Summary
وصف هنا هو طريقة بسيطة لتنقية منتج الجينات في موتان العقدية. قد تكون هذه التقنية مفيدة في تنقية البروتينات، وخاصة بروتينات الغشاء والبروتينات الكتلية الجزيئية العالية، ويمكن استخدامها مع مختلف الأنواع البكتيرية الأخرى.
Abstract
وينطوي توضيح وظيفة الجين عادة على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات والسلالات البرية التي تعطل فيها جين الفائدة. يتم استعادة فقدان الوظيفة بعد انقطاع الجينات في وقت لاحق عن طريق إضافة خارجية للمنتج من الجين المعطلة. وهذا يساعد على تحديد وظيفة الجين. وتنطوي الطريقة التي سبق وصفها على توليد سلالة موتان العقدية التي تعطلت في الجينات gt. هنا، يتم وصف طريقة لا تتطلب لتنقية المنتج الجيني gtfC من سلالة S. mutans التي تم إنشاؤها حديثا بعد اضطراب الجينات. هو يتضمّن الإضافة من [بولهيستيدين-كدينغ] تسلسل في ال 3′ نهاية من المورثة الفائدة, أيّ يسمح تنقية بسيطة من المورّة منتوج يستعمل محصّلة معدنة تقارب كروماتوغرافيا. لا توجد ردود فعل أنزيمية غير PCR مطلوبة للتعديل الجيني في هذه الطريقة. واستعادة المنتج الجيني عن طريق إضافة خارجية بعد تعطيل الجينات هي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات، والتي يمكن أيضا تكييفها مع الأنواع المختلفة.
Introduction
وعادة ما ينطوي تحليل وظيفة الجين على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات البرية بالسلالات التي تعطل فيها جين الفائدة. وبمجرد إنتاج السلالة التي تعطلت الجينات، فإن الإضافة الخارجية للمنتج الجيني تسمح باستعادة وظيفية.
الطريقة الأكثر شيوعا للحصول على منتجات الجينات النقية اللازمة لتجارب الترميم اللاحقة هي عن طريق أداء التعبير غير المتجانس في الإشريكية القولونية1. ومع ذلك، فإن التعبير عن بروتينات الغشاء أو البروتينات الكتلية العالية غالبا ما يكون من الصعب استخدام هذا النظام1. في هذه الحالات، عادة ما يتم عزل البروتين المستهدف من الخلايا التي تجمع البروتين أصلا من خلال سلسلة معقدة من الخطوات، والتي قد تؤدي إلى فقدان المنتج الجيني. للتغلب على هذه القضايا، تم تطوير إجراء بسيط لتنقية المنتجات الجينية بعد طريقة تعطيل الجينات2،طريقة ربط الحمض النووي المستندة إلى PCR3 (المعينة ثنائي ونفي من خطوتين PCR)، والكهرباء للجينات التحول في موتات العقدية. إضافة علامة polyhistidine (له العلامة) إلى C-terminus من المنتج الجيني يسهل تنقية من قبل الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).
لعزل سلالة التعبير عن علاماته، يتم استبدال الحمض النووي الجينومي الكامل للجين موضع الاهتمام (في هذه السلالة التي تعبر عن الجينات التي تم التعبير عنها) بجين علامة مقاوم للمضادات الحيوية. إجراء لتوليد سلالة له العلامة التعبير عن متطابقة تقريبا لتلك التي لتوليد سلالة الجينات تعطل كما هو موضح سابقا4,5. ولذلك، ينبغي تنفيذ أساليب تعطيل الجينات وعزل المنتجات الجينية كتجارب متسلسلة للتحليل الوظيفي.
