Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Modèle préclinique du don cardiaque après la mort circulatoire

Published: August 2, 2019 doi: 10.3791/59789
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 3, 1,4, 1,4
1Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Deparment of pharmacology and physiology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Division of Cardiovascular Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 4Department of surgery, Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole montre une approche simple et flexible pour l'évaluation de nouveaux agents de conditionnement ou de stratégies pour augmenter la faisabilité du don cardiaque après la mort circulatoire.

Abstract

La demande de transplantation cardiaque est à la hausse; néanmoins, la disponibilité des organes est limitée en raison du manque de donneurs appropriés. Le don d'organes après la mort circulatoire (DCD) est une solution pour répondre à cette disponibilité limitée, mais en raison d'une période d'ischémie chaude prolongée et le risque de lésions tissulaires, son utilisation courante dans la transplantation cardiaque est rarement vu. Dans ce manuscrit, nous fournissons un protocole détaillé imitant étroitement les pratiques cliniques actuelles dans le contexte de DCD avec la surveillance continue de la fonction cardiaque, permettant l'évaluation des nouvelles stratégies et interventions cardioprotectrices pour diminuer ischémie-reperfusion.

Dans ce modèle, le protocole DCD est initié chez les rats Lewis anesthésiés en arrêtant la ventilation pour induire la mort circulatoire. Lorsque la pression artérielle systolique descend en dessous de 30 mmHg, le temps ischémique chaud est lancé. Après une période ischémique chaude pré-fixée, les coeurs sont rincés avec une solution cardioplégique normothermic, acheté, et monté sur un système de perfusion de coeur ex vivo de Langendorff. Après 10 min de réperfusion et de stabilisation initiales, le reconditionnement cardiaque est continuellement évalué pendant 60 min en utilisant la surveillance intraventriculaire de pression. Une lésion cardiaque est évaluée en mesurant la troponine cardiaque T et la taille infarctus est quantifiée par la coloration histologique. Le temps ischémique chaud peut être modulé et adapté pour développer la quantité désirée de dommages structurels et fonctionnels. Ce protocole simple permet l'évaluation de différentes stratégies de conditionnement cardioprotective introduites au moment de la cardioplégie, de la réperfusion initiale et/ou pendant la perfusion ex vivo. Les résultats obtenus à partir de ce protocole peuvent être reproduits dans de grands modèles, facilitant la traduction clinique.

Introduction

La transplantation d'organes solides en général et la transplantation cardiaque, en particulier, sont à la hausse dans le monde1,2. La méthode standard d'achat d'organes est le don après la mort cérébrale (DBD). Compte tenu des critères d'inclusion stricts de la DBD, moins de 40% des cœurs offerts sont acceptés3, limitant ainsi l'offre face à la demande croissante et l'extension de la liste d'attente des organes. Pour résoudre ce problème, l'utilisation d'organes donnés après la mort circulatoire (DCD) est considérée comme une solution potentielle4.

Chez les donneurs de DCD, cependant, une phase angoissée après le retrait des soins et une période d'ischémie chaude non protégée avant la réanimation sont inévitables5. Les dommages potentiels d'organe après la mort circulatoire peuvent mener au dysfonctionnement d'organe, expliquant la réticence à adopter systématiquement des transplantations de coeur de DCD. Il est rapporté que seulement 4 centres utilisent des coeurs de DCD médicalement, avecdes critères stricts qui incluent les temps chauds très courts d'ischémie chaude et les jeunes donateurs sans pathologies chroniques 6,7. Pour des raisons éthiques et juridiques, des interventions cardioprotectrices limitées ou inadaptées peuvent être appliquées chez les donneurs avant la mort circulatoire5,8,9. Ainsi, toute atténuation pour soulager les lésions ischémique-réperfusion (IR) est limitée aux thérapies cardioprotectrices initiées lors d'une réperfusion précoce avec des solutions cardioplégiques, et ne permettent pas une évaluation fonctionnelle appropriée. Perfusion cardiaque ex vivo (EVHP) et le reconditionnement du cœur DCD à l'aide de plates-formes dédiées a été proposé comme une solution alternative et étudié par divers chercheurs10,11,12,13 . EVHP offre une occasion unique de fournir des agents post-conditionnement aux cœurs DCD pour améliorer la récupération fonctionnelle. Cependant, pour une traduction clinique efficace, de nombreuses questions techniques et pratiques restent à résoudre, et cela est encore aggravé par l'absence de consensus sur une gamme de perfusion et de critères fonctionnels pour déterminer la transplantation6, 8.

