Immunology and Infection

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/59804

Takatoshi Murata¹, Mamiko Yamashita¹, Masao Ishikawa^1,2, Koji Shibuya², Nobuhiro Hanada¹

¹Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, ²Laboratory for Oral Health Science

Summary

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Abstract

O elucidation da função de um gene envolve tipicamente a comparação de traços fenotípicos de estirpes e de tensões do selvagem-tipo em que o gene do interesse foi interrompido. A perda da função que segue o rompimento do gene é restaurada subseqüentemente pela adição exógena do produto do gene interrompido. Isso ajuda a determinar a função do gene. Um método descrito anteriormente envolve a geração de uma cepa de Streptococcus mutans com ruptura de gene gtfc . Aqui, um método não exigente é descrito para purificar o produto do gene Gtfc da estirpe de S. mutans recém-gerada após o rompimento do gene. Envolve a adição de uma seqüência da polyhistidine-Coding na extremidade 3 do ′ do gene do interesse, que permite a purificação simples do produto do gene usando a cromatografia de afinidade imobilizada do metal. Não são necessárias reações enzimáticas para além da PCR para a modificação genética neste método. A restauração do produto genético por adição exógena após o rompimento genético é um método eficiente para determinar a função gênica, que também pode ser adaptada a diferentes espécies.

Introduction

A análise de um gene ' a função de s envolve geralmente a comparação de traços fenotípicos de estirpes do selvagem-tipo às tensões em que o gene do interesse foi interrompido. Uma vez que a estirpe de gene-disrupted é produzida, a adição exógena do produto do gene permite a restauração funcional.

O método mais comum para a obtenção de produtos gênicos purificados necessários para os ensaios subsequentes de restauração é a realização de expressão heteróloga em Escherichia coli¹. No entanto, a expressão de proteínas de membrana ou proteínas de alta massa molecular é muitas vezes difícil usando este sistema¹. Nestes casos, a proteína alvo é geralmente isolada das células que sintetiza nativamente a proteína através de uma série complexa de etapas, o que pode levar à perda do produto genético. Para superar estas edições, um procedimento simples foi desenvolvido para a purificação do produto do gene que segue um método²do rompimento do gene, método de emenda PCR-baseado do ADN³ (PCR designado da fusão da dois-etapa), e Electroporation para genético transformação em Streptococcus mutans. A adição de uma etiqueta do polyhistidine (His-tag) ao C-Terminus do produto do gene facilita sua purificação pela cromatografia de afinidade imobilizada do metal (IMAC).

Para isolar a estirpe his-tag-expressando, o ADN genomic inteiro do gene do interesse (neste seu-Tag-expressando a tensão gene-disrupted) é substituído com um gene antibiótico-resistente do marcador. O procedimento para gerar o seu-Tag-expressando strainis quase idêntico àquele para gerar uma tensão gene-interrompida como descrita previamente⁴^,⁵. Conseqüentemente, os métodos para o rompimento do gene e o isolamento do produto do gene devem ser executados como experimentos seriais para a análise funcional.

No presente trabalho, uma seqüência de codificação de polihistidina é anexada à extremidade 3 ′ do gene Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-si (GTF-si) em S. mutans⁶. Em seguida, foram realizados estudos de expressão em espécie estreptocócica. Conseguir a expressão heterólogo de gtfc por E. coli é difícil, provável por causa da massa molecular elevada de GTF-si. Esta estirpe chama-se S. mutans his-gtfc. Uma ilustração esquemática que descreve a organização da gaveta do gene da resistência de gtfc e de espectinomicina (SPC^r)⁷ loci em Wild-Type s. mutans (s. mutans WT) e seus derivados é mostrado em Figura 1. O GTF-SI é uma proteína secretora que contribui para o desenvolvimento do biofilme dental cariogênico⁶. a presença de sacarose, um biofilme aderente é observado em uma superfície de vidro liso na estirpe de WT s. mutans , mas não na estirpe de s. mutans gtfc-disrupted (s. mutans Δgtfc)^2,5. A formação de biofilme é restaurada em S. mutans Δgtfc após adição exógena do GTF-si recombinante. A cepa, S. mutans his-gtfc, é então usada para produzir o GTF-si recombinante.

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Protocol

Nota: Geração de S. mutans ∆gtfc, em que toda a região codificadora do gene gtfc é substituída por SPC^r, deve ser completada antes da realização desses protocolos. Consulte o artigo publicado para obter detalhes sobre a geração⁵.

1. projeto da primeira demão

Prepare primers para a construção de S. mutans his-gtfc.
Nota: As sequências de primer utilizadas neste protocolo são mostradas na tabela 1. Método de PCR de fusão em duas etapas para a geração de S. mutans his-gtfc é esquematicamente ilustrado na Figura 2.
1. Primers de design(gtfc-Reverse e SPC^r-Forward) para a fixação de sua seqüência de codificação de Tags, interpor entre o gene gtfc e o SPC^r (Figura 2a).
  1. Inclua o vinculador GS e sua sequência de codificação de tag em ambos os primers Gtfc-Reverse e SPC^r-Forward, nos quais 24 bases nas regiões 5 ' são complementares entre si.
    Nota: a seqüência do aminoácido do vinculador GS e sua Tag (Gly-Gly-Gly-Gly-ser-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-
  2. Projete um primer gtfc-forward para direcionar o gene gtfc no genoma de S. mutans WT > 1 KB a jusante do gene e o SPC^r-Reverse primer para atingir a região de flanqueamento a jusante do SPC^r no S. mutans ∆gtfc. Ajuste a temperatura de^{derretimento 8} (T_m) dos primers gtfc-Forward e SPC^r-reverso para combinar com as temperaturas de derretimento do gtfc-reverso e do SPC^r- primers Forward, respectivamente.
2. Projete primers aninhados (aninhados-Forward e Nested-reverso) para o segundo PCR (Figura 2b).
3. Primers do projeto (Gtfc-para diante e colônia-reverso) específicos para o ADN genomic do transformante (Figura 2C; os primers são usados para a PCR da colônia).
  Nota: Os amplicões straddle a beira entre gtfc e SPC^r. O primer Gtfc-Forward pode ser aplicado como primer dianteiro.
4. Projete primers (up-Forward e para baixo-reverso) para a confirmação final da geração de S. mutans his-gtfc (Figura 2C; o produto do PCR amplificado pelos primers é usado para arranjar em seqüência do ADN).

2. extração de DNA genômica de S. mutans

Nota: Cada cepa de S. mutans deve ser cultivada em meio de infusão de coração cerebral (BHI) a 37 ° c em condições anaeróbias. As cepas mutantes de s. mutans ∆Gtfc e s. mutans his-gtfc são cultivadas em BHI suplementado com 100 μg/ml de Spectinomicina.

Streak s. Mutans WT e s. mutans ∆gtfc separadamente para cada uma das placas de agar BHI. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.
Escolha colônias únicas de s. Mutans WT ou s. mutans ∆gtfc usando um palito esterilizado e inoculado em 1,5 ml de caldo BHI. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.
Nota: As colônias podem ser usadas como fonte de DNA de modelo para a primeira PCR (etapa 3,1).
Transfira 1 mL de cada cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a cultura por 1 minuto em 15.000 x g.
Retire o sobrenadante e adicione 1 mL do tampão Tris-EDTA (pH 8,0) para suspender o pellet celular.
Centrifugar a suspensão durante 1 min a 15.000 x g. Retire o sobrenadante. Ressuscitem o pellet celular em 50 μL de tampão Tris-EDTA (pH 8,0).
Aqueça a suspensão usando uma incubadora do bloco por 5 minutos em 95 ° c. Centrifugar a suspensão durante 5 min a 15.000 x g.
Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (o sobrenadante servirá como DNA de modelo para a primeira PCR).

3. amplificação do PCR

Nota: A tabela 1, tabela 2e tabela 3 resumem os primers, reagentes e ciclos de amplificação de PCR, respectivamente.

Realize a primeira PCR utilizando o genoma s . Mutans WT e s. mutans ∆gtfc como modelos de PCR. Amplificar as regiões abrigando a parte a jusante do gene Gtfc e aqueles que abriam o SPC^r usando os primers descritos na etapa 1.1.1.2 (Figura 2a).
Electrophorese cada produto do PCR no gel do agarose de 1%. Extirpar os fragmentos de DNA desejados de aproximadamente 1.000 BP e 2.000 BP. purifique os fragmentos dos géis usando o método de extração de gel baseado em membrana de sílica.
Nota: Os procedimentos básicos para o PCR⁹, a electroforese¹⁰do gel do ADN, e a purificação¹¹ do ADN são detalhados em outra parte.
Realize uma segunda PCR utilizando os produtos da primeira PCR (aproximadamente equimolar) como modelos de PCR com os primers aninhados-Forward e Nested-reverso (Figura 2b).
Electrophorese um décimo da mistura do PCR no gel do agarose. Confirme a geração do amplicon apropriado de aproximadamente 3.000 BP.
Precipitate o produto restante do PCR.
Nota: a purificação do produto do PCR não é necessária, porque os amplicões não específicos gerados pelo segundo PCR não interferem com o recombination homous.
1. Adicionar água nuclease-livre à mistura de PCR e trazer o volume total para 100 μL, seguido por 0,1 volume (10 μL) de 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) e 2,5 volumes (250 μL) de etanol absoluto. Misture e guarde a mistura durante 10 min à temperatura ambiente (RT).
2. Centrifugue a amostra durante 20 min a 15.000 x g a 4 ° c. Descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de 70% de etanol para lavar o pellet de DNA.
3. Centrifugue a amostra durante 5 min a 15.000 x g a 4 ° c. Descarte o sobrenadante. Secar ao ar e dissolver o pellet de DNA com 10 μL de água sem nuclease.

4. transformação celular

Prepare o WT s. Mutans competente para introduzir o segundo produto de PCR seguindo os passos descritos na publicação anterior⁵. Armazene as células a-80 ° c.
Nota: Para este experimento, as células de s. Mutans WT já foram preservadas em-80 ° c para gerar s. mutans ∆gtfc.
Misturar 5 μL do segundo produto de PCR concentrado para a alíquota de 50 μL de células de gelo-frias competentes congeladas anteriormente. Adicione a mistura em cubos de electroporação. Dê um único pulso elétrico (1,8 quilovolts, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) às pilhas usando o instrumento do Electroporation.
Ressuscitem as células em 500 μL de caldo BHI. Imediatamente, espalhe 10 – 100 μL da suspensão para as placas de agar BHI contendo Spectinomicina. Incubar as placas por 2 – 6 dias a 37 ° c até que as colônias tenham crescido suficientemente para serem colhidas.

5. verificação darecombinação e do armazenamento de Gome

Realize PCR de colônia, usando primers gtfC-Forward e Colony-Reverse para a tela para a recombinação. Electrophorese cada produto do PCR da colônia em um gel do agarose. Confirme o fragmento de DNA de aproximadamente 1.500 BP.
Escolha uma das colônias positivas usando um palito esterilizado e subcultura as células durante a noite em 2 mL de caldo BHI contendo Spectinomicina.
Misture 0,8 mL de cultura bacteriana com 0,8 mL de glicerol de 50% estéril e estoque a-80 ° c ou-20 ° c.
Transfira os restantes 1 mL de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Repita os passos 2.3 – 2.7 para extrair o DNA genómico das células.
Execute o PCR usando os primers up-Forward e down-Reverse e o ADN genomic como um molde. Repita o passo 3,2 para purificar o produto de ADN amplificado dos géis.
Determine a seqüência do ADN do amplicon purified pelo sequenciamento do ADN.
Nota: Certifique-se de confirmar a geração de S. mutans his-gtfc por sequenciamento de DNA.

6. purificação de polyhistidine-Tagged GTF-SI

Streak S. mutans his-gtfc em uma placa de agar BHI contendo Spectinomicina. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.
Pegue uma única colônia usando um palito esterilizado e células de subcultura em 3 mL de caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.
Prepare dois frascos cônicos com 1 L de caldo BHI sem Spectinomicina. Inocular 1 mL da suspensão da cultura durante a noite em 1 L do caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.
Concentrado de proteínas do sobrenadante de cultura por precipitação de sulfato de amônio.
Nota: extrato de corpos celulares se uma proteína alvo é intracelular. Os procedimentos básicos para a precipitação do sulfato do amónio são detalhados em outra parte¹².
1. Centrifugue a suspensão da cultura bacteriana durante 20 min a 10.000 x g a 4 ° c. Recupere o sobrenadante de cultura em uma taça de vidro de 3 litros.
2. Adicionar 1.122 g de sulfato de amônio a 2 L do sobrenadante (80% de saturação) com agitação vigorosa utilizando um agitador magnético. Deixe o precipitado formar por 4 h ou mais a 4 ° c com agitação.
  Nota: a formação do precipitado pode ser continuada durante a noite.
3. Centrifugue a solução precipitada com sulfato de amónio a 15.000 x g durante 20 min a 4 ° c. Decantar o sobrenadante.
4. Colete o precipitado com uma espátula e transfira para uma taça de vidro de 200 mL. Ressuscita os pellets em 35 mL de tampão de ligação (50 mM NaH₂po₄, 300 mm NaCl, 5 mm imidazol, pH 8,0).
5. Dialyze a suspensão de encontro a 2.500 mL do tampão de ligação usando uma tubulação regenerada da diálise da celulose, em 4 ° c, com agitação. Substitua a solução de diálise após 2 h e continue a diálise durante a noite.
6. Substitua novamente a solução de diálise. Continuar a Dialize para um adicional de 2 h.
Centrifugue a suspensão Dialítica a 20.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Filtre o sobrenadante através de um filtro de membrana usando equipamento de filtração por sucção. Transfira o filtrado para um balão de 75 cm² .
Fractionate o GTF-SI polyhistidine-etiquetado da suspensão filtrada pela cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC).
1. Transfira 2 mL da pasta de resina IMAC com carga de Ni (aproximadamente 1 mL de resina) para uma coluna cromatográfica cuja saída é montada em um tubo de silicone. Remova a solução de armazenamento pelo fluxo de gravidade.
  Atenção: Não deixe a resina secar ao longo do IMAC.
2. Adicionar 3 mL de água destilada na coluna para lavar a resina. Adicionar 5 mL do tampão de ligação para equilibrar a resina.
3. Desligue o fluxo com um galo pitada Hoffmann. Adicione 5 mL da suspensão filtrada da etapa 6,5 para fazer a pasta.
4. Adicione toda a pasta à suspensão filtrada restante. Agitar suavemente a mistura durante 30 min a 4 ° c.
5. Coloque a mistura de volta na coluna. Retire a suspensão pelo fluxo de gravidade. Lave a resina IMAC com 20 mL de tampão de ligação.
  Nota: Ajuste a vazão para aproximadamente 2 mL/min com um pau de pinça Hoffmann em todo o IMAC subsequente.
6. Elute o GTF-SI de recombinação com 20 mL do amortecedor da eluição (50 milímetro NaH₂po₄, 300 milímetro NaCl, 500 milímetros imidazole, pH 8,0).
  Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. O eluato deve ser conservado a 4 ° c. A resina IMAC pode ser reutilizada. Consulte as instruções para a resina IMAC.
Substitua o tampão de eluição pelo tampão de armazenamento (tampão fosfato de 50 mM, pH 6,5) e concentre a solução de GTF-SI recombinante em aproximadamente 1 mL utilizando uma unidade de ultrafiltração centrífuga. Armazene a solução de GTF-SI recombinante a 4 ° c.
Nota: Confirme a purificação polyhistidine-etiquetada de GTF-si usando SDS-PAGE¹³ e western blotting¹⁴ empregando um anticorpo monoclonal antipolihistidina peroxidase-conjugated do rábano. Adição de CHAPS (concentração final, 0,1%) ao eluente pode ser exigido para evitar a adsorção não específica à unidade, dependendo da proteína do alvo.

7. restauração funcional por GTF-SI recombinante

Raia cada s. Mutans tensão em uma placa de agar BHI individualmente. Incubar as placas durante a noite a 37 ° c.
Usando um palito esterilizado, pegue uma única colônia para inocular em 2 mL de caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.
Use 20 μL da cultura overnight de S. mutans ∆gtfc para inocular 2 ml de caldo BHI contendo 1% de sacarose sem antibióticos em um tubo de ensaio de vidro. Adicione o GTF-SI ou um volume equivalente do veículo à cultura S. mutans ∆gtfc , e cultura as células com o tubo colocado em uma posição inclinada durante a noite.
Nota: Esterilize a solução de GTF-si com um filtro estéril da seringa e determine a concentração da proteína usando um ensaio ácido ácido da proteína¹⁵ antes de usar.
Agitar as suspensões de cultura com um misturador de vórtice para 10 s. decantar as suspensões. Lave os tubos de ensaio com uma quantidade suficiente de água destilada.
Manchar os biofilmes na parede do tubo com 1 mL de 0,25% de azul brilhante de Coomassie (CBB).
Decantar a solução de coloração após 1 min. Lave os tubos de ensaio com uma quantidade suficiente de água destilada. Ar-seque os tubos de ensaio.

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Representative Results

A Figura 3 mostra o tamanho de cada amplicon a partir da primeira PCR (Figura 3a) e da segunda PCR (Figura 3B). O tamanho de cada amplicon correspondeu ao tamanho previsto, conforme descrito na tabela 1. A figura 4a mostra S. as colônias de mutans transformadas com o segundo produto do PCR e chapearam nas placas do agar de BHI que contêm o spectinomycin. Os produtos do PCR da colônia foram executados então no gel do agarose (Figura 4B). Cada amplicon foi do tamanho previsto, conforme descrito na tabela 1. A Figura 5 mostra imagens de SDS-PAGE e Western Blot. A proteína purificada com IMAC foi observada como uma única banda por SDS-PAGE (Figura 5a). O borrão ocidental foi executado usando o anticorpo do antipolyhistidine para confirmar que a faixa observada era a proteína polyhistidine-etiquetada esperada (Figura 5b) de 160 kDa. A Figura 6 mostra a capacidade de formação de biofilme derivada de sacarose de cada cepa de S. mutans . Somente s. mutans WT e s. mutans his-gtfc podem formar um biofilme aderente na parede do tubo na presença de 1% de sacarose. Isso não foi observado em S. mutans Δgtfc (Figura 6a). Entretanto, a adição do GTF-SI recombinante restaurou a capacidade de formação de biofilme aderente em S. mutans Δgtfc (Figura 6B).

Figura 1: organização do Gtfc e do SPC^r loci no genoma de S. mutans UA159 e seus derivados. Uma ilustração esquemática do seu-Tag entre Gtfc e SPC^r. Os comprimentos dos genes e lacunas não são a escala. Pentágono sombreado: SMU_1004; Pentágono sólido: SMU_1006. Este valor foi modificado a partir de uma publicação anterior². Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: estratégia para a PCR de fusão em duas etapas. Uma ilustração esquemática de S. mutans Sua construçãoGtfc . Os comprimentos dos genes e lacunas não são a escala. Os sites de encadernação de primer no modelo são indicados por padrões. (A) as regiões que abriam parte do gene gtfc no genoma do WT de s. mutans e que abrigando o SPC^r no genoma de s. MUTANS Δgtfc foram amplificadas usando o primeiro PCR. (B) a segunda PCR foi realizada com primers aninhados utilizando os dois fragmentos que foram amplificados pela primeira PCR como modelos, e obteve-se uma construção de DNA para recombinação homous. (C) a cepa mutante foi gerada Após recombinação homous nas bactérias. Este valor foi modificado a partir de uma publicação anterior². Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: eletroforese em gel de agarose de primeiro e segundo produtos de PCR. (A) os produtos da primeira PCR de uma parte de gtfc (gtfc; imagem à esquerda) e a região que abrigando SPCR (SPCR; imagem à direita) são mostrados. A única imagem electrophoretic é dividida para etiquetar as faixas do marcador. (B) os segundos produtos do PCR amplificados com os primers aninhados são mostrados. Cada ponta de seta indica o tamanho previsto de cada produto de PCR. M = marcador molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: PCR de colônia para geração de tela de S. mutans his-gtfc. (A) as colônias de S. mutans transformadas pelo segundo produto do PCR são mostradas. O ID da colônia é indicado por números circulantes. (B) a electroforese do gel do agarose dos produtos da colônia PCR é mostrada. O número da faixa circundada corresponde ao ID da colônia na figura 4a. M = marcador molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: confirmação da purificação de GTF-si com etiquetada com polihistidina. (A) Aimagem de SDS-PAGE representativa é mostrada. (B) a imagem ocidental representativa do Borrão é mostrada. Uma membrana da nitrocelulose em que GTF-si foi transferida foi sondado com um anticorpo monoclonal do antipolyhistidine peroxidase-conjugado do rábano. As bandas immunoreactive foram visualizadas usando uma reação do quimioluminescência. