Summary
Detta protokoll visar en enkel och flexibel metod för utvärdering av nya konditioneringsagenter eller strategier för att öka möjligheten för hjärt donation efter cirkulatorisk död.
Abstract
Efterfrågan på hjärttransplantation ökar; ändå är tillgängligheten av organ begränsad på grund av en brist på lämpliga givare. Organ donation efter cirkulatorisk död (DCD) är en lösning för att hantera denna begränsade tillgänglighet, men på grund av en period av långvarig varm ischemi och risken för vävnadsskada, dess rutinmässig användning i hjärttransplantation ses sällan. I detta manuskript ger vi ett detaljerat protokoll nära imitera nuvarande kliniska praxis i samband med DCD med kontinuerlig övervakning av hjärtats funktion, vilket möjliggör utvärdering av nya kardioprotektiva strategier och insatser för att minska ischemia-reperfusion skada.
I denna modell, DCD-protokollet initieras i sövda Lewis råttor genom att stoppa ventilation för att inducera cirkulatorisk död. När systoliskt blodtryck sjunker under 30 mmHg, den varma ischemisk tid initieras. Efter en förinställt varm ischemisk period, hjärtan spolas med en normothermic cardioplegic lösning, upphandlas, och monteras på ett Langendorff ex vivo hjärta perfusion system. Efter 10 min av initial reperfusion och stabilisering, hjärt rekonditionering utvärderas kontinuerligt för 60 min med hjälp av intraventrikulär tryckövervakning. En hjärtskada bedöms genom att mäta hjärtats Troponin T och infarktstorleken kvantifieras genom histologisk färgning. Den varma ischemiska tiden kan moduleras och skräddarsys för att utveckla önskad mängd strukturella och funktionella skador. Detta enkla protokoll möjliggör utvärdering av olika kardioprotektiva konditioneringsstrategier som infördes vid tidpunkten för cardioplegia, initial reperfusion och/eller under ex vivo perfusion. Resultaten från detta protokoll kan återges i stora modeller, vilket underlättar klinisk översättning.
Introduction
Fast organtransplantation i allmänhet och hjärttransplantation, i synnerhet, är på uppgång i hela världen1,2. Den standarda metoden av organ anskaffning är donation efter hjärndöd (DBD). Med tanke på de strikta inklusionskriterier av DBD, är mindre än 40% av de erbjudna hjärtan accepteras3, vilket begränsar erbjudandet i ansiktet av ökande efterfrågan och utvidga orgel väntelista. För att lösa detta problem, användning av organ som donerats efter cirkulatorisk död (DCD) anses vara en potentiell lösning4.
I DCD donatorer, dock, en Agonal fas efter indragning av vård och en period av oskyddade varm ischemi innan återupplivning är oundvikliga5. Den potentiella organskada efter cirkulatorisk död kan leda till organdysfunktion, förklarar oviljan att rutinmässigt anta DCD hjärttransplantationer. Det rapporteras att endast 4 centra använder DCD hjärtan kliniskt, med stränga kriterier som innehåller mycket kort varm ischa gånger och unga givare utan kroniska patologier6,7. Av etiska och juridiska skäl kan begränsade eller inga kardioprotektiva ingrepp tillämpas i donatorer före cirkulatorisk död5,8,9. Således, någon lindring för att lindra ischemia-reperfusion (IR) skadan är begränsad till hjärtskyddande terapier initieras under tidig reperfusion med cardioplegic lösningar, och inte tillåter för korrekt funktionell bedömning. Ex vivo Heart perfusion (evhp) och rekonditionering av DCD Heart med dedikerade plattformar har föreslagits som en alternativ lösning och studeras av olika forskare10,11,12,13 . EVHP erbjuder en unik möjlighet att leverera efterkonditioneringsagenter till DCD Hearts för att förbättra funktionell återhämtning. För en effektiv klinisk översättning återstår dock många tekniska och praktiska frågor att ta itu med, och detta förvärras ytterligare av bristande samförstånd om en rad olika per fusions-och funktions kriterier för att bestämma transplantabilitet 6. 8.
Häri rapporterar vi utvecklingen av en reproducerbar preklinisk små djur DCD protokoll kombinerat med ett ex vivo hjärta perfusion system som kan användas för att undersöka organ efter konditioneringen initieras vid tidpunkten för upphandlingen, under initial reperfusion, och /eller under EVHP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djuromsorg och experimentella protokoll som är utformade för handledning för vård och användning av försöksdjur och godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Centre Hospitalier de L'université de Montréal Research Center.
1. förberedande förberedelser
- Sätt på vattenbadet för att värma upp cardioplegia Delivery System (figur 1a) och langendorff ex vivo per fusions system (figur 1b). Ställ in vattentemperaturen till 38,5 ° c för en lösnings temperatur på 37 ° c. Installations fotografier kan ses i tilläggs figur 1a, B.
- Bered 1 L kardioplegic lösning. Tillsätt 1 mL 2% lidokain-hydroklorid och 10 mL 2 mM KCl (slutlig koncentration 20 mM) till 1 L plasma-Lyte A (140 mM na, 5 mM K, 1,5 mM mg, 98 mM cl, 27 mM acetat, 23 mM glukonat). Korrigera pH till 7,4 med 6 N HCl.
Försiktighet: Denna modell är mycket känslig för pH. Fel pH-korrigering (utanför det fysiologiska intervallet 7,3-7,4) eller pH-instabila lösningar kan äventyra experimentet eller tillhandahålla opålitliga data. - Förbered 4 L Krebs lösning (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2Po4, 1,25 mm CaCl2, 1 mm mgcl2∙ 6H2O, 5,5 mm D-glukos, 25 mm NaHCO3). Substrat massor per 1 L lösning bör vara följande: 6,1 g av NaCl, 0,3355 g KCl, 0,2035 g av MgCl2∙ 6H2O, 0,192 g NaH2Po4, 0,1387 g av CaCl2, 0,99 g D-glukos, 2,1 g NaHCO3 , slutlig volym av 1 L i ultrarent avjoniserat vatten. Lägg till NaHCO 3 senast för att undvika nederbörd. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm filter och förvara över natten. Korrigera pH till 7,4 När lösningen är vid 37 ° c och bubbla med 5% CO2/95% O2.
- Fyll Langendorff krets med Krebs lösning och starta system pumpen. Se till att inga bubblor är kvar inuti slangen. Justera den peristaltiska pumpens varvtal till 80 rpm (motsvarande 1 L/min). Med hjälp av två sätt stoppa kuk, justera flödet för att bibehålla en långsam dropp genom aorta kanyl tills hjärtat är fäst (figur 1b). Förvara ett prov av Krebs lösning (15 mL) i en 50 mL koniskt rör på is för hjärt transport.
- Fyll i cardioplegia Delivery system med cardioplegic-lösningen. När bubblorna tas bort, växla kretsen till saltlösning med hjälp av en 3-vägs stopp kuk (figur 1a). Justera dropp hastigheten. Saltlösning måste sakta droppas från spetsen av katetern för att säkerställa att ingen kardioplegic lösning injiceras före djurets död.
2. djur beredning
- Med hjälp av en inhalations kammare, inducera anestesi med 3% isofluran. När djuret inte svarar, utför en intraperitoneal injektion av ketamin (75 mg/kg) och xylazin (5 mg/kg) eller liknande lämpligt bedövningsmedel, efter lokala föreskrifter, att bibehålla anestesi för resten av förfarandet. Se till djupet av anestesi av ingen reaktion på tå nypa och palpebrala reflex.
- Intubera djuret med hjälp av en 14 G, 2-tums I.V. kateter. Starta ventilation vid 50 andetag per minut, med luftvägstryck begränsat till 20 cmH2O.
- Placera djuret på en värmedyna inställd på "medium" och täck med en absorberande pad för att bibehålla kroppstemperaturen. Sätt en ändtarmen temperatur sond och bifoga en depotplåster pulsoximetergivare till en av fötterna. Upprätthålla rektaltemperatur vid 37 ° c under hela proceduren.