Ici nous rapportons le développement d'un protocole préclinique reproductible de DCD d'animal de petit animal combiné avec un système ex vivo de perfusion de coeur qui peut être employé pour étudier le post-conditionnement d'organe lancé au moment de l'approvisionnement, pendant la reperfusion initiale, et /ou dans l'ensemble de l'EVHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tous les protocoles de soins et d'expérimentation des animaux conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre hospitalier de l'Université de Montréal.

1. Préparations préliminaires

  1. Allumez le bain d'eau pour chauffer le système de livraison de cardioplégie (Figure 1A) et le système de perfusion ex vivo Langendorff (Figure 1B). Fixer la température de l'eau à 38,5 oC pour une température de solution de 37 oC. Les photographies d'configuration peuvent être vues dans la figure 1A supplémentaire,B.
  2. Préparer 1 L de solution cardioplégique. Ajouter 1 ml d'hydrochlorure de lidocaïne 2% et 10 ml de 2 ml de KCl (concentration finale 20 mM) à 1 L de Plasma-Lyte A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM Cl, 27 mM d'acétate, 23 mM de gluconate). PH correct à 7.4 en utilisant 6 N HCl.
    MISE EN GARDE: Ce modèle est très sensible au pH. Une correction du pH erroné (en dehors de la plage physiologique de 7,3-7,4) ou des solutions instables de pH peuvent compromettre l'expérience ou fournir des données peu fiables.
  3. Préparer la solution 4 L de Krebs (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2PO4, 1,25 mM CaCl2, 1 mM MgCl26H2O, 5,5 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO3). Les masses de substrat pour 1 L de solution doivent être les suivantes: 6,1 g de NaCl, 0,3355 g de KCl, 0,2035 g de MgCl26H2O, 0,192 g de NaH2PO4, 0,1387 g de CaCl2, 0,99 g de D-Glucose, 2,1 g de NaHCO3 , volume final de 1 L en eau déionisée ultrapure. Ajouter le NaHCO 3 (en) dernier pour éviter les précipitations. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et stocker pendant la nuit. Corriger le pH à 7,4 lorsque la solution est à 37 oC et bulle avec 5% CO2/95% O2.
  4. Remplissez le circuit Langendorff avec la solution Krebs et démarrez la pompe système. Assurez-vous qu'il n'y a plus de bulles à l'intérieur dutube. Ajuster la vitesse de la pompe péristatique à 80 tr/min (équivalent à 1 L/min). En utilisant le coq d'arrêt à double sens, ajuster le flux pour maintenir un goutte à goutte lent à travers la canule aortique jusqu'à ce que le cœur est attaché (Figure 1B). Conservez un échantillon de solution Krebs (15 ml) dans un tube conique de 50 ml sur la glace pour le transport cardiaque.
  5. Remplissez le système de livraison cardioplégie avec la solution cardioplégique. Une fois les bulles enlevées, basculez le circuit en salin à l'aide d'un coq d'arrêt à 3 voies (Figure 1A). Ajuster le taux d'égouttement. Saline doit couler lentement de la pointe du cathéter pour s'assurer qu'aucune solution cardioplégique n'est injectée avant la mort de l'animal.

2. Préparation des animaux

  1. À l'aide d'une chambre d'inhalation, induire l'anesthésie avec 3% d'isoflurane. Une fois que l'animal ne répond pas, effectuez une injection intrapéritonéale de kétamine (75 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) ou d'anesthésique s'apparatif, conformément aux règlements locaux, pour maintenir l'anesthésie pour le reste de la procédure. Assurer la profondeur de l'anesthésie par aucune réaction à pincement d'orteil et réflexe palpebral.
  2. Intuber l'animal à l'aide d'un cathéter I.V. de 14 G et 2 pouces. Démarrer la ventilation à 50 respirations par min, avec une pression des voies respiratoires limitée à 20 cmH2O.
  3. Placez l'animal sur un coussin chauffant réglé sur « moyen » et recouvrez-le d'un coussin absorbant pour maintenir la température corporelle. Insérez une sonde de température rectale et attachez un capteur d'oxymètre d'impulsion transdermique à l'un des pieds. Maintenir la température rectale à 37 oC tout au long de la procédure.
  4. Accès vasculaire
    1. Faire une incision de 3 à 4 cm dans la peau médiane dans le cou à l'aide de ciseaux. À l'aide de ciseaux courbés à pointe émoussée, disséquer le tissu sous-cutané et exposer le muscle sternohyoid droit. À l'aide de forceps non traumatiques, déplacez le muscle latéralement jusqu'à ce que l'artère carotide droite (pulsation), la veine jugulaire (non-pulsation) et le nerf vague (blanc) soient visuellement identifiés (Figure 2A supplémentaire). Séparez soigneusement le nerf vague de l'artère carotide à l'aide de ciseaux courbés à pointe émoussée.
    2. Injecter de l'héparine (2 000 UI/kg) par l'intermédiaire de la veine jugulaire droite. Appliquer une pression sur le site d'injection après la rétraction de l'aiguille pour éviter les fuites de sang.
    3. À l'aide de forceps incurvés, passez deux sutures de soie 5-0 autour de l'artère carotide. Attachez fermement une suture distale à l'occludede de l'artère carotide à l'aspect supérieur de l'artère exposée. Gardez la suture proximale déliée. Le tir de la suture proximale sera utilisé pour le contrôle des saignements à l'étape suivante (Figure 2B supplémentaire). La distance entre les sutures doit êtred'environ 2 cm.
    4. À l'aide d'un stéréomicroscope pour une meilleure visualisation, faites soigneusement une incision de 1 mm avec des ciseaux de microchirurgie au-dessus de la paroi antérieure de l'artère carotide. Insérez un cathéter I.V. fermé de 22 G et 1 pouce vers l'arc aortique. Le cathéter est relié à un robinet d'arrêt à 2 voies, permettant la connexion à un transducteur de pression pour une surveillance constante, avec la possibilité d'injecter saline ou cardioplégie via le système de livraison cardioplégie (Figure 1A).