في العمل الحالي، يتم إرفاق تسلسل الترميز polyhistidine إلى نهاية 3′ من gtfC (GenBank locus tag SMU_1005) الجينات، ترميز غلوكوزيلترانسفيراز-SI (GTF-SI) في S. mutans6. ثم أجريت دراسات التعبير في الأنواع العقدية. تحقيق التعبير gt fC غير متجانسة من قبل E. القولونية من الصعب، على الأرجح بسبب الكتلة الجزيئية العالية من GTF-SI. هذه السلالة تدعى س. موتانس له-gtfC. رسم تخطيطي يصور تنظيم GTFC وspectinomycin كاسيت الجينات المقاومة(sPCr)7 loci في البرية من نوع S. mutans (S. mutans WT) وتظهر مشتقاته في الشكل 1 وGTF-SI هو بروتين إفرازي الذي يساهم في تطوير biofilm الأسنان المسببة للسرطان6. تحت وجود السكروز، لوحظ biofilm الملتصق على سطح زجاجي أملس في سلالة WT S. mutans ولكن ليس في سلالة S. mutans gtfC-disrupted(S. mutans ΔgtfC)2،5 . يتم استعادة تشكيل Biofilm في S. mutans ΔgtfC على إضافة خارجية من GTF-SI المؤتلف. سلالة، S. mutans له-gtfC، ثم يستخدم لإنتاج المؤتلف GTF-SI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب إكمال توليد S. mutans ‹gtfC، الذي يتم استبدال منطقة الترميز بأكملها من الجين gt fC مع sPCr، قبل تنفيذ هذه البروتوكولات. راجع المقالة المنشورة للحصول على تفاصيل حول الجيل5.
1. تصميم التمهيدي 2.
-
إعداد التمهيديات لبناء S. mutans له-gtfC.
ملاحظة: وترد في الجدول 1التسلسلات التمهيدية المستخدمة في هذا البروتوكول. طريقة PCR الانصهار خطوتين لتوليد S. mutans له-gtfC هو موضح تخطيطيا في الشكل 2.- تصميم التمهيديات(gtfC-عكس وSPCصإلى الأمام) للملحق من له العلامة الترميز تسلسل، والتدخل بين الجينات GTFC وSPCص (الشكل 2A).
- وتشمل GS linker وله علامة الترميز تسلسل في كل من gtfC-عكس وSPCr-إلىالأمام التمهيديات، والتي 24 قواعد في المناطق 5 'هي مكملة لبعضها البعض.
ملاحظة: يتم إرفاق تسلسل الأحماض الأمينية من الرابط GS وعلامته (غلي-غلي-غلي-سير-له-له-له-له-له) إلى C-terminus من GTF-SI من خلال ترجمة الجينات. - تصميم التمهيدي gtfCإلى الأمام لاستهداف الجين gt fC في الجينوم Wt S. mutans WT >1 كيلو بايت المصب من الجين وSPCr-عكسالتمهيدي لاستهداف المنطقة المحيطة المصب من sPCr في S. mutans -gtfC. تعيين درجة حرارة ذوبان8 (Tم)من gtfC-إلى الأمام وSPCr-عكسالتمهيديات لتتناسب مع درجات حرارة ذوبان gtfC-عكس وSPCص- التمهيديات إلى الأمام، على التوالي.
- وتشمل GS linker وله علامة الترميز تسلسل في كل من gtfC-عكس وSPCr-إلىالأمام التمهيديات، والتي 24 قواعد في المناطق 5 'هي مكملة لبعضها البعض.
- تصميم التمهيديات المتداخلة (متداخلة إلى الأمام ومتداخلة عكس) لPCR الثاني(الشكل 2B).
- تصميم التمهيديات(gtfC- إلى الأمام ومستعمرة عكس) محددة للحمض النووي الجيني للتحويل(الشكل 2C؛ وتستخدم التمهيديات لPCR مستعمرة).
ملاحظة: وamplicons تمتد على الحدود بين gtfC وsPCص. ويمكن تطبيق التمهيدي gtfCإلى الأمام كما التمهيدي إلى الأمام. - تصميم التمهيديات (صعودا إلى الأمام وإلى أسفل إلى أسفل إلى الوراء) للتأكيد النهائي لتوليد S. mutans له-gtfC (الشكل 2C؛ يتم استخدام المنتج PCR تضخيمها من قبل التمهيديات لتسلسل الحمض النووي).
- تصميم التمهيديات(gtfC-عكس وSPCصإلى الأمام) للملحق من له العلامة الترميز تسلسل، والتدخل بين الجينات GTFC وSPCص (الشكل 2A).