-
Vaskulär tillgång
- Gör en 3 till 4 cm mittlinjen hud snitt i nacken med hjälp av sax. Använda trubbig spets böjda sax, trubbig dissekera den subkutana vävnaden och exponera rätt sternohyoid muskler. Med hjälp av icke traumatisk tång, flytta muskeln i sidled tills rätt halspulsådern (pulserande), halsvenen (icke-pulserande) och vagusnerven (vit) identifieras visuellt (kompletterande figur 2A). Noggrant separera vagusnerven från halspulsådern med trubbig spets böjd sax.
- Injicera heparin (2 000 IU/kg) via den högra halsvenen. Applicera tryck på injektionsstället efter nålretraktion för att undvika blodläckage.
- Med böjda tång, passera två 5-0 silke suturer runt halspulsådern. Fast bifoga en distala suturen att ockludera halspulsådern på den överlägsna aspekten av den exponerade artären. Håll den proximala suturen obundet. Dra av den proximala suturen kommer att användas för blödning kontroll i nästa steg (kompletterande figur 2b). Avståndet mellan suturer bör vara ca 2 cm.
- Med hjälp av en stereomikroskop för bättre visualisering, försiktigt göra en 1 mm snitt med mikrokirurgi sax över den främre väggen av halspulsådern. Sätt en 22 G, 1-tums stängd I.V. kateter mot aortabågen. Katetern är ansluten till en 2-vägs stopp kuk, möjliggör anslutning till en tryckgivare för ständig övervakning, med möjlighet att injicera saltlösning eller cardioplegia via cardioplegia leveranssystem (figur 1a).
3. initiering av hjärt donation efter cirkulatorisk död (DCD) protokoll
Anmärkning: En fullständig protokoll tidslinje kan ses i figur 2.
- Re-åsnor anestesidjupet genom att utföra en tå nypa och utvärdera palpebrala reflex. Om reaktionen observeras, utför en intraperitoneal injektion av ketamin (37,5 mg/kg) och xylazin (2,5 mg/kg). Omvärdera efter 5 minuter. Om inget svar observeras fortsätter proceduren. Tracheal klämma bör endast utföras på tillräckligtsövda djur.
- Stäng av ventilatorn och extubera djuret. Med mygg tång, klämma luftstrupen. Detta ögonblick anses vara början på den Agonala fasen. Börja räkna den funktionella varma ischemisk tid (WIT) när den högsta systoliska blodtrycket sjunker under 30 mmHg, eller om asystoli eller ventrikelflimmer visas, vad som kommer först (figur 3).
Anmärkning: Skada omfattning bör stå i proportion till WIT. Experiment behövs för att optimera WIT tid enligt bedövningsmedel används, djur stam, kön och vikt väljs. I kontrolldjur, omedelbart efter halspulsådern vaskulär tillgång är säkrad, cardioplegia injiceras och hjärtat upphandlas som beskrivs i nästa steg (figur 2). Starten av perfusion med cardioplegia är ansedd som avsluta av kvickhet. - I slutet av WIT, utföra en medial sternotomy. Håll bröstkorgen öppen med hjälp av en Alm upprullningsdon. Använd sax, öppna sämre Vena Cava och båda Atria för att undvika myokardiell utspänd eller cardioplegia återcirkulation (kompletterande figur 3). Klämma aorta ovanför membranet. Genom den tidigare kateterized halspulsådern, ingjuta den cardioplegic lösningen vid ett konstant tryck på 60 mmHg för 5 min med hjälp av cardioplegia leveranssystem. Infusionstryck kan ändras genom att ändra höjden på vatten kolumnen.
- I slutet av cardioplegic infusion, dissekera den stigande proximala aorta från lungartären med böjda pincett (kompletterande figur 4a). Skär aorta distala till vänster subclavia artär. Säkerställa en aorta längd på minst 0,5 cm för kanylering för Langendorff apparaten.