3. Initiation du don cardiaque après la mort circulatoire (DCD) Protocole

REMARQUE: Un calendrier complet du protocole peut être consulté à la figure 2.

  1. Réévalue la profondeur anesthésique en effectuant une pincement d'orteil et en évaluant le réflexe palpebral. Si la réaction est observée, effectuer une injection intrapéritonéale de kétamine (37,5 mg/Kg) et de xylazine (2,5 mg/Kg). Réévaluer après 5 minutes. Si aucune réponse n'est observée, continuez la procédure. La pince trachéale ne doit être effectuée que chez des animaux correctement anesthésiés.
  2. Éteignez le ventilateur et extubatez l'animal. À l'aide de forceps de moustique, serrer la trachée. Ce moment est considéré comme le début de la phase agonale. Commencez à compter le temps ischémique chaud fonctionnel (WIT) lorsque la pression artérielle systolique maximale descend en dessous de 30 mmHg, ou si la fibrillation asystole ou ventriculaire apparaît, quel que soit le premier (Figure 3).
    REMARQUE: L'étendue des dommages devrait être proportionnelle à LA PFT. Des expériences sont nécessaires pour optimiser le temps WIT en fonction de l'anesthésie utilisée, de la souche animale, du sexe et du poids choisi. Chez les animaux témoins, immédiatement après la sécurité de l'accès vasculaire carotide, la cardioplégie est injectée et le cœur est acheté comme décrit à l'étape suivante (figure 2). Le début de la perfusion avec la cardioplégie est considéré comme la fin de WIT.
  3. À la fin de WIT, effectuer une stérilisation médiale. Gardez le thorax ouvert à l'aide d'un rétracteur alm. À l'aide de ciseaux, ouvrez le vela cava inférieur et les deux atriums pour éviter la distension myocardique ou la recirculation cardioplégie (figure complémentaire 3). Clamp l'aorte au-dessus du diaphragme. Par l'artère carotide précédemment cathéterisée, infuser la solution cardioplégique à une pression constante de 60 mmHg pendant 5 min utilisant le système de livraison de cardioplegia. La pression d'infusion peut être modifiée en modifiant la hauteur de la colonne d'eau.
  4. À la fin de l'infusion cardioplégique, disséquez l'aorte proximale ascendante de l'artère pulmonaire à l'aide de forceps courbés (figuresupplémentaire 4A). Couper l'aorte distale à l'artère sous-clavière gauche. Assurer une longueur aortique d'au moins 0,5 cm pour le cannulation pour l'appareil Langendorff.
  5. Tenir le cœur de l'aorte, compléter la cardicectomie en séparant le cœur des veines pulmonaires et d'autres structures thoraciques (figuresupplémentaire 4B). Rapidement, submergez le cœur dans la solution Krebs glacée pour un transport rapide vers le système ex vivo. Gardez la dissection et les temps de transport aussi courts que possible (5 min).

