, मांसपेशियों को कॉर्क सतह पर अपनी धुरी लंबवत के साथ पकड़ें। यदि बायोप्सी पूरी तरह से गम में एम्बेडेड नहीं है तो क्रायोसेक्शन की गुणवत्ता में सुधार होगा। टीए (कण्डरा पक्ष) के कम से कम आधे के लिए गम द्वारा खुला होने के लिए अनुमति दें।
- जल्दी से एम्बेडेड मांसपेशी के साथ कॉर्क को अनफ्रोजन, ठंडी आइओपनटेन परत में डुबोएं। ध्यान दें कि कॉर्क तरल आइसोपेनटेन में तैरेगा। नमूना उल्टा पकड़ो के रूप में मांसपेशियों को isopentane में डूबा हुआ है की जरूरत है । नमूनों को पूरी ठंड की अनुमति देने के लिए लगभग 2 मिन के लिए आइस्टोपेन में छोड़ दें।
नोट: इस चरण से, टीए क्रायोसेक्शन तक जमे रहना चाहिए। मांसपेशियों को लंबी अवधि के भंडारण से पहले सूखी बर्फ में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
3. क्रायोसेक्शनिंग
- क्रायोस्टेट तापमान -25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। वस्तु का तापमान लगभग -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक का उपयोग करक्रायोस्टेट में वस्तु को ठीक करें। मांसपेशियों के पेट तक पहुंचने तक मांसपेशियों को ट्रिम करें फिर 7−10 माइक्रोन वर्गों को काट लें।
नोट: वस्तु तापमान के स्थिरीकरण के लिए कम से कम 10 न्यूनतम की आवश्यकता होती है। - कमरे के तापमान (आरटी) पर क्रायोसेक्शन इकट्ठा करने के लिए उपयोग की जाने वाली ग्लास स्लाइड रखें। प्रत्येक स्लाइड पर कम से कम दो वर्गों को इकट्ठा करें। मांसपेशियों की धाराएं स्वचालित रूप से गर्म ग्लास स्लाइड के संपर्क में चिपक जाएंगी और गल जाएंगी। स्लाइड निकालकर आरटी पर रखें।
- खंडों को हवादार वातावरण में आरटी में कम से कम 20 मिन सूखने दें।
- उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लास स्लाइड पर क्रायोसेक्शन स्टोर करें।
4. इम्यूनोलेबलिंग
- एक हवादार वातावरण में कम से 15 min के लिए आरटी में गल स्लाइड ।
- हाइड्रोफोबिक पेन के साथ अनुभाग क्षेत्र को रेखांकित करें। हाइड्रोफोबिक बैरियर को सूखने दें।
- एक आर्द्र कक्ष में 10 min के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ऊतक को ठीक करें।
- प्रत्येक 5 न्यूनतम के लिए फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) 2x के साथ वर्गों को धोएं।
- एक आर्द्र कक्ष में आरटी में 1 घंटे के लिए पीबीएस में पतला 10% बकरी सीरम के साथ मांसपेशी वर्गों ब्लॉक ।
- 5% बकरी सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक आर्द्र कक्ष में आरटी (या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 2 एच के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें। मायोफिकर्स में सरल आईजीजी तेज लेबलिंग के लिए, खरगोश एंटीबॉडी के साथ केवल इनक्यूबेट अनुभाग ों को माउस पैन-लैमिनिन में।
नोट: एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स के अन्य एंटीजन को तब तक लक्षित किया जा सकता है जब तक वे मायोफिकर्स के आसपास के बाह्युलर मैट्रिक्स की स्पष्ट लेबलिंग प्रदान करते हैं। मांसपेशियों के उत्थान, सूजन या अन्य मापदंडों के लिए मार्कर तब तक संयुक्त किए जा सकते हैं जब तक कि माउस होस्ट में एंटीबॉडी नहीं उठाए जाते हैं। विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप में एक पूरक फ्लोरेसेंस रंग शामिल होना चाहिए। - प्रत्येक 5 मिन के लिए पीबीएस 3x के साथ वर्गों को धोएं।