- Håll hjärtat från aorta, slutföra kardiektomi genom att separera hjärtat från pulmonell vener och andra bröstkorg strukturer (kompletterande figur 4b). Snabbt, sänk hjärtat i att Ice-Cold Krebs lösning för snabb transport till ex vivo systemet. Håll dissektion och transporttider så korta som möjligt (5 min).
4. ex vivo hjärt perfusion system (EVHP) och hjärt funktionell bedömning
- Öppna aorta lumen med hjälp av pinpett. Deair aorta genom att fylla lumen med droppande Krebs lösning för att undvika att tvinga bubblor i till kranskärlen. Sänk kanylen i aorta, noga med att inte passera aorta roten eller skada aortaklaffen broschyrer. Fixera installationen med en liten klämma.
- Med hjälp av 2-vägs stopcock, öka flödet för att söka efter eventuella läckor i aorta. Om ingen upptäcks, tätt fixa aorta till kanyl med en 2-0 Silk sutur. Öppna flödet till kanylen helt. Upprätthålla aorta trycket vid ett fysiologiskt tryck på 60-70 mmHg (justerat genom att ändra höjden på systemet). Vid denna tidpunkt initieras den initiala reperfusion-och stabiliserings tiden. Aorta trycket kan ändras enligt prövarens experimentella plan.
- Rotera hjärtat så att basen av hjärtat (Atria) är vänd mot trycksensorn. Vidga Vänsterkammar förmaksöppningen genom dissekera pulmonell vener. Sätt i latex ballong ansluten till en trycksensor. Se till att ballongen är helt placerad inuti ventrikeln genom visuell inspektion. Fyll långsamt ballongen med saltlösning tills slutet diastoliskt tryck (EDP) är inställt på 15 mmHg. Justera efter behov för att hålla EdP konstant (förutbestämd fysiologisk EDP). EDP kan justeras enligt försöks målen för varje prövare.
- Sätt i pacing elektroden i främre ansiktet av hjärtat (höger kammare utflöde tarmkanalen). Undvik att punktera koronar kärlen. När spontan svävning observeras, initiera pacing på 300 slag per minut. erforderlig spänning kan variera mellan experiment och råtta stammar.
- Efter 10 min av stabilisering, initiera kontinuerlig intraventrikulär tryck mätning inspelning. Detta ögonblick anses vara början av rekonditioneringen och bedömningsfasen (tid 0) som kommer att pågå i 1 h (figur 2). Rekonditioneringen kan förlängas, men en tidsberoende minskning av kontraktilitet förväntas i alla hjärtan.
- I början av rekonditioneringen, samla hjärt utflöde släppa från hjärt venerna för 5 min för baseline koronar flöde bedömning och biokemiska analyser. För Troponin T upprepa var 15 min (gånger 0, 15, 30, 45 och 60 min). För andra analyser behövs individualisering av insamlingstiden (Figur 2).
5. på erfarenhet
- Ta bort hjärtat från Langendorff apparaten.
- Med hjälp av en rak hög kolstål blad (mikrotomblad eller liknande), ta bort basen av hjärtat (inklusive aorta och Pulmonell artär).
- Med den högra ventrikeln vänd nedåt, skära tvärgående ventrikulära diabilder av 1-2 mm tjocklek. I en representativ sektion (normalt den tredje) punktskatter den högra ventrikeln och Snap frysa vänster kammare. Detta prov kan användas för biokemiska analyser.
- Sänk de återstående avsnitten i till nyberedd 5% 2, 3, 5-trifenyl-tetrazoliumklorid i kommersiell fosfatbuffert saltlösning pH 7,4 för 10 min vid 37 ° c. Livskraftiga vävnader är färgade röda tegel.
- Tvätta två gånger med fosfatbuffert saltlösning pH 7,4 och fix med 10% formalin vid 4 ° c över natten. Tvätta två gånger med fosfatbuffrad saltlösning pH 7,4 och hålla varje skiva nedsänkt.
- Dra upp överflödig vätska och vikt varje bild. Ta digitala färgbilder av båda sidor. Använd planimetriska analyser för att beräkna procent-infarct storlek och korrekt för slice och total kammar vikt. Coloration bleknar med tiden. Foton måste tas så snart som möjligt.