2. استخراج الحمض النووي الجينومي من S. mutans
ملاحظة: يجب أن يتم زراعة كل سلالة S. mutans في ضخ قلب الدماغ (BHI) المتوسطة في 37 درجة مئوية في ظل الظروف اللاهوائية. يتم زراعة سلالات متحولة من S. mutans -gtfC وS. mutans له-gtfC في BHI تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل spectinomycin.
- خط S. موتانق WT و S. mutans ‹gtfC بشكل منفصل على كل من لوحات أجار BHI. احتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- اختيار مستعمرات واحدة من S. موتانق WT أو S. mutans -gtfC باستخدام مسواك معقمة وتلقيح في 1.5 مل من مرق BHI. احتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: ويمكن استخدام المستعمرات كمصدر لقالب الحمض النووي للحمض النووي الريبي الأول (الخطوة 3-1). - نقل 1 مل من كل ثقافة بكتيرية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. الطرد المركزي الثقافة لمدة دقيقة واحدة في 15،000 × ز.
- قم بإزالة supernatant وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت Tris-EDTA (pH 8.0) لإعادة تعليق بيليه الخلية.
- الطرد المركزي التعليق لمدة 1 دقيقة في 15،000 × ز. إزالة supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية في 50 درجة مئوية من العازلة Tris-EDTA (درجة الحموضة 8.0).
- سخني التعليق باستخدام حاضنة كتلة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. الطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 15،000 × ز.
- نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة (سوف تكون بمثابة الحمض النووي قالب لPCR الأولى).
3. تضخيم PCR
ملاحظة: ويلخص الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3 دورات الـ PCR التمهيدية والكواشف والتضخيم، على التوالي.
- إجراء أول PCR باستخدام S. mutans WT و S. mutans ‹gtfC الجينوم كقوالب PCR. تضخيم المناطق التي تأوي الجزء المصب من جين gtfC وتلك التي تأوي sPCr باستخدام التمهيديات الموصوفة في الخطوة 1.1.1.2(الشكل 2A).
- الكهربائي كل منتج PCR على هلام أغاروز 1٪. استئصال شظايا الحمض النووي المطلوب من حوالي 1000 نقطة أساس و 2000 نقطة أساس.
ملاحظة: الإجراءات الأساسية لPCR9، هلام الحمض النووي الكهربائي10، وتنقية الحمض النووي11 مفصلة في مكان آخر. - إجراء PCR ثاني باستخدام منتجات PCR الأولى (متساوي ة تقريبًا) كقوالب PCR مع التمهيديات المتداخلة إلى الأمام والمتداخلة العكسية(الشكل 2B).
- الكهربائي عشر خليط PCR على هلام أغاروز. تأكيد توليد amplicon المناسبة من حوالي 3000 نقطة أساس.
-
تسريع المنتج PCR المتبقية.
ملاحظة: تنقية المنتج PCR غير ضروري، لأن amplicons غير محددة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR الثاني لا تتداخل مع إعادة تركيب متجانسة.- إضافة المياه الخالية من النوكل إلى خليط PCR وجلب الحجم الإجمالي إلى 100 درجة مئوية، تليها 0.1 حجم (10 درجة مئوية) من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) و 2.5 وحدات (250 ميكرولتر) من الإيثانول المطلق. يُخلط المزيج ويُخزّن لمدّة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة في 15،000 × ز في 4 درجة مئوية. تجاهل الـ supernatant. إضافة 1 مل من الإيثانول 70٪ لغسل بيليه الحمض النووي.
- الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 15،000 × ز في 4 درجة مئوية. تجاهل الـ supernatant. الهواء الجاف وحل بيليه الحمض النووي مع 10 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease.
4. تحويل الخلايا
- إعداد S. mutans WT المختصة لإدخال المنتج PCR الثاني باتباع الخطوات الموضحة في المنشور السابق5. تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: لهذه التجربة، تم بالفعل الحفاظ على خلايا S. mutans WT المختصة في -80 درجة مئوية لتوليد S. mutans -gtfC. - مزيج 5 ميكرولتر من المنتج PCR الثاني المركز إلى aliquot 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة الجليد الباردة المجمدة سابقا. يُضاف المزيج إلى كفيت الكهربائي. إعطاء نبضة كهربائية واحدة (1.8 كيلو فولت، 2.5 مللي ثانية، 600 Ω، 10 μF) للخلايا باستخدام جهاز الكهربائي.
- إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مرق BHI. على الفور، تنتشر 10-100 درجة مئوية من التعليق على لوحات أجار BHI التي تحتوي على الأطياف. احتضان لوحات لمدة 2-6 أيام في 37 درجة مئوية حتى نمت المستعمرات بما فيه الكفاية ليتم التقاطها.
5. التحقق منG enome إعادة التركيب والتخزين
- قم بإجراء PCR للمستعمرة، باستخدام التمهيديات الأمامية للمستعمرة والأمامية العكسية للمستعمرة لفحص هالاً لإعادة التركيب. الكهربائي كل منتج PCR مستعمرة على هلام أغاروز. تأكيد جزء الحمض النووي من حوالي 1500 نقطة أساس.
- اختيار واحدة من المستعمرات الإيجابية باستخدام مسواك معقمة والثقافة الفرعية الخلايا بين عشية وضحاها في 2 مل من مرق BHI التي تحتوي على spectinomycin.
- مزيج 0.8 مل من الثقافة البكتيرية مع 0.8 مل من الجلسرين المعقم 50٪ والأوراق المالية في -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
- نقل ما تبقى 1 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. كرر الخطوات 2.3-2.7 لاستخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا.
- قم بإجراء PCR باستخدام التمهيديات الأمامية والعكسية والحمض النووي الجيني كقالب. كرر الخطوة 3.2 لتنقية منتج الحمض النووي المتضخم من المواد الهلامية.
- تحديد تسلسل الحمض النووي للأملييكون النقي عن طريق تسلسل الحمض النووي.
ملاحظة: تأكد من تأكيد جيل S. mutans له-gtfC عن طريق تسلسل الحمض النووي.
6. تنقية بوليهيستيدين الموسومة GTF-SI
- خط S. mutans له-gtfC على لوحة أجار بي إتش آي التي تحتوي على سبيتينومايسين. احتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- التقاط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وخلايا subculture في 3 مل من مرق BHI. الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
- إعداد اثنين من قوارير مخروطية مع 1 لتر من مرق BHI دون spectinomycin. تلقيح 1 مل من تعليق الثقافة بين عشية وضحاها في 1 لتر من مرق BHI. الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
- تركيز البروتينات من ثقافة supernatant من قبل هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم.
ملاحظة: استخراج من أجسام الخلايا إذا كان البروتين المستهدف داخل الخلايا. وترد تفاصيل الإجراءات الأساسية لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم في مكان آخر12.- الطرد المركزي تعليق الثقافة البكتيرية لمدة 20 دقيقة في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية. استعادة ثقافة supernatant في كوب من الزجاج 3 L.
- أضف 1,122 غرام من كبريتات الأمونيوم إلى 2 لتر من التشبع الفائق (80% مع التحريك القوي باستخدام النمام المغناطيسي. السماح للعجل لتشكيل لمدة 4 ساعة أو أكثر في 4 درجة مئوية مع التحريك.
ملاحظة: يمكن أن يستمر تشكيل التعجيل بين عشية وضحاها. - الطرد المركزي الحل المعجّل لكبريتات الأمونيوم عند 15,000 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية. لقد أُذيب الـ(سوبرناينت)
- جمع عجل مع ملعقة ونقل إلى كوب زجاجي 200 مل. إعادة تعليق الكريات في 35 مل من العازلة ملزمة (50 M NaH2PO4،300 مل NaCl، 5 mm imidazole، الحموضة 8.0).
- Dialyze تعليق ضد 2500 مل من العازلة ملزمة باستخدام أنابيب غسيل الكلى السليلوز مجددة، في 4 درجة مئوية، مع التحريك. استبدل محلول غسيل الكلى بعد 2 ساعة واستمر في غسيل الكلى بين عشية وضحاها.
- استبدال حل غسيل الكلى مرة أخرى. استمر في الدياليس لمدة 2 ساعة إضافية.
- الطرد المركزي تعليق dialyzed في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تصفية supernatant من خلال مرشح غشاء باستخدام معدات الترشيح شفط. نقل فيلترات إلى قارورة 75 سم2.
