Summary
该协议显示了一种简单而灵活的方法,用于评估新的调理剂或策略,以提高循环死亡后心脏捐赠的可行性。
Abstract
心脏移植需求呈上升趋势;然而,由于缺乏合适的捐赠者,器官的可得性有限。循环死亡后器官捐献 (DCD) 是解决这种有限可用性的解决方案,但由于长期温暖的缺血期和组织损伤的风险,其常规使用在心脏移植中很少见。在本手稿中,我们提供了一个详细的方案,通过持续监测心脏功能,在DCD的背景下密切模仿当前的临床实践,允许评估新的心脏保护策略和干预措施,以减少缺血性再灌注损伤。
在此模型中,DCD协议通过停止通气诱导循环死亡在麻醉的Lewis大鼠中启动。当收缩压降至 30 mmHg 以下时,开始出现温暖的缺血时间。在预先设定的温暖缺血期后,心脏被冲洗与规范的性心液溶液,采购,并安装在兰根多夫前体内心脏灌注系统。在初始再灌注和稳定10分钟后,使用室内压力监测持续评估心脏修复60分钟。通过测量心脏肌钙蛋白 T 来评估心脏损伤,并且通过组织染色量化梗死大小。温暖的缺血时间可以调整和定制,以发展所需的结构和功能损伤量。这个简单的协议允许评估在心痛、初始再灌注和/或前体灌注时引入的不同心内保护调节策略。从该协议获得的发现可以复制在大型模型中,便于临床翻译。
Introduction
固体器官移植,特别是心脏移植,在全球呈上升趋势。"器官采购的标准方法是脑死亡后捐赠(DBD)。鉴于DBD的严格包容标准,只有不到40%的被录取的心被接受3,从而限制了在面对不断增长的需求和扩大器官等待名单的报价。为了解决这个问题,使用循环死亡后捐赠的器官(DCD)被认为是一个潜在的解决方案4。
然而,在DCD捐赠者中,在戒断护理后出现一个前发期,以及复苏前一段未受保护的温暖缺血期是不可避免的。循环死亡后潜在的器官损伤可能导致器官功能障碍,这解释了人们不愿意常规地采用DCD心脏移植。据报道,只有4个中心使用DCD心脏临床,与严格的标准,包括很短的温暖缺血时间和年轻的捐赠者没有慢性病理6,7。出于伦理和法律原因,在循环死亡5、8、9之前,对捐献者可以进行有限或没有心脏保护干预。因此,任何缓解缺血性再灌注(IR)损伤的缓解措施仅限于在用心电图溶液进行早期再灌注期间启动的心脏病保护疗法,并且不允许进行适当的功能评估。外体心脏灌注(EVHP)和修复DCD心脏使用专用平台已被提出作为替代解决方案,并研究由各种学者10,11,12,13.EVHP 提供了一个独特的机会,将后调理剂交付给 DCD 心脏,以改善功能恢复。然而,为了有效的临床翻译,许多技术和实际问题仍有待解决,而由于缺乏一系列灌注和功能标准来确定可移植性,情况进一步复杂化了。 8.
本文报告开发一种可重复的临床前小动物DCD协议,结合一个体外心脏灌注系统,可用于研究在采购时,在初始再灌注期间启动的器官后调节,以及/或在整个 EVHP 中。
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Protocol
所有动物护理和实验规程均符合《实验室动物护理和使用指南》,并经蒙特利尔大学研究中心动物护理和使用中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 初步准备工作
- 打开水浴加热心痛输送系统(图1A)和兰根多夫前体内灌注系统(图1B)。将水温设置为 38.5 °C,溶液温度为 37°C。设置照片可以在补充图1A,B中看到。
- 准备1L心电图溶液。将 1 mL 的 2% 盐酸利多卡和 10 mM KCl(最终浓度 20 mM)添加到 1 L 的等离子-Lyte A(140 mM Na、5 mM K、1.5 mM Mg、98 mM Cl、27 mM 醋酸盐、23 mM 葡萄糖酸盐)。使用 6 N HCl 将 pHH 校正至 7.4。
警告:此模型对 pH 高度敏感。错误的 pH 校正(超出 7.3-7.4 生理范围)或 pH 不稳定溶液可能会损害实验或提供不可靠的数据。 - 准备 4 L 克雷布斯溶液 (113 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1.6 mM NaH2PO4, 1.25 mM CaCl2, 1 mM MgCl2+6H2O, 5.5 mM D-葡萄糖, 25 mM NaHCO3)每 1 L 溶液的基质应如下:6.1 g NaCl、0.3355 g KCl、0.2035 g MgCl2±6H2O、0.192 g NaH2PO4、0.1387 g CaCl 2、0.99 g D-葡萄糖、2.1 g NaHCO3 ,在超纯脱离子水中的最终体积为1L。添加 NaHCO3最后避免降水。使用 0.22 μm 过滤器过滤溶液并储存过夜。当溶液在37°C时,将pH值校正为7.4,在5%CO2/95%O2下起泡。
- 使用克雷布斯溶液填充兰根多夫电路并启动系统泵。确保管道内没有气泡。将蠕动泵转速调整到 80 rpm(相当于 1 升/分钟)。使用双向停止公鸡,调整流量,以保持缓慢滴通过主动脉管,直到心脏连接(图1B)。将 Krebs 溶液(15 mL)样品保存在 50 mL 圆锥管中,用于心脏运输。
- 用心痛溶液填充心痛输送系统。一旦气泡被移除,使用3路停止旋塞(图1A)将电路切换到盐水。调整滴水率。盐水必须缓慢地从导管尖端滴下,以确保在动物死亡前不会注射心电图溶液。
2. 动物准备
- 使用吸入室,诱导麻醉与3%的异常。一旦动物没有反应,根据当地规定,进行腹肌内注射氯胺酮(75毫克/千克)和木兰辛(5毫克/千克)或类似合适的麻醉剂,以维持麻醉。确保麻醉的深度,不反应脚趾捏和苍白反射。
- 使用14G,2英寸I.V.导管插入动物。以每分钟 50 次呼吸开始通风,气道压力限制为 20 cmH2O。
- 将动物放在设置为"中等"的加热垫上,并盖上吸水垫以保持体温。插入直肠温度探头,并将透皮脉冲血氧仪传感器连接到其中一个支脚。在整个过程中,将直肠温度保持在37°C。
-
血管访问
- 用剪刀在颈部做一个3至4厘米的中线皮肤切口。使用钝尖弯曲剪刀,钝解剖皮下组织,并暴露右肌体肌肉。使用非创伤性钳子,横向移动肌肉,直到右颈动脉(脉动)、颈静脉(非脉动)和迷走神经(白色)被目视识别(补充图2A)。使用钝尖弯曲剪刀小心地将迷走神经与胡萝卜动脉分离。
- 通过右颈静脉注射肝素(2,000 IU/kg)。在针头缩回后,对注射部位施加压力,以避免血液泄漏。
- 使用弯曲的钳子,通过两个5-0丝缝合线周围的胡萝卜动脉。牢固地连接远端缝合线,以遮挡动脉的优越性阻塞胡萝卜动脉。保持近线缝合解开。下一步,拉近丝缝合线将用于控制出血(补充图2B)。缝合线之间的距离应约为2厘米。
- 使用立体显微镜进行更好的可视化,在胡萝卜动脉的前壁上用显微手术剪刀小心地切开1毫米切口。将 22 G、1 英寸闭合的 I.V. 导管插入主动脉。导管连接到2路止孔,允许连接到压力传感器进行持续监测,并有可能通过心痛输送系统注射盐水或心痛(图1A)。
3. 循环死亡后心脏捐献(DCD)协议启动
注:完整的协议时间线如图2所示。
- 通过执行脚趾捏和评估帕佩布拉反射来重新评估麻醉深度。如果观察到反应,进行氯胺酮(37.5毫克/千克)和木拉津(2.5毫克/千克)的腹内注射。5 分钟后重新评估。如果未观察到响应,请继续执行该过程。气管夹只应在充分麻醉的动物身上进行。
- 关闭呼吸机,给动物排泄。使用蚊香钳夹住气管。这一刻被认为是前阶段的开始。当收缩压峰值降至 30 mmHg 以下时,或者如果出现腹膜颤动或心室颤动,则首先计算功能性热缺血时间 (WIT)(图 3)。
注:损坏程度应与 WIT 成正比。需要实验来优化WIT时间,根据麻醉剂使用,动物应变,性别和体重选择。在对照动物中,在胡萝卜血管访问安全后,立即注射心痛,并如下一步所述获得心脏(图2)。心痛灌注的开始被认为是WIT的结束。 - 在 WIT 结束时,进行内联切除术。使用 Alm 缩回器使胸腔保持打开。使用剪刀,打开劣质的vena卡瓦和两个心房,以避免心肌裂断或心律再循环(补充图3)。将主塔夹在隔膜上方。通过先前导管化的胡萝卜动脉,使用心痛输送系统,在60 mmHg的恒定压力下注入心电图溶液5分钟。输液压力可以通过改变水柱的高度来改变。
- 在心电图输注结束时,使用弯曲的钳子从肺动脉解剖上升近端主动脉(补充图4A)。切断左下方动脉的主动脉远端。确保 Langendorff 仪器的主动脉长度至少为 0.5 厘米。
- 将心脏从主动脉中保持,通过将心脏与肺静脉和其他胸腔结构分离完成心脏切除术(补充图4B)。迅速,将心脏浸入冰冷的Krebs溶液中,以便快速运输到外体系统。尽可能缩短解剖和运输时间(5 分钟)。
4. Ex Vivo 心脏灌注系统 (EVHP) 和心脏功能评估
- 使用钳子打开主动脉流明。通过向流明中注入滴落的Krebs溶液来消除主动脉,以避免将气泡强行注入冠状血管。将导管降至主动脉,注意不要通过主动脉根或损坏主动脉瓣单张。用小夹具固定设置。
- 使用 2 路停止孔,增加流量以搜索主塔中可能的泄漏。如果未检测到任何检测,使用 2-0 丝质缝合线将主塔紧紧固定在管上。完全打开流向管状的流量。在 60-70 mmHg 的生理压力下保持主动脉压力(通过更改系统高度进行调整)。此时,初始灌注和稳定时间开始。主动脉压力可根据研究者的实验计划进行修改。
- 旋转心脏,使心脏(atria)的底座面向压力传感器。通过解剖肺静脉来扩大左心室心房开庭。插入连接到压力传感器的乳胶气球。通过目视检查,确保气球完全位于心室内。缓慢地向气球加注盐水,直到端舒张压力 (EDP) 设置为 15 mmHg。根据需要进行调整以保持 EDP 恒定(预先确定的生理 EDP)。EDP 可以根据每个调查员的实验目标进行调整。
- 将起搏电极插入心脏的前表面(右心室流出道)。避免刺穿冠状血管。一旦观察到自发跳动,以每分钟300次的速度开始起搏。实验和大鼠菌株之间可能会有所不同。
- 稳定 10 分钟后,启动连续的室内压力测量记录。这一时刻被认为是修复和评估阶段(时间 0)的开始,将持续 1 小时(图 2)。修复可能会延长,但预计所有心脏的收缩性依赖性下降。
- 在修复开始时,收集从心静脉滴出的心脏流出物5分钟,用于基线冠状动脉流动评估和生化分析。对于肌钙蛋白 T 每 15 分钟重复一次(时间 0、15、30、45 和 60 分钟)。对于其他分析,需要个性化收集时间(图2)
5. 经验结束
- 从兰根多夫装置中取出心脏。
- 使用直高碳钢刀片(微管刀片或类似),去除心脏底部(包括主动脉和肺动脉)。
- 右心室朝下,切割厚度为 1-2 mm 的横向心室滑道。在一个代表部分(通常为第三节)切除右心室并卡扣冻结左心室。该样品可用于生化分析。
- 在商业磷酸盐缓冲液盐pH 7.4中将其余部分浸入新鲜制备的5%2,3,5-四氯二氯氯化物中,在37°C下10分钟。活组织是彩色红砖。
- 用磷酸盐缓冲液pH7.4洗涤两次,在4°C处用10%的卡金固定过夜。用磷酸盐缓冲盐水pH7.4洗涤两次,保持每片浸入。
- 提取多余的液体和重量每张幻灯片。拍摄两侧的数字彩色图像。使用平面分析计算梗塞大小百分比,并校正切片和总心室重量。着色会随时间而褪色。必须尽快拍摄照片。
6. 数据分析
- 将每个动物的所有压力数据保存在新文件中。
- 对于压力分析,每个时间点至少选择 200 个压力循环。分析可以使用专用软件(即 LabChart)在线执行(实验完成后)。常见的心血管参数包括:最大生成压力、端舒张压力、+dP/dt(压力曲线上冲程期间最陡的斜率、心室收缩能力指标)、-dP/dt(在压力曲线上升期间最陡的斜率)压力曲线的向下冲程,心室松弛能力指标等。
注:对于肌钙蛋白分析,预计在再灌注时肌钙蛋白释放会增加。在EVHP系统中再灌注1小时后,肌钙蛋白水平可能降至基线,强调在收集和处理这些样品时需要仔细计时。
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Representative Results
排泄后,血压迅速下降,以可预测的模式(图3)。预计死亡时间小于5分钟。
图 4显示了 WIT 0、10 和 15 分钟之后修复开始时的平均压力/时间曲线。收缩功能将随着时间的推移而改善。短时间的 WIT 将使收缩性恢复正常,并且形态损伤将不可检测(图 5和图 6)。
与心胸结合一起添加的调理剂的概念使用证明,在稳定阶段表明,该模型中 15 分钟 WIT 产生的损伤可由心形保护剂调节(图4,图 5和图 6.
图 1:所需的设备架构。对A(A)心痛输送系统和(B) 朗根多夫前活体心脏灌注系统的最小要求.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:协议时间线。从排泄到协议结束的时间轴。在控制动物中,心律失常在没有DCD或温暖缺血时间的情况下启动。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:内胡萝卜体血压/时间图。外管后卡托皮内血压的典型演变。当收缩压峰值降至 30 mmHg 以下时,或者如果出现腹膜颤动或心室颤动,无论先来,热缺血时间星。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:外体平均节拍到跳动心室压力时间曲线。图像来自分析10分钟稳定和灌注后的数据(图2中的时间0),无论是否使用实验性药理性心内保护调节剂。缺血时间是指温暖的缺血时间(WIT)。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:外体恢复和功能分析。(A) 连续心室压力-时间曲线后10分钟稳定和灌注,无论是否使用实验药理性心保调理剂。箭头显示由于手动修改 EDP 而导致的工件。(B) LV 中压力变化的最大(+dP/dt)和最小(-dP/dt)与来自 (A) 的时间图的变化速率,显示无处理的收缩性随时间相关改善(绿线)。短 WIT(红线)或经过处理的(黄色)心脏显示类似于对照组(蓝线)的模式。数据点是至少 200 个单个节拍的平均值。条形显示每个数据点均值的标准误差。请点击此处查看此图的较大版本。
图6:2,3,5-三聚苯乙烯氯化物在实验结束时着色。在不同温缺血时间(WIT)和使用药理性心内保护调节剂后观察到的梗死区域。砖红色:可行的组织。浅黄色:非活组织。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1:设置照片。(A) 显示心痛传送系统的设置的照片.编号设备对应:心胸容器(1)、气泡陷阱(2)、压力传感器和导管(3)、蠕动泵(4)、连接到压力传感器(5)的测谎仪(5)和小型动物呼吸机(6)。(B) 照片显示兰根多夫前心脏灌注系统的设置。编号设备对应:渗透容器(1)、调理剂容器(2)和心室(3)。请点击此处下载此图。