- एक आर्द्र कक्ष में 45 min के लिए आरटी में माउस आईजीजी एच एंड एल इनक्यूबेट को खरगोश आईजीजी एच एंड एल और हरे फ्लोरोसेंट बकरी पॉलीक्लोनल सेकेंडरी एंटीबॉडी के लिए लाल फ्लोरोसेंट बकरी पॉलीक्लोनल सेकेंडरी एंटीबॉडी वाले वर्गों को इनक्यूबेट करें।
- प्रत्येक 10 मिन के लिए पीबीएस 3x के साथ धोएं।
- फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम में वर्गों माउंट १०० एनजी/mL 4 ′,, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) युक्त और एक कवरस्लिप के साथ प्रत्येक स्लाइड को कवर ।
- इमेजिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सुखाने की अनुमति दें।
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Representative Results
माओफिकर्स एक लेमिनिन युक्त एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स से घिरे हुए हैं। लाल धुंधला myofibers परिधि deस और उनकी पहचान के लिए अनुमति देता है । आईजीजी हरे रंग में दिखाया गया है। न्यूक्लिकी को DAPI से दाग दिया जाता है और माइक्रोस्कोप के नीचे नीला पाया जाता है। हालांकि, नाभिक यहां सफेद में दिखाया गया है(चित्रा 1)। एक्सट्रासेलुलर डिब्बे में एक कमजोर आईजीजी इम्यूनोरेएक्टिविटी की उम्मीद है, जिसे सूजन के मामले में बढ़ाया जा सकता है। मायोफीयर्स के भीतर हरे रंग का धुंधला आईजीजी की उपस्थिति को दर्शाता है।
एमडीएक्स माउस टास को 3 सप्ताह की उम्र में तीव्र मायोनिक्रोसिस के क्षणभंगुर चरण की विशेषता है, जिसके बाद अतुल्यकालिक पतन-उत्थान की घटनाएं होती हैं। नतीजतन, 4 सप्ताह पुराने एमडीएक्स चूहों से टास अक्सर खराब प्रभावित क्षेत्रों सहित विषम प्रोफाइल प्रदर्शित करते हैं, और एक ही क्रॉस-सेक्शन(चित्रा 1ए)में एक साथ क्षेत्रों को विकृत और पुनर्जीवित करते हैं। अप्रभावित/हल्का प्रभावित मांसपेशियों के क्षेत्रों में बड़े और समरूप आकार वाले मायोफिकर्स होते हैं, और नाभिक कम घनत्व पर पाए जाते हैं और मुख्य रूप से परिधि में या मायोफिकर्स(चित्रा 1बी)के बीच स्थित होते हैं । आईजीजी-पॉजिटिव मायोफीयर्स आम तौर पर ऐसे स्वस्थ या हल्के प्रभावित क्षेत्रों में अनुपस्थित होते हैं।
मायोफीयर्स के भीतर आईजीजी-इम्यूनोरेएक्टिविटी मायोनेक्रोसिस(चित्रा 1सी,निचला भाग) को इंगित करती है। सेल पतन के बाद, परिगलित फाइबर को फागोसाइट्स द्वारा साफ किया जाता है। नवगठित मायोफिकर्स शुरुआती चरणों में छोटे आकार को प्रस्तुत करते हैं, और फिर उत्तरोत्तर मांसपेशियों के जनक फ्यूज के रूप में बड़ा होते हैं और सिंसिटिरियल सेल में योगदान देते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, myonuclei केंद्रीय स्थिति में रहते हैं । छोटे, केंद्रीय रूप से नाभिक मायोफिकर्स के समूह हाल ही में मायोफिकर्स(चित्रा 1सी,ऊपरी भाग) को पुनर्जीवित करने का संकेत देते हैं।
चित्रा 1: एमडीएक्स की मांसपेशी को विकृत करने से क्रॉस-सेक्शन में आईजीजी तेज की प्रतिनिधि छवि। (क)4 सप्ताह पुराने एमडीएक्स माउस से टीए को खरगोश (लाल) और माउस आईजीजी (ग्रीन) में उठाए गए पैन-लेमिनिन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके क्रायोसेक्शन किया गया और इम्यूनोलेबल किया गया। नाभिक को DAPI (सफेद) का उपयोग करके लेबल किया गया था। (ख, ग) पैनल ए स्केल बार = 500 माइक्रोन के बढ़े हुए क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मायोफाइबर