- كسر متعدد الهيستيدين الموسومة GTF-SI من تعليق مفلطح عن طريق الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).
- نقل 2 مل من الطين الراتنج IMAC مشحونة ني (ما يقرب من 1 مل من الراتنج) إلى عمود لوني الذي يتم تركيب منفذ لأنبوب السيليكون. إزالة حل التخزين عن طريق تدفق الجاذبية.
تحذير: لا تسمح للراتنج أن يجف في جميع أنحاء IMAC. - إضافة 3 مل من الماء المقطر في العمود لغسل الراتنج. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت ملزمة لمعادلة الراتنج.
- أغلق التدفق مع قضيب قرصة هوفمان. إضافة 5 مل من تعليق تصفيتها من الخطوة 6.5 لجعل الطين.
- إضافة كل الطين إلى تعليق المصفاة المتبقية. يُلف ّ المزيج برفق لمدّة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- قم بتحميل الخليط مرة أخرى على العمود. إزالة التعليق عن طريق تدفق الجاذبية. اغسل راتنج IMAC بسعة 20 مل من المخزن المؤقت الملزم.
ملاحظة: ضبط معدل التدفق إلى ما يقرب من 2 مل / دقيقة مع الديك قرصة هوفمان في جميع أنحاء IMAC اللاحقة. - Elute المؤتلف GTF-SI مع 20 مل من العازلة elution (50 M NaH2PO4،300 MM NaCl، 500 mM imidazole، درجة الحموضة 8.0).
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. وينبغي تخزين eluate في 4 درجة مئوية. يمكن إعادة استخدام راتنج IMAC. الرجوع إلى التعليمات الخاصة براتنج IMAC.
- نقل 2 مل من الطين الراتنج IMAC مشحونة ني (ما يقرب من 1 مل من الراتنج) إلى عمود لوني الذي يتم تركيب منفذ لأنبوب السيليكون. إزالة حل التخزين عن طريق تدفق الجاذبية.
- استبدل المخزن المؤقت elution بالمخزن المؤقت للتخزين (المخزن المؤقت للفوسفات بسعة 50 مل، ودرجة الحموضة 6.5) وركّز حل GTF-SI المؤتلف على ما يقرب من 1 مل باستخدام وحدة الترشيح الفائق الطرد المركزي. تخزين الحل المؤتلف GTF-SI في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تأكيد تنقية GTF-SI ذات العلامات المتعددة باستخدام SDS-PAGE13 والنشاف الغربي14 عن طريق استخدام الجسم المضاد للبولهيستيدين أحادي النسيلة من قبل الفجل. إضافة CHAPS (التركيز النهائي، 0.1٪) قد تكون هناك حاجة إلى eluent لتجنب الامتزاز غير محددة إلى وحدة، اعتمادا على البروتين المستهدف.
7. استعادة وظيفية من قبل المؤتلف GTF-SI
- خط كل S. موتانق سلالة على لوحة أجار BHI على حدة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- باستخدام مسواك معقمة، التقاط مستعمرة واحدة لتلقيح في 2 مل من مرق BHI. الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
- استخدام 20 درجة مئوية من ثقافة بين عشية وضحاها من S. mutans -gtfC لتلقيح 2 مل من مرق BHI تحتوي على 1٪ السكروز دون المضادات الحيوية في أنبوب اختبار الزجاج. إضافة GTF-SI أو حجم مماثل من السيارة إلى ثقافة S. mutans -gtfC، وثقافة الخلايا مع أنبوب وضعت في موقف يميل بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تعقيم الحل GTF-SI مع مرشح حقنة معقمة وتحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار بروتين حمض bicinchoninic15 قبل الاستخدام. - تحريك تعليق الثقافة مع خلاط دوامة لمدة 10 s. Decant تعليق. غسل أنابيب الاختبار مع كمية كافية من الماء المقطر.
- وصمة عار biofilms على جدار أنبوب مع 1 مل من 0.25٪ Coomassie الأزرق اللامع (CBB).
- Decant حل تلطيخ بعد 1 دقيقة. اغسل أنابيب الاختبار مع كمية كافية من الماء المقطر. الهواء الجاف ة أنابيب الاختبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 3 حجم كل أمبير يكون من ثاني PCR(الشكل 3ألف)وPCR الثاني(الشكل 3B). ويتوافق حجم كل أمبير مع الحجم المتوقع، على النحو المبين في الجدول 1. ويبين الشكل 4A مستعمرات S. mutans التي تحولت مع المنتج PCR الثاني ومطلي على لوحات أجار BHI التي تحتوي على الأطياف. ثم تم تشغيل منتجات PCR مستعمرة على هلام أغاروز(الشكل 4B). وكان كل أملييكون من الحجم المتوقع، على النحو المبين في الجدول 1. ويبين الشكل 5 صور SDS-PAGE ووصمة عار غربية. وقد لوحظ البروتين تنقية مع IMAC كنطاق واحد من قبل SDS-PAGE(الشكل 5A). تم تنفيذ وصمة عار الغربية باستخدام الأجسام المضادة للبوليهيستيدين للتأكد من أن الفرقة التي لوحظت كان البروتين المتوقع بوليهيستيدين الموسومة(الشكل 5B)من 160 kDa. ويبين الشكل 6 قدرة تشكيل الفيوفيلم الحيوي المشتقة من السكروز لكل سلالة من سلالة S. mutans. فقط S. mutans WT و S. mutans له-gtfC يمكن أن تشكل biofilm الملتصقة على جدار الأنبوب في وجود 1٪ السكروز. لم يلاحظ هذا في S. mutans ΔgtfC (الشكل 6A). ومع ذلك، فإن إضافة المؤتلف GTF-SI استعادة القدرة على تشكيل البيوفيلم الملتصق ة في S. mutans ΔgtfC (الشكل 6B).
الشكل 1: تنظيم الجصال اتّصال ية وspc r loci في جينوم S. mutans UA159 ومشتقاته. رسم تخطيطي لعلامته بين gtfC و sPCr. أطوال الجينات والفجوات ليست على نطاق واسع. البنتاغون المظلل: SMU_1004; البنتاغون الصلبة: SMU_1006. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية لـ PCR الانصهار من خطوتين. رسم تخطيطي لـ S. المعتصمون بناءه أطوال الجينات والفجوات ليست على نطاق واسع. يتم الإشارة إلى مواقع الربط التمهيدي في القالب بواسطة الأنماط. (أ)تم تضخيم المناطق التي تأوي جزءاً من جين gtfC في جينوم S. mutans WT وتأوي sPCr في جينوم S. mutans ΔgtfC باستخدام PCR الأول. (ب)تم تنفيذ PCR الثاني مع التمهيديات المتداخلة باستخدام الشظايا اثنين التي تم تضخيمها من قبل PCR الأولى كقوالب، وتم الحصول على بناء الحمض النووي لإعادة تركيب متجانسة. (C)تم توليد سلالة متحولة عند إعادة تركيب متجانسة في البكتيريا. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الكهروفوريس هلام أغاروز من المنتجات PCR الأولى والثانية. (أ)يتم عرض منتجات PCR الأولى لجزء من gtfC (gtfC; الصورة اليسرى) والمنطقة التي تأوي spcr (spcr; الصورة اليمنى). وتنقسم الصورة الكهربائية واحدة لتسمية العصابات علامة. (ب)يتم عرض منتجات PCR الثانية تضخيم مع التمهيديات المتداخلة. يشير كل رأس سهم إلى الحجم المتوقع لكل منتج PCR. M = علامة جزيئية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مستعمرة PCR إلى توليد الشاشة من S. mutans له-gtfC. (A)يتم عرض المستعمرات S. mutans التي تم تحويلها بواسطة المنتج PCR الثاني. يتم الإشارة إلى معرف المستعمرة بأرقام دائرية. (B)يتم عرض الكتروفوريس هلام أغاروز من منتجات PCR مستعمرة. رقم حارة دائرية يتوافق مع معرف المستعمرة في الشكل 4A. M = علامة جزيئية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأكيد تنقية GTF-SI الموسومة بالبوليهيستيدين. (أ)يتم عرض صورة SDS-PAGE التمثيلية. (B)يتم عرض صورة وصمة عار الغربية التمثيلية. تم فحص غشاء النيتروسيلولوز الذي تم نقل GTF-SI مع الجسم المضاد للبولشيستيدين أحادي النسيلة الفجل بيروكسيداز- مترافق. تم تصور العصابات المناعية التفاعلية باستخدام رد فعل الكيميلومينس. تشير رؤوس الأسهم إلى الحجم المتوقع للمؤتلف GTF-SI. M: علامة الجزيئية; 1 = عينة قبل IMAC؛ 2 = عينة تم الحصول عليها من قبل IMAC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الاستعادة الوظيفية عن طريق إضافة المؤتلف GTF-SI. (أ)تظهر قدرة تشكيل الفيوفيلم الحيوي الملتصق المشتق من السكروز لكل سلالة من سلالة S. mutans. (ب)تم استعادة القدرة على تشكيل الأغشية الحيوية الملتصقة في S. mutans ΔgtfC بإضافة المؤتلف GTF-SI (25 ميكروغرام). WT = S. mutans WT; ΔgtfC = S. mutans ΔgtfC; له-gtfC = S. mutans له-gtfC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أزواج التمهيدي | تسلسل (5′ إلى 3′) | حجم النطاق المتوقع (bp) | ||
| PCR 1 | ||||
|
GTFC-إلى الأمام gtfC-عكس A، B |
TAAAggTTGTATTATTCAACGTGTAACC ATGATGATGATACTACCACCACCTCC AAATAAAGAATGTCAA |
1,090 | ||
|
sPCص-إلىالأمام A، C SPCص -عكس |
GGTGTTAGTCATCATCATCAT CAT TAAATCGATTTGTGTGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAACATGTTACTCAC |
2,232 | ||
| PCR الثاني | ||||
| متداخلة إلى الأمام عكس متداخلة |
TGGTATTATTTCGAATAACGGTTATGTGTCAC اة اكتتاغاغااتتتت/ اتات |
3,179 | ||
| التحقق من إعادة التركيب | ||||
| مستعمرة PCR | ||||
|
GTFC-إلى الأمام مستعمرة عكسية |
TAAAggTTGTATTATTCAACGTGTAACC CCACTCTCAACTCCGAACATAGTAGTACC |
1,482 | ||
| التحقق النهائي | ||||
| من الأمام أسفل عكس |
تاكجGCCGTATATTATTACGATTAACTATGTG TTGTCCACTGAAGTCAGTTTGCAAGGCATG |
6,173 | ||
الجدول 1: المواد التمهيدية المستخدمة في البروتوكول. ألف التسلسلات المسطرة من 'gtfC-عكس و sPCr-forward'هي مكملة، وتسلسل اتّباع اقصّة غامقةرمز لعلامة ه(gtfC-reverse; ATGATGATATGGG، sPCصإلى الأمام؛ لجنة مناهضة التعذيب وغيره من بطاقاتالعمل على مناهضة التعذيب وغيره من بطاقات العمل على الاتفاقية؛ ACTACCACCACCTCC، sPCص-إلى الأمام؛ GGTGGTAGT). باء تم إزالة الحمض النووي وقف codon من GTFC. جيم تم إضافة codon توقف الحمض النووي (TAA) مباشرة بعد تسلسل الترميز polyhistidine.
| كاشف | تركيز محلول المخزون | حجم | التركيز النهائي |
| الحمض النووي البوليمرات بريميكس | 2x | 25 ميكرولتر | 1x |
| التمهيدي إلى الأمام | 5 ميكرومتر | 2 ميكرولتر | 0.2 ميكرومتر |
| عكس التمهيدي | 5 ميكرومتر | 2 ميكرولتر | 0.2 ميكرومتر |
| قالب الحمض النووي | متغير | متغير | متغير |
| المياه منزوعة الأيونات | - | حتى 50 ميكرولتر | - |
الجدول 2: الكواشف PCR: وبالنسبة للأول PCR، تمت إضافة 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي. وبالنسبة للثاني PCR، أضيف 0.5-2 ميكرولتر من أمبليسون PCR الأول إلى خليط التفاعل. بالنسبة لـ PCR المستعمرة، تمت إضافة الخلايا البكتيرية مباشرة إلى خليط التفاعل.
| خطوه | درجه الحراره | الوقت | عدد الدورات |
| التناطور الأولي | 98 درجة مئوية | 2 دقيقة | 1 |
| التناطور الصلب ملحق |
98 درجة مئوية 50 درجة مئوية 72 درجة مئوية |
10 s 5 s تعتمد على أمبليكون (1 دقيقة / 1 كيلوبت في الثانية) |
35 |
| التمديد النهائي | 72 درجة مئوية | تعتمد على أمبليكون (1 دقيقة / 1 كيلوبت في الثانية) |
1 |
الجدول 3: دورات تضخيم PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصميم التمهيديات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. تم تحديد تسلسل gtfC-عكس وSPCR-إلى الأمام التمهيديات تلقائيا على أساس تسلسل كل من منطقة نهاية 3′ من GTFC والمنطقة نهاية 5′ من sPCr. كل التمهيدي يتضمن 24 قواعد تكميلية التي ترميز رابط GS وتسلسل له العلامة الترميز في مناطقهم 5'. يمكن تجنب تعطيل التسلسلات التنظيمية الأصلية الموجودة في المناطق المحيطة بالمنبع بإضافة تسلسلات الترميز الخاص به إلى نهاية 3′. يجب إزالة codon وقف الحمض النووي من التمهيدي gtfCعكس وتضاف إلى التمهيديSPC r-إلىالأمام. وعلاوة على ذلك، ينبغي تصميم gtfC-إلى الأمام وsPCr-reverseلتضخيم المناطق المحيطة من حوالي 1 كيلو بايت من المنبع والمصب من المنطقة المستهدفة من إعادة التركيب المتجانس في جينوم S. mutans WT، التوالي. إضافة تسلسل المحيطة طويلة يحسن كفاءة إعادة تركيب متجانسة. تم تصميم التمهيديات المتداخلة لاستخدامها بدلا من الزوج التمهيدي الخارجي(gtfC-إلى الأمام وSPCr-reverse)في هذا البروتوكول. مطلوب إدراج التمهيديات المتداخلة لPCR الثاني، كما هو مفصل في مكان آخر5.
التحول عن طريق الكهربائي هو كفاءة1 وإجراءات لإعداد الخلية المختصة السابقة الكهربائي هي أيضا أبسط بكثير بالمقارنة مع الأساليب البديلة16،17،18، على الرغم من أن هناك حاجة إلى جهاز الكهربائي. فمن المستحسن بشدة لإعداد المختصة S. mutans WT من جديد في حالة المستعمرات المفقودة على لوحة بعد الكهربائي. على الرغم من أن الحضانة لبضع ساعات بعد الكهرباء قد يحسن كفاءة التحول، فإن الحضانة الإضافية لا تؤثر على نجاح التحول. يجب استخدام الخلايا في مرحلة نمو السجل لإعداد الخلية المختصة، كما هو موضح سابقا5.
وبما أن كمية البروتين المؤتلف تعتمد على التعبير الأصلي للجين، فقد تكون هناك حاجة إلى توسيع نطاق الثقافة في حالات البروتينات ذات التعبير الأدنى. الطريقة المعروضة هنا محدودة بتطبيق عملية الاستعادة الوظيفية. لا يمكن تطبيق إضافة الجينات ذات الأهمية على البروتينات داخل الخلايا من خارج نطاق ها. ومع ذلك، فإن الطريقة المتقدمة تقدم مزايا كبيرة من حيث المرفق والكفاءة والتكلفة (على سبيل المثال، لا ردود فعل أنزيمية غير PCR) عند العمل مع البروتين المستهدف خارج الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تنقية البروتين المؤتلف وتأكيد التعبير الجيني الفعلي ببساطة باستخدام تطبيقات علامة صاحب البطاقات الشائعة، كما هو موضح في الشكل 5.
ويمكن تكييف الطريقة الحالية، بما في ذلك اختلال الجينات وعزل المنتجات الجينية، لاستخدامها في المستقبل في أنواع أخرى كتجارب متسلسلة للتحليل الوظيفي لجين ذي أهمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت هذا العمل الجمعية اليابانية لتعزيز العلم (رقم المنحة 16K15860 و19K10471 إلى T.M., 17K12032 to M.I., and 18K09926 to N.H.) ومؤسسة SECOM للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة 2018.09.10 No. 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