补充图2:颈部解剖。(A) 拍摄在肝素注射前暴露的静脉(箭头)。(B) 显示解剖的胡萝卜动脉(箭头),缝合线用于控制出血。请点击此处下载此图。
补充图3:打开开体以防止再循环。(A) 显示左心房附属项(1)开口的摄影作品。在背景上,主塔 (2) 夹在隔膜 (3) 上方。(B) 显示右心房附属项 (1) 的开口。请点击此处下载此图。
补充图4:心脏采购。(A) 摄影显示使用弯曲的钳子来分隔主动脉(箭头)和肺动脉。(B) 显示心脏解剖和采购的摄影。心脏被主塔用钳子抓住。请点击此处下载此图。
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Discussion
这里提出的协议介绍了一个简单,方便和多功能的心脏DCD模型,提供了机会,以评估心脏功能恢复,组织损伤和使用后心形保护剂,以改善捐赠者的恢复心脏否则被丢弃移植。Ex vivo 心脏灌注系统 (EVHP) 系统经过优化,为评估心脏功能提供了一个平台,并提供独特的机会来提供和测试经过改进的解决方案,并辅以后调理药理剂保存和修复DCD心脏在小15和大动物16,17模型的心脏DCD。然而,这些协议往往不够详细,并不总是与临床相关,使得临床翻译变得困难。
在DCD模型领域,前体DCD模型,如Sanz18描述的模型,缺乏前相。通过停止机械通气诱导心脏骤停,交感神经系统过度激活,导致"卡索拉明风暴"19。儿茶酚胺的增加改变了供体器官的特性,并且与实验性DCD器官19的功能状态下降有关。此外,在腹胀之前功能逐渐下降会导致右心室扩张和由此引起的损伤。在我们的协议中,我们使用临床相关的窒息模型诱导循环死亡,该模型维持这些反应。
文献中描述了两个主要的体内心脏DCD模型:开胸15和闭胸20个模型。心脏生理学通过减少机械肺/心脏相互作用和预负荷,通过开放胸法改变。此外,在开胸手术中,身体热量损失加速,进一步影响功能结果21。因此,最好保持封闭的胸部方法,防止热量损失。另一个改进是尽量减少循环死亡的时间变化。Kearns等人报告说,死亡时间(非脉动或平均血压低于30毫米汞柱的时间)在3至11分钟之间。在10分钟和20分钟的WIT中,40%和60%的心脏没有恢复功能,分别对外体工作心脏仪,使数据解释更加困难15。减少循环死亡时间的替代方法是使用麻痹剂20;然而,一些证据表明,由于它对交感和寄生内侧22的影响,它直接对心肌效应。为了提高可重复性,我们选择气管夹紧,结合精确的动脉压力监测,允许更均匀的前部时间(<5分钟)。众所周知,器官损伤在循环死亡的时刻之前开始;一些作者认为,在50 mmHg以下的切断收缩压作为功能WIT6的开始,解释在长期形式退出生命维持措施直到重新灌注之前,不愿移植器官。在此协议中,所使用的 WIT 定义遵循当前实验标准15,然而,还需要进一步研究,以澄清标记器官损伤感应的精确血液动力学参数集,以便改进 WIT计算,从而为临床实践提供更好的信息。
在恒定的生理压力和温度下输注心瘫溶液提供了一个独特的机会,用任何药理剂或其他方法启动心脏调理和组织保护。技术改进包括夹紧胸主塔,限制心脏灌注,从而减少每篇文章所需的溶液量。一旦心脏位于EVHP系统上,就有必要进行标准化的功能评估。已经表明,使用EVHP系统有可能改善以前被认为不可移植的心脏的复苏23,24。有趣的是,临床上可用的EVHP系统仅通过使用串行乳酸测量8,23来评估心脏活力。乳酸测量与DCD心脏24、25的心脏性能无关,因此有必要进行额外的测量,以评估可移植性。此实验设置允许完整的功能评估,包括生成的压力和心肌收缩测量,包括 +dP/dT 和 _dP/dT,允许在最终移植前对心脏功能进行更彻底的评估做出决策。此外,心脏肌钙蛋白的测量,心肌损伤的标记与缺血性梗死大小26直接相关,和释放动力学与兰根多夫缺血/再灌注系统的心脏缺血程度有关。