4. Système de perfusion cardiaque Ex Vivo (VEV) et évaluation fonctionnelle cardiaque

  1. Ouvrez le lumen aortique à l'aide de forceps. Déporter l'aorte en remplissant le lumen avec la solution Krebs goutte à goutte pour éviter de forcer des bulles dans les vaisseaux coronaires. Abaissez la canule dans l'aorte, en prenant soin de ne pas passer la racine aortique ou d'endommager les folioles de valve aortique. Fixer la configuration avec une petite pince.
  2. En utilisant le stopcock à 2 voies, augmenter le débit pour rechercher des fuites possibles dans l'aorte. Si aucun n'est détecté, fixer fermement l'aorte à la canule à l'aide d'une suture de soie 2-0. Ouvrez entièrement le flux vers la canule. Maintenir une pression aortique à une pression physiologique de 60-70 mmHg (ajustée en modifiant la hauteur du système). À ce moment, le temps initial de réperfusion et de stabilisation est lancé. La pression aortique peut être modifiée selon le plan expérimental de l'enquêteur.
  3. Faites pivoter le cœur de sorte que la base du cœur (atria) est face au capteur de pression. Élargir l'ouverture auriculaire ventriculaire gauche en disséquant les veines pulmonaires. Insérez le ballon en latex relié à un capteur de pression. Assurez-vous que le ballon est entièrement positionné à l'intérieur du ventricule par inspection visuelle. Remplissez lentement le ballon de salin jusqu'à la fin de la pression diastolique (EDP) est réglé à 15 mmHg. Ajuster au besoin pour maintenir l'EDP constant (EDP physiologique prédéterminé). Le PDE peut être ajusté en fonction des objectifs expérimentaux de chaque chercheur.
  4. Insérer l'électrode de stimulation dans la face antérieure du cœur (tract droite ventriculaire). Évitez de perforer les vaisseaux coronaires. Une fois que le battement spontané est observé, initier le rythme à 300 battements par min. La tension requise peut varier entre les expériences et les souches de rats.
  5. Après 10 min de stabilisation, initier l'enregistrement continu de mesure de pression intraventriculaire. Ce moment est considéré comme le début de la phase de reconditionnement et d'évaluation (temps 0) qui durera 1 h (Figure 2). Le reconditionnement peut être prolongé, mais une diminution de la contractilité dépendante du temps est prévue dans tous les cœurs.
  6. Au début du reconditionnement, recueillir les effluents cardiaques tombant des veines cardiaques pendant 5 min pour l'évaluation de base du débit coronaire et des analyses biochimiques. Pour la troponine T répéter toutes les 15 min (temps 0, 15, 30, 45 et 60 min). Pour d'autres analyses, l'individualisation des temps de collecte est nécessaire (Figure 2).

5. Fin de l'expérience

  1. Retirez le cœur de l'appareil Langendorff.
  2. À l'aide d'une lame d'acier à haute teneur en carbone droite (lame de microtome ou similaire), enlever la base du cœur (y compris l'aorte et l'artère pulmonaire).
  3. Avec le ventricule droit vers le bas, couper les glissières ventriculaires transversales d'une épaisseur de 1 à 2 mm. Dans une section représentative (normalement la troisième) excisez le ventricule droit et cassez geler le ventricule gauche. Cet échantillon peut être utilisé pour des analyses biochimiques.
  4. Immerger les sections restantes dans le chlorure de 5%3,5-triphenyl-tetrazolium fraîchement préparé dans le pH salin tampon commercial 7.4 pendant 10 min à 37 oC. Les tissus viables sont de couleur brique rouge.
  5. Laver deux fois avec un pH salin tampon de phosphate 7,4 et fixer avec 10% de formaline à 4 oC pendant la nuit. Laver deux fois avec du pH salin tamponné par phosphate 7,4 et garder chaque tranche immergée.
  6. Retirez l'excès de liquide et le poids de chaque diapositive. Prenez des images couleur numériques des deux côtés. Utilisez des analyses planimétriques pour calculer la taille de l'infarctus pour cent et corriger le poids ventriculaire total et de tranche. La coloration s'estompe avec le temps. Les photos doivent être prises dès que possible.

6. Analyses de données

  1. Enregistrez toutes les données de pression dans un nouveau fichier par animal.
  2. Pour les analyses de pression, sélectionnez au moins 200 cycles de pression par point de temps. Les analyses peuvent être effectuées hors ligne (après l'achèvement de l'expérience) à l'aide de logiciels dédiés (c.-à-d. LabChart). Les paramètres cardiovasculaires communs disponibles sont les suivants : pression générée maximale, pression diastolique de fin, 'dP/dt' (pente la plus raide pendant le coup ascendant de la courbe de pression, indicateur de la capacité contractile ventriculaire), -dP/dt (pente la plus raide pendant le de la courbe de pression, un indicateur de la capacité de relaxation ventriculaire) entre autres.
    REMARQUE : Pour les analyses de troponine, une augmentation de la libération de troponine à la reperfusion est prévue. Après 1 h de réperfusion dans le système EVHP, les niveaux de troponine peuvent diminuer à la ligne de base, soulignant la nécessité d'un timing soigneux dans la collecte et la manipulation de ces échantillons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Après l'extubation, la pression artérielle diminue rapidement dans un modèle prévisible (Figure 3). Le temps de mort prévu est inférieur à 5 min.