6. data analyser
- Spara alla tryckdata i en ny fil per djur.
- För tryck analyser, välj minst 200 tryck cykler per tidpunkt. Analyser kan utföras off-line (efter avslutad experimentet) med hjälp av dedikerad programvara (dvs., LabChart). Vanliga kardiovaskulära parametrar som finns tillgängliga är: maximalt genererat tryck, slutet diastoliskt tryck, + dP/DT (brantaste lutning under upstroke av tryck kurvan, en indikator på ventrikulär kontraktila förmåga),-dP/DT (brantaste lutning under nedåt av tryck kurvan, en indikator på ventrikulär avslappning kapacitet) bland annat.
Obs: för Troponin-analyser förväntas en ökning av troponin release vid reperfusion. Efter 1 h av reperfusion i EVHP-systemet, Troponin nivåer kan sjunka till baslinjen, betonar behovet av noggrann timing i insamling och hantering av dessa prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter extubation sjunker blodtrycket snabbt i ett förutsägbart mönster (figur 3). Förväntad tid till döden är mindre än 5 min.
Figur 4 visar en genomsnittlig tryck/tids kurva i början av rekonditioneringen efter 0, 10 och 15 min av kvickhet. Kontraktila funktion kommer att förbättras med tiden. Användningen av korta perioder av kvickhet kommer att möjliggöra kontraktilitet att återgå till det normala, och morfologiska skador kommer inte att upptäckas (figur 5 och figur 6).
Proof-of-Concept användning av en Conditioning agent läggas till med cardioplegia och i stabiliseringsfasen visar att skadorna som genereras av 15 min WIT i denna modell är mottagliga för modulering av kardioprotektiva medel (figur 4, figur 5 och Figur 6).
Bild 1: nödvändiga utrustnings scheman. Minimikrav för a)cardioplegia Delivery System och a (B) langendorff ex vivo Heart perfusion system. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: protokollets tidslinje. Tidslinje från tidpunkten för extubation till slutet av protokollet. I kontrolldjur, cardioplegia initieras utan DCD eller varm ischemisk tid. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Intrarotid blodtryck/tid Plot. Typisk utveckling av intracarotid blodtryck efter extubation. Varm ischemi tid stjärnor när den högsta systoliska blodtrycket sjunker under 30 mmHg, eller om asystoli eller ventrikelflimmer visas, vad som kommer först. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Genomsnittligt Beat-to-beat ventrikulär tryck tids kurva för ex vivo. Bild härledd från analyser av data som tagits efter 10 min stabilisering och perfusion (tid 0 i figur 2) med eller utan användning av ett experimentellt farmakologiskt skyddande vårdande medel. Ischemisk tid hänvisar till varma ischemiska gånger (WIT). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: återvinning och funktionella analyser ex vivo. A) kontinuerlig ventrikulär tryck tids kurva efter 10 minuters stabilisering och perfusion med eller utan användning av ett experimentellt farmakologiskt skyddande vårdande medel. Pilar visar artefakter på grund av manuell modifiering av EDP. (B) högsta (+ DP/DT) och minsta (-DP/DT) tryckförändring i LV kontra tid Plot härrör från (a) visar en tidsberoende förbättring i kontraktilitet utan behandling (grön linje). Kort kvickhet (röd linje) eller behandlade (gula) hjärtan visar ett mönster som liknar kontrollgruppen (blå linje). Data punkter är medelvärdet för minst 200 individuella beats. Staplar visar standardfelet för medelvärdet för varje datapunkt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:2, 3, 5-trifenyl-tetrazoliumkloridfärgning i slutet av experimenten. Infarct området observerats efter olika varma ischemiska gånger (kvickhet) och användning av en farmakologisk kardioskyddande Conditioning agent. Tegelröd: livskraftig vävnad. Ljusgul: icke-viabla vävnad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: bild förinstallationsprogrammet. (A) fotografi som visar inställningarna för cardioplegia Delivery System. Numrerad utrustning motsvarar: cardioplegia container (1), bubbelfälla (2), tryckgivare och kateter (3), Peristaltisk pump (4), polygraf ansluten till trycksensorn (5) och liten djur ventilator (6). (B) fotografi som visar inställningarna för langendorff ex vivo hjärt per fusions system. Numrerad utrustning motsvarar: parfymen behållare (1), konditioneringsmedlet behållare (2) och hjärta kammaren (3). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: hals dissektion. (A) fotografi som visar den exponerade halsvenen (pil) före heparin injektion. (B) visar dissekerade halspulsådern (pil) med suturer placeras för blödning kontroll. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: öppnande av Atria för att förhindra återcirkulation. (A) fotografi som visar öppnandet av det vänstra förmaket bihang (1). På bakgrunden är aorta (2) fastklämd ovanför membranet (3). (B) visar öppnandet av det högra förmaksbihang (1). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 4: hjärt upphandling. (A) fotografering som visar användningen av böjda tång för att separera aorta (pil) och lungartären. (B) fotografi som visar hjärt dissektion och upphandling. Hjärtat är håll vid aorta med pinps. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här introducerar en enkel, bekväm och mångsidig modell av hjärt DCD, erbjuder möjlighet att bedöma hjärtats funktionella återhämtning, vävnadsskada och användning av efter konditioneringen hjärtskyddande agenter för att förbättra återhämtningen av givare hjärtan kasseras annars för transplantation. Ex vivo Heart perfusion Systems (EVHP) system har optimerats för att tillhandahålla en plattform för utvärdering av hjärtfunktionen och erbjuder en unik möjlighet att leverera och testa modifierade lösningar kompletterade med efterkonditionerade farmakologiska medel för att bevara och reparera DCD hjärtan i små15 och stora djur16,17 modeller av hjärt DCD. Ändå är protokollen ofta otillräckligt detaljerade och inte alltid kliniskt relevanta, vilket försvårar den kliniska översättningen.
I sfären av DCD-modeller, ex vivo DCD modeller, som den som beskrivs av Sanz18, saknar en Agonal fas. Genom att inducera hjärtstillestånd genom att stoppa mekanisk ventilation, är det sympatiska nervsystemet överaktiverat, vilket leder till en "katekolamin Storm"19. Denna ökning av katekolaminer ändrar egenskaperna hos givar organen, och har kopplats till en reducerad funktionell status av experimentella DCD organ19. Dessutom, den progressiva nedgången i funktion före asystoli leder till höger ventrikulär utspänd och åtföljande skada. I vårt protokoll har vi inducerat cirkulatorisk död med hjälp av en kliniskt relevant kvävning modell, som upprätthåller dessa svar.
Två huvudsakliga in vivo kardiella DCD-modeller beskrivs i litteraturen: öppna bröst15 och slutna bröst20 -modeller. Hjärtfysiologi förändras genom den öppna bröstet tillvägagångssätt genom att minska den mekaniska lung/hjärt interaktion och preload. Dessutom, i öppna bröstet förfaranden, kroppen värmeförlust accelereras, ytterligare påverkar funktionella resultat21. Därför är det bättre att upprätthålla en sluten Kista metod som förhindrar värmeförlust. En annan förfining är att minimera variationen av tid till cirkulatorisk död. Kearns et al. rapporterade att tiden till döden (tid till icke-pulsatile eller medel blodtryck mindre än 30 mmHg) var mellan 3 till 11 min. I 10 och 20 min WIT, 40% och 60% av hjärtan inte återhämta funktion, respektive, på en ex vivo fungerande hjärt apparat, vilket gör data tolkning svårare15. Ett alternativ för att minska tiden till cirkulatorisk död är att använda paralytiska agenter20; ändå, vissa belägg pekar mot direkta hjärteffekter av vecuronium, på grund av dess effekter på sympatiska och parasympatiska innervation22. För att öka reproducerbarheten, valde vi för luftrör fastspänning, kombinerat med en noggrann arteriell tryck monitorization, vilket möjliggör en mer homogen Agonal tid (< 5 min). Det är känt att organskador börjar före tidpunkten för cirkulatorisk död; med vissa författare överväger en cut-off systoliskt blodtryck under 50 mmHg som början av funktionella WIT6, förklara motvilja mot transplantationsorgan efter en lång period form dra tillbaka livsuppehållande åtgärder tills reperfusion. I detta protokoll, den WIT definition som används följer den nuvarande experimentella standard15, ändå, ytterligare studier behövs för att klargöra den exakta uppsättning hemodynamiska parametrar som markerar induktion av organskador för att förbättra wit vilket ger bättre information för klinisk praxis.