特别是,与长缺血时间(60分钟),肌钙蛋白水平保持后1小时再灌注,而LDH和肌氨酸激酶显著减少,并与心脏损伤的程度27,28,因此使用系列肌钙蛋白措施可确保在移植前对器官活力进行全面评估。心脏功能评估的一个主要混淆变量是心率。自发心率与缺血29的长度成反比,心率与分离的大鼠心脏30和动物模型31中的+dP/dt直接相关。有趣的是,在最近发表的DCD心脏和EVHP调理的啮齿动物模型的工作中,没有使用起搏,心脏速率是可变的,并记录在他们的协议15,18,20。为了保持生理心率,一旦心脏恢复有节奏的收缩,就使用起搏。选择的300 bpm频率与健康、无压力大鼠32的频率相似。
该协议的限制包括使用挥发性麻醉剂进行诱导。这些制剂已被证明授予缺血预处理33。然而,吸入麻醉剂使用时间短,在该协议中没有可观察到的效果,并且随着WIT的增加,渐进性心肌功能障碍仍然被注意到。使用规范性心痛也可以被视为一种限制。使用规范性心胸痛允许从用于开发药理调理剂的体外条件进行最佳翻译,因为细胞通常保持在37°C。然而,在这种设置中,心痛温度可以很容易地根据调查员的要求调节。另一方面,使用兰根多夫制剂与心脏工作准备进行修复也可能被视为一种限制。工作心脏准备允许连续记录压力/体积循环12,15,与受控的前后负荷,允许完整的功能评估。Langendorff 制备的主要优点是,它保持恒定的主动脉和灌注压力,尤其是在初始再灌注期间,当产生的压力最小时。此外,与工作心脏准备相比,兰根多夫心脏的评估设置更简单。然而,如果有必要,可以将此设置转换为工作心脏准备。或者,心脏恢复可以使用规范的区域灌注原位进行,心脏性能直接通过使用米勒导管34测量,允许综合血液动力学和心肌功能器官采购前的评估。在人类中,原位和外体修复策略都描述了6,因此两种模型的发展允许实验比较,可以转化为临床实践的优化。最后,由于在进行这些实验时观察到的潜在技术困难,以及大鼠和人类心脏之间不可避免的生理差异,这种动物模型体积小、心率高可被视为一种限制。如果 EVHP 评估已经标准化,研究人员可以通过执行多达 3 个实验来熟悉此技术。另一方面,使用这种小型动物模型,可以以方便筛选,以合理的成本,保留更大和更昂贵的动物模型,如猪模型,以治疗具有高人类转化潜力。
最后,本文描述的协议考虑到了研究DCD心脏的几个小组的最佳做法。该协议允许完全控制 WIT,允许对大鼠的心脏病保护治疗策略进行全面的结构和功能评估。该协议可以升级并转移到大型动物模型,允许将研究结果转化为临床现实,并最终允许开发新疗法,提高救生器官的质量和可用性。患者。
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Disclosures
作者报告本文中讨论的任何产品或概念没有专有或商业利益。
Acknowledgments
这项工作的部分内容得到了马塞尔基金会和罗兰·戈塞林基金会和斯特凡·福米基金会的慷慨捐助的支持。尼古拉斯·诺雷克斯是FRQ-S的学者。
作者们感谢乔希·卓乐·黄、加布里埃尔·加斯康、索菲亚·吉亚西和凯瑟琳·斯卡拉布里尼在数据收集方面的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride. 1 L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14 G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22 G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1,000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/mL | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/mL |
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