परिगलन सामान्य मांसपेशियों में दर्दनाक व्यायाम का एक आम परिणाम है। यह स्थानीय मांसपेशियों के जनकों की एक शक्तिशाली पुनर्योजी क्षमता द्वारा अच्छी तरह से मुआवजा दिया जाता है। हालांकि, एमडी जैसे कई मांसपेशियों की स्थितियों में, उपग्रह कोशिकाओं की पुनर्योजी क्षमता क्रोनिक मायोनेक्रोसिस और अत्यधिक फाइब्रोसिस द्वारा समझौता किया जाता है। हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि मांसपेशियों के रेशों क़ब्रिस्तान, परिगलन का एक विनियमित रूप से मर सकते हैं । अधिक विशेष रूप से, क़ब्रिस्तान का अवरोध डीएमडी उपचार4के लिए एक नई चिकित्सीय रणनीति बन सकता है। मांसपेशियों के पतन विकारों में सेल मौत के रास्तों की जांच मांसपेशियों की कोशिका मृत्यु मात्रा के विश्वसनीय तरीकों की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल आईजीजी तेज प्रतिरक्षण तकनीक का वर्णन करता है जो मायोफिकर्स को लेबल करता है जो परिगलन से गुजरता है।
प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का नुकसान जो परिगलन की विशेषता है, क्षति से जुड़े अणुओं के पैटर्न और एल्बुमिन, आईजीजी और आईजीएम15जैसे प्लाजमैटिक प्रोटीन के तेज को छोड़ देता है। आईजीजी तेज लेबलिंग विधि की कार्रवाई का तंत्र ईबीडी जैसे महत्वपूर्ण रंगों के समान है। नेक्रोटिक मायोफिकर्स चालू हो जाते हैं और इंजेक्शन वाले महत्वपूर्ण रंगों के रक्त प्रोटीन को ट्रैप करते हैं, जबकि जीवित कोशिकाएं नहीं होती हैं। इस तकनीक की प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट को केविन कैंपबेल के समूह द्वारा एमडी15 पर मान्य किया गया है लेकिन अपर्याप्त रूप से प्रसारित किया गया है ।
चित्रा 1 myonecrosis से प्रभावित डिस्ट्रोफिक मांसपेशियों में आईजीजी तेज लेबलिंग के विशिष्ट परिणाम प्रदान करता है। केवल तीन रंगों (हरे रंग में आईजीजी, लाल रंग में बाह्य मैट्रिक्स और नीले/सफेद में नाभिक) सहित एक इम्यूनोलेबलिंग के साथ। मांसपेशी हिमेटोलॉजी के कई महत्वपूर्ण मापदंडों को निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें मायोफीयर्स की संख्या और आकार और मायोनेक्रोसिस की सीमा शामिल है, जो क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र में लेबलिंग के प्रतिशत या परिगलित मायोफ़िजरों के प्रतिशत द्वारा व्यक्त किया गया है। उत्थान का उचित अनुमान भी इस धुंधला के साथ निर्धारित किया जा सकता है । दरअसल, केंद्रीय रूप से नाभिक मायोफिकर्स(चित्रा 1सी,ऊपरी भाग) की उपस्थिति स्थानीय उत्थान को दर्शाती है और इस प्रकार अपक्षयी घटना को दर्शाती है। तुलना के लिए, स्वस्थ मांसपेशियों के ऊतकों को चित्रा 1बीमें प्रस्तुत किया जाता है। नोट की, नवगठित myofibers में केंद्रीय नाभिक वयस्क चूहों के पुनर्जीवित myofibers में कई हफ्तों के लिए रहता है । हालांकि, चूहों16में प्रातः आयु से पहले परमाणु पुनर्स्थिति काफी तेज होती है।
परिणाम के इस प्रकार के एक और रंग से पता चला लेबलिंग जोड़कर आसानी से समृद्ध किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, घुसपैठ कोशिकाओं की प्रकृति और फेनोटाइप की उचित मार्कर का उपयोग करके आगे की जांच की जा सकती है। CD68 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी अधिमानतः मैक्रोफेज आबादी लेबल होगा, चाहे उनकी भड़काऊ स्थिति4,9। यदि आवश्यक हो, तो इन कोशिकाओं की भड़काऊ स्थिति की आगे जांच की जा सकती है17।
किसी भी पारंपरिक फ्लोरोसेंट धुंधला के रूप में, मांसपेशियों की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। मांसपेशियों की बायोप्सी और क्रायोसेक्शन को हर समय सूखी बर्फ में और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए रखा जाना चाहिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह ऊतक संरक्षण को प्रभावित कर सकता है। नमूनों के फ्रीज-विगलन चक्रों से भी सख्ती से बचा जाना चाहिए ।
इस तकनीक में ईबीडी और एच एंड ई दाग जैसी सबसे लोकप्रिय तकनीकों पर महत्वपूर्ण फायदे हैं। यह सरल और लचीला है और केवल पारंपरिक इम्यूनोलेबलिंग सामग्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार आईजीजी से जुड़े फ्लोरोफोर रंग के विकल्प के साथ-साथ आगे के एंटीजन के खिलाफ सह-इम्यूनोलेबलिंग के प्रदर्शन के बारे में लचीलापन की पेशकश की जाती है। तुलना के रूप में, एच एंड ई दाग और ईबीडी केवल एक ही रंग में प्रकट किया जा सकता है और मायोफाइबर स्थान या भड़काऊ सेल घुसपैठ की सीमा और प्रकृति जैसे महत्वपूर्ण मापदंडों का आकलन करने के लिए अन्य लेबलिंग के साथ संबद्ध नहीं किया जा सकता है। ईबीडी विधि मांसपेशियों की कटाई से पहले 24 घंटे के आसपास जानवरों के रंग इंजेक्शन की आवश्यकता है, जबकि आईजीजी तेज विधि मनुष्यों सहित किसी भी नमूने में किया जा सकता है । ईबीडी-इंजेक्शन वाले जानवरों की पूरी मांसपेशी में रंग शामिल है जो संभवतः मांसपेशियों की फ्लोरोसेंट इम्यूनोलेबलिंग या रक्त सीके रंगीन परख जैसे आगे के विश्लेषण को प्रभावित कर सकता है।
myonecrosis के सटीक मात्रा का निर्धारण अधिमानतः सेल प्रकार का एक विश्वसनीय मार्कर निकलता है । यहां, कोशिकाओं की प्रकृति का मूल्यांकन मायोफिकर्स के आसपास के बाह्य डिब्बे के साथ सह-लेबलिंग आईजीजी द्वारा परिगलित भाग्य के साथ किया जा सकता है। चित्रा 1में, मायोटिकर्स की पहचान आसपास के बाह्य मेट्रिक्स जैसे लेमिनिन के प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करके की गई थी। कोलेजन जैसे अन्य घटकों पर भी दाग लग सकता है। हालांकि, सरकोलेमा से संबंधित प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी से बचना चाहिए। हमारे अनुभव में, उनकी प्रतिरक्षा गतिविधि तुरंत फाइबर के परिगलन के बाद गायब हो जाती है।
मायोफिकर्स के भीतर आईजीजी तेज की इम्यूनोलेबलिंग विशेष रूप से परिगलित मांसपेशियों के रेशों को दागने के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका है। यह आसानी से और नियमित रूप से किया जा सकता है और क्लासिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए उत्तरदायी नमूनों पर लागू होता है। इसकी विशिष्टता और प्रतिसंकेतों की सामान्य कमी को ध्यान में रखते हुए, परिगलित चोट की प्रकृति की परवाह किए बिना, myonecrosis मूल्यांकन के लिए सोने के मानक के रूप में उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को ट्रांसलामांसपेशी कार्यक्रम के साथ एसोसिएशन फ्रैंकोइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथी द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक पढ़ने के लिए डॉ पेरला रेयेस-फर्नांडीज और डॉ मैथ्यू बोरोक का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
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