Infusion av cardioplegic lösning vid konstant fysiologiskt tryck och temperatur ger en unik möjlighet att initiera hjärta konditionering och vävnad skydd med någon farmakologisk agent eller på annat sätt. Tekniska förbättringar inkluderar fastspänning av bröstkorg aorta, begränsa perfusion till hjärtat och därmed minska mängden lösning som behövs för varje uppsats. När hjärtat är på EVHP systemet, standardiserad funktionell utvärdering är nödvändig. Det har visat sig att användningen av ett evhp-system har potential att förbättra återupplivning av hjärtan som tidigare ansågs inte transplantations23,24. Intressant nog utvärderar det kliniskt tillgängliga evhp-systemet hjärtats lönsamhet endast genom att använda seriella laktatmätningar8,23. Laktat mätningar är inte relaterade till hjärt prestanda DCD hjärtan24,25, vilket ytterligare mätningar för att utvärdera transplantabilitet är nödvändiga. Denna experimentella inställning möjliggör en fullständig funktionell utvärdering, inklusive genererade tryck och hjärtinfarkt kontraktilitet mätningar inklusive + dP/dT och-dP/dT, vilket möjliggör en mer grundlig utvärdering av hjärtats funktion innan den slutliga transplantationen beslut fattas. Dessutom, mätningar av hjärt Troponin, en markör för hjärtinfarkt skada direkt korrelerad till ischemisk-infarct storlek26, och release kinetik är relaterade till omfattningen av kardiell ischemi i en langendorff ischa/reperfusion system. I synnerhet, med långa ischemiska gånger (60 min), Troponin nivåer upprätthålls efter 1 h reperfusion, medan LDH och kreatinkinas signifikant minska, och att vara icke-relaterade till omfattningen av hjärtskador27,28, alltså användningen av seriella Troponin åtgärder säkerställa en fullständig utvärdering av organviabilitet före transplantation. En stor confounding variabel i hjärt funktionell utvärdering är hjärtfrekvensen. Spontan hjärtfrekvens är omvänt relaterad till längden av ischa29, och hjärtfrekvens direkt korrelerar med + DP/DT i isolerade råtta hjärtan30 och i djurmodeller31. Intressant, i nyligen publicerat arbete på gnagare modeller av DCD hjärtan och evhp konditionering, var pacing inte används och hjärtfrekvens var varierande och registreras i deras protokoll15,18,20. För att bibehålla den fysiologiska hjärtfrekvensen användes pacing när hjärtat hade återhämtat rytmisk kontraktion. Den valda 300 BPM frekvensen liknar de av friska, icke-stressade råttor32.
Begränsningar i detta protokoll inkluderar användning av flyktiga bedövningsmedel för induktion. Dessa agenter har visat sig ge ischemisk förvärmning av33. Ändå, den korta tiden för inhalerad bedövningsmedel användning hade ingen observerbar effekt i detta protokoll och progressiv hjärtdysfunktion noterades fortfarande med ökande kvickhet. Användningen av normothermic cardioplegia kan också ses som en begränsning. Använda normothermic cardioplegia möjliggör optimal översättning från in vitro-villkor som används för utveckling av farmakologiska vårdande medel, eftersom cellerna vanligtvis hålls vid 37 ° c. Ändå, i detta setup cardioplegia temperatur kan lätt regleras enligt kraven i prövaren. Å andra sidan kan användningen av en Langendorff förberedelse kontra en fungerande hjärta förberedelse för rekonditionering också ses som en begränsning. Den funktionsdugliga hjärta förberedelsen möjliggör kontinuerlig inspelning av ett tryck/volym slinga12,15, med kontrollerad pre och afterload, möjliggör fullständig funktionell utvärdering. Den största fördelen med en Langendorff beredning är att det upprätthåller en konstant aorta och perfusionstryck, särskilt under initial reperfusion, när genererade trycket är minimal. Dessutom är utvärderingen enklare för Langendorff hjärta jämfört med en fungerande hjärta beredning. Ändå kan denna inställning omvandlas till en fungerande hjärta förberedelse om det anses nödvändigt. Alternativt kan kardiell Reanimation utföras på plats med hjälp av normothermic regional perfusion, med hjärt prestanda som mäts direkt genom användning av en Millar-kateter34, vilket möjliggör omfattande hemodynamiska och myokardiella funktionella utvärdering före organ anskaffning. Hos människor har både in situ-och ex vivo-rekonditioneringsstrategier beskrivits6, vilket innebär att utvecklingen av båda modellerna möjliggör experimentella jämförelser som kan översättas till optimering av klinisk praxis. Slutligen, den lilla storleken och hög hjärtfrekvens av denna djurmodell kan betraktas som en begränsning på grund av de potentiella tekniska svårigheter som observerats vid utförandet av dessa experiment, och de oundvikliga fysiologiska skillnaderna mellan råtta och mänskliga hjärtan. Om EVHP-utvärderingen redan är standardiserad kan en forskare bekanta sig med denna teknik genom att utföra så lite som 3 experiment. Å andra sidan, användningen av denna lilla djurmodell möjliggör bekväm screening till en rimlig kostnad, reservera större och dyrare djurmodeller såsom svin modell, till terapier med hög mänsklig translationell potential.
Sammanfattningsvis tar det protokoll som beskrivs här hänsyn till de bästa praxis som härrör från flera grupper forska DCD hjärtan. Detta protokoll ger full kontroll över WIT, möjliggör en omfattande strukturell och funktionell utvärdering av kardioprotektiva konditioneringsbehandling strategier hos råttor. Detta protokoll kan skalas upp och överföras till stora djurmodeller, gör det möjligt att översätta forskningsresultat till klinisk verklighet och i slutändan möjliggör utveckling av nya terapier som ökar kvaliteten och tillgången på livräddande organ som behövs mycket av Patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inget äganderättsligt eller kommersiellt intresse för någon produkt som nämns eller begreppet diskuteras i denna artikel.
Acknowledgments
Delar av detta arbete stöddes av ett generöst bidrag från Fondation Marcel et Rolande Gosselin och Fondation Mr Stefane Foumy. Nicolas Noiseux är lärd av FRQ-S.
Författarna vill tacka Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi, och Catherine Scalabrini för deras stöd i datainsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride. 1 L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14 G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22 G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1,000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/mL | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/mL |
References
- Gass, A. L., et al.
- von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31 (2), 141-152 (2017).
- Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53 (8), 831-837 (2006).
- Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23 (1), 136-141 (2018).
- Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175 (8), S1 (2006).
- Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 75-81 (2018).
- Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 67-74 (2018).
- Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22 (3), 189-197 (2017).
- McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31 (11), 631-634 (2005).
- Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
- Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
- Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42 (2), 25 (2017).
- Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28 (6), 634-642 (2015).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). , Academic Press. 77-108 (2016).
- Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101 (8), e231-e239 (2017).
- Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105 (6), 1763-1770 (2018).
- Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14 (8), 1744-1752 (2014).
- Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. , (2018).
- Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36 (5), 919-926 (2009).
- Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64 (2), 225-231 (2018).
- Priebe, H. J.
- Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19 (6), 1000-1008 (1992).
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (12), 1443-1452 (2016).
- White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93 (10), 893-901 (2015).
- Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (4), 847-854 (2011).
- Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (2), 793-803 (1995).
- Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).
- Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7 (8), e43642 (2012).
- Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228 (2), 360-364 (1975).
- Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 98-105 (2012).
- Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (2), 175-184 (2011).
- Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T.
- Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).