La figure 4 montre une courbe moyenne de pression/temps au début du reconditionnement après 0, 10 et 15 min de WIT. La fonction contractile s'améliorera avec le temps. L'utilisation de courtes périodes de SRT permettra à la passation de pouvoir de revenir à la normale, et les dommages morphologiques ne seront pas détectables (figure5 et figure 6).

L'utilisation par preuve de concept d'un agent de conditionnement ajouté à la cardioplégie et à la phase de stabilisation montre que les dommages générés par 15 min de WIT dans ce modèle sont propices à la modulation par des agents cardioprotecteurs (Figure 4, Figure 5 et Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Schémas d'équipement requis. Exigences minimales pour un système de cardioplégie (A) et un système de perfusion cardiaque ex vivo de Langendorff . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Chronologie du protocole. Chronologie du moment de l'extubation jusqu'à la fin du protocole. Chez les animaux témoins, la cardioplégie est initiée sans DCD ou temps ischémique chaud. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Pression artérielle intracarotide/intrigue temporelle. Évolution typique de la tension artérielle intracarotide suivant l'extubation. L'ischémie chaude est le moment où la pression artérielle systolique maximale descend en dessous de 30 mmHg, ou si l'asystole ou la fibrillation ventriculaire apparaît, quel que soit le premier. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Courbe de temps ventriculaire ventriculaire moyenne ex vivo. Image dérivée d'analyses de données prises après 10 min de stabilisation et de perfusion (temps 0 à la figure 2) avec ou sans l'utilisation d'un agent de conditionnement cardioprotecteur pharmacologique expérimental. Le temps ischémique fait référence aux temps ischémiques chauds (WIT). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Récupération ex vivo et analyses fonctionnelles. (A) Courbe ventriculaire continue de temps de pression après 10 min de stabilisation et de perfusion avec ou sans l'utilisation d'un agent de conditionnement cardioprotecteur pharmacologique expérimental. Les flèches montrent des artefacts en raison de la modification manuelle de edP. (B) Taux maximal (dP/dt) et minimum (-dP/dt) de changement de pression dans l'intrigue LV vs temps dérivée de (A) montrant une amélioration de la contractilité dépendante du temps sans traitement (ligne verte). Les cœurs courts WIT (ligne rouge) ou traités (jaunes) présentent un modèle similaire au groupe témoin (ligne bleue). Les points de données sont la moyenne d'au moins 200 battements individuels. Les barres affichent l'erreur standard de la moyenne de chaque point de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : coloration du chlorure de 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium à la fin des expériences. Zone d'infarctus observée suivant divers temps ischémiques chauds (WIT) et l'utilisation d'un agent de conditionnement cardioprotecteur pharmacologique. Rouge brique : tissu viable. Jaune clair : tissu non viable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Photographie d'configuration. (A) Photographie montrant la configuration du système de livraison de cardioplégie. L'équipement numéroté correspond à : conteneur de cardioplegia (1), piège à bulles (2), capteur de pression et cathéter (3), pompe péristétique (4), polygraphe relié au capteur de pression (5) et ventilateur pour petits animaux (6). (B) Photographie montrant la configuration du système de perfusion cardiaque Langendorff ex vivo. L'équipement numéroté correspond à : contenant de perfusate (1), récipient d'agent de conditionnement (2) et chambre de coeur (3). S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Dissection du cou. (A) Photographie montrant la veine jugulaire exposée (flèche) avant l'injection d'héparine. (B) montre l'artère carotide disséquée (flèche) avec les sutures placées pour le contrôle des saignements. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 3 : Ouverture des atriums pour éviter la recirculation. (A) Photographie montrant l'ouverture de l'appendice auriculaire gauche (1). Sur le fond, l'aorte (2) est serrée au-dessus du diaphragme (3). (B) Affiche l'ouverture de l'appendice auriculaire droit (1). S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 4 : Approvisionnement en cœur. (A) Photographie montrant l'utilisation de forceps incurvés pour séparer l'aorte (flèche) et l'artère pulmonaire. (B) Photographie montrant la dissection cardiaque et l'approvisionnement. Le cœur est tenu par l'aorte à l'aide de forceps. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le protocole présenté ici introduit un modèle simple, pratique et polyvalent de DCD cardiaque, offrant la possibilité d'évaluer la récupération fonctionnelle cardiaque, les dommages de tissu et l'utilisation des agents cardioprotecteurs de poteau-conditionnement pour améliorer le rétablissement du donneur cœurs autrement jetés pour la transplantation. Les systèmes de perfusion cardiaque ex vivo (EVHP) ont été optimisés pour fournir une plate-forme pour évaluer la fonction cardiaque et offrir une occasion unique de fournir et de tester des solutions modifiées complétées par des agents pharmacologiques post-conditionnement pour préserver et réparer les cœurs DCD chez les petits15 et grands animaux16,17 modèles de DCD cardiaque. Néanmoins, les protocoles sont souvent insuffisamment détaillés et pas toujours cliniquement pertinents, ce qui rend la traduction clinique difficile.

Dans le domaine des modèles DCD, les modèles DCD ex vivo, comme celui décrit par Sanz18, manquent d'une phase agonale. En induisant un arrêt cardiaque en arrêtant la ventilation mécanique, le système nerveux sympathique est suractivé, conduisant à une «tempête de catécholamine»19. Cette augmentation des catécholamines modifie les caractéristiques des organes donneurs, et a été liée à un état fonctionnel réduit des organes dActad expérimentaux19. En outre, le déclin progressif de la fonction avant asystole mène à la distension ventriculaire droite et aux dommages conséquents. Dans notre protocole, nous avons induit la mort circulatoire utilisant un modèle d'asphyxie médicalement pertinent, qui maintient ces réponses.

Deux modèles principaux de DCD cardiaque in vivo sont décrits dans la littérature : coffre ouvert15 et coffre fermé20 modèles. La physiologie cardiaque est altérée par l'approche de coffre ouvert en réduisant l'interaction mécanique de poumon/coeur et la précharge. En outre, dans les procédures thoraciques ouvertes, la perte de chaleur du corps est accélérée, affectant davantage les résultats fonctionnels21. Par conséquent, il est préférable de maintenir une approche thoracique fermée empêchant la perte de chaleur. Un autre raffinement est de minimiser la variabilité du temps à la mort circulatoire. Kearns et coll. ont signalé que le temps de la mort (temps à la pression artérielle non-pulsatile ou moyenne inférieure à 30 mmHg) était entre 3 à 11 min. Dans les 10 et 20 min WIT, 40% et 60% des coeurs n'ont pas récupéré la fonction, respectivement, sur un appareil cardiaque de travail ex vivo, rendant l'interprétation de données plus difficile15. Une alternative pour réduire le temps de mort circulatoire est d'utiliser des agents paralytiques20; néanmoins, certaines preuves indiquent des effets cardiaques directs du vecuronium, en raison de ses effets sur l'innervation sympathique et parasympathique22. Pour augmenter la reproductibilité, nous avons choisi pour le clampage trachéal, combiné avec une surveillance précise de la pression artérielle, permettant un temps agonal plus homogène (lt;5 min). On sait que les dommages aux organes commencent avant le moment de la mort circulatoire; avec quelques auteurs considérant une tension artérielle systolique de coupure au-dessous de 50 mmHg comme début de WIT6fonctionnel , expliquant la réticence à transplanter des organes après une forme de longue période retirer des mesures de maintien de la vie jusqu'à la réperfusion. Dans ce protocole, la définition WIT utilisée suit la norme expérimentale actuelle15, néanmoins, d'autres études sont nécessaires pour clarifier l'ensemble exact des paramètres hémodynamiques qui marquent l'induction de dommages aux organes afin d'améliorer WIT d'information sur la pratique clinique.

L'infusion de solution cardioplégique à pression physiologique constante et la température offre une occasion unique d'initier le conditionnement cardiaque et la protection des tissus avec tout agent pharmacologique ou par d'autres moyens. Les améliorations techniques comprennent la serrage de l'aorte thoracique, la limitation de la perfusion au cœur et ainsi la réduction de la quantité de solution nécessaire pour chaque essai. Une fois que le cœur est sur le système EVHP, l'évaluation fonctionnelle normalisée est nécessaire. Il a été démontré que l'utilisation d'un système EVHP a le potentiel d'améliorer la réanimation de cœurs précédemment considérés comme non transplantables23,24. Fait intéressant, le système EVHP cliniquement disponible évalue la viabilité cardiaque seulement en utilisant des mesures de lactate en série8,23. Les mesures de lactate ne sont pas liées à la performance cardiaque des coeurs de DCD24,25,ainsi des mesures supplémentaires pour évaluer la transplantation sont nécessaires. Cette configuration expérimentale permet une évaluation fonctionnelle complète, y compris les pressions générées et les mesures de la contractilité myocardique, y compris le dP/dT et le dP/dT, permettant une évaluation plus approfondie de la fonction cardiaque avant la greffe finale. décision est prise. En outre, les mesures de la troponine cardiaque, un marqueur des dommages myocardiques directement corrélés à la taille d'infarctus ischémique26,et la cinétique de dégagement sont liées à l'ampleur de l'ischémie cardiaque dans un système d'ischémie/reperfusion de Langendorff. En particulier, avec de longues périodes ischémiques (60 min), les niveaux de troponine sont maintenus après 1 h de réperfusion, tandis que la LDH et la kinase créatinine diminuent significativement, et ne sont pas liées à l'étendue des dommages cardiaques27,28, l'utilisation des mesures sérielles de troponine assurent une évaluation complète de la viabilité d'organe avant la greffe. Une variable confondante majeure dans l'évaluation fonctionnelle cardiaque est la fréquence cardiaque. La fréquence cardiaque spontanée est inversement liée à la longueur de l'ischémie29, et la fréquence cardiaque est directement en corrélation avec le dP/dt dans les cœurs de rat isolés30 et dans les modèles animaux31. Fait intéressant, dans les travaux récemment publiés sur les modèles de rongeurs de cœurs DCD et de conditionnement EVHP, le rythme n'a pas été utilisé et les taux cardiaques étaient variables et enregistrés dans leurs protocoles15,18,20. Pour maintenir la fréquence cardiaque physiologique, le rythme a été employé une fois que le coeur avait récupéré la contraction rythmique. La fréquence choisie de 300 bpm est similaire à celle des rats sains et non stressés32.

Les limites de ce protocole comprennent l'utilisation d'anesthésique volatil pour l'induction. Ces agents ont été montrés pour conférer le préconditionnement ischémique33. Néanmoins, le court temps de l'utilisation anesthésique inhalée n'a eu aucun effet observable dans ce protocole et le dysfonctionnement myocardique progressif a été toujours noté avec l'augmentation de WIT. L'utilisation de la cardioplégie normère peut également être considérée comme une limitation. L'utilisation de la cardioplégie normère permet une traduction optimale des conditions in vitro utilisées pour le développement d'agents de conditionnement pharmacologique, puisque les cellules sont généralement maintenues à 37 oC. Néanmoins, dans cette configuration la température cardioplégie peut être facilement réglée selon les exigences de l'enquêteur. D'autre part, l'utilisation d'une préparation Langendorff par rapport à une préparation cardiaque de travail pour le reconditionnement pourrait également être considérée comme une limitation. La préparation de coeur de travail permet l'enregistrement continu d'une boucle de pression/volume12,15,avec pré et après charge commandés, permettant l'évaluation fonctionnelle complète. Le principal avantage d'une préparation Langendorff est qu'elle maintient une pression aortique constante et perfusion, en particulier lors de la reperfusion initiale, lorsque la pression générée est minime. En outre, la configuration d'évaluation est plus simple pour le cœur Langendorff par rapport à une préparation cardiaque de travail. Néanmoins, cette configuration peut être convertie en une préparation cardiaque de travail si nécessaire. Alternativement, la réanimation cardiaque peut être effectuée in situ à l'aide de perfusion régionale normère, avec la performance cardiaque étant mesurée directement par l'utilisation d'un cathéterMillar 34, permettant l'hémodynamique complète et myocardique fonctionnelle avant l'acquisition d'organes. Chez l'homme, les stratégies de reconditionnement in situ et ex vivo ont été décrites6, de ce fait, le développement des deux modèles permet des comparaisons expérimentales qui peuvent se traduire par l'optimisation de la pratique clinique. Enfin, la petite taille et la fréquence cardiaque élevée de ce modèle animal peuvent être considérées comme une limitation en raison des difficultés techniques potentielles observées lors de l'exécution de ces expériences, et des inévitables différences physiologiques entre le rat et le cœur humain. Si l'évaluation EVHP est déjà normalisée, un chercheur peut être familiarisé avec cette technique en effectuant aussi peu que 3 expériences. D'autre part, l'utilisation de ce modèle de petit animal permet un dépistage pratique à un coût raisonnable, en réservant des modèles animaux plus grands et plus coûteux tels que le modèle porcin, à des thérapies à fort potentiel de traduction humaine.

En conclusion, le protocole décrit ici tient compte des meilleures pratiques émanant de plusieurs groupes qui font des recherches sur les cœurs DCD. Ce protocole accorde le plein contrôle de WIT, permettant une évaluation structurale et fonctionnelle complète des stratégies de traitement de conditionnement cardioprotective chez les rats. Ce protocole peut être mis à niveau et transféré à de grands modèles animaux, permettant de traduire les résultats de la recherche à la réalité clinique et, en fin de compte, permettant le développement de nouvelles thérapies augmentant la qualité et la disponibilité des organes de sauvetage dont tant Patients.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne signalent aucun intérêt exclusif ou commercial dans un produit mentionné ou un concept discuté dans cet article.

Acknowledgments

Une partie de ce travail a été soutenue par une généreuse contribution de la Fondation Marcel et Rolande Gosselin et de la Fondation M. Stefane Foumy. Nicolas Noiseux est chercheur au FRQ-S.

Les auteurs remercient Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi et Catherine Scalabrini pour leur soutien dans la collecte de données.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag Baxter Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter Jelco 4098 To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Milipore-Sigma T8877 Vital coloration
22 G 1" I.V catheter BD 383532 I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr Skalar 50-3147 Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" Skalar 22-9027 Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp ADinstruments FE221 Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride Milipore-Sigma C1016 CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose Milipore-Sigma G8270 D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer ADinstruments MLAC06 Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock) ADinstruments MLT0670 Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS Gibco 14190-144 Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" Skalar 66-2740 Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10% Milipore-Sigma HT501128 Fixative solution
Heating Pad Sunbean 756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL Sandoz For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% Fisher scientific A144-500 Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine Bimeda Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart ADinstruments Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon Radnoti 170404 In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution AstraZeneca Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS ACP Chemicals M-0460 MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor Radnoti 159905 Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker Biotronik Reliaty Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter Fisher scientific AE150
Physiological monitor Kent Scientific Physiosuite For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A Baxter Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride Milipore-Sigma P4504 KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml Hospira Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph ADinstruments Electronic polygraph
Silk 2-0 Ethicon A305H Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0 Ethicon A302H Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation Hallowell EMC 000A2770 Small animal ventilator
Sodium bicarbonate Milipore-Sigma S5761 NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride Milipore-Sigma S7653 NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets ACP chemicals S3700 Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic Milipore-Sigma S0751 NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" Skalar 22-1240 Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades Thomas scientific 6727C18 Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" CardinalHealth 8881511235 For heparin injection
Veterinary General Surgery Set Skalar 98-1275 Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set Skalar 98-1311 Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system Radnoti 120101BEZ Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine Bayer Sedative. 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gass, A. L., et al. Cardiac Transplantation in the New Era. Cardiology in Review. 23 (4), 182-188 (2015).
  2. von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31 (2), 141-152 (2017).
  3. Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53 (8), 831-837 (2006).
  4. Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23 (1), 136-141 (2018).
  5. Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175 (8), S1 (2006).
  6. Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 75-81 (2018).
  7. Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 67-74 (2018).
  8. Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22 (3), 189-197 (2017).
  9. McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31 (11), 631-634 (2005).
  10. Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
  11. Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
  12. Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42 (2), 25 (2017).
  13. Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28 (6), 634-642 (2015).
  14. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). , Academic Press. 77-108 (2016).
  15. Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101 (8), e231-e239 (2017).
  16. Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105 (6), 1763-1770 (2018).
  17. Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14 (8), 1744-1752 (2014).
  18. Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. , (2018).
  19. Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36 (5), 919-926 (2009).
  20. Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64 (2), 225-231 (2018).
  21. Priebe, H. J. The acute open-chest model. British Journal Of Anaesthesia. 60 (8 Suppl 1), 38-41 (1988).
  22. Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19 (6), 1000-1008 (1992).
  23. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385 (9987), 2585-2591 (2015).
  24. Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (12), 1443-1452 (2016).
  25. White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93 (10), 893-901 (2015).
  26. Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (4), 847-854 (2011).
  27. Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (2), 793-803 (1995).
  28. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).
  29. Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7 (8), e43642 (2012).
  30. Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228 (2), 360-364 (1975).
  31. Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 98-105 (2012).
  32. Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (2), 175-184 (2011).
  33. Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine. Current Pharmaceutical Design. 20 (36), 5690-5695 (2014).
  34. Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).

Tags

Médecine Numéro 150 Transplantation cardiaque don après décès circulatoire conditionnement ischémique ischémie-reperfusion perfusion ex vivo Langendorff évaluation fonctionnelle.
Modèle préclinique du don cardiaque après la mort circulatoire
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M.,… More

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M., Ribeiro, R. V. P., Badiwala, M. V., Der Sarkissian, S., Noiseux, N. Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death. J. Vis. Exp. (150), e59789, doi:10.3791/59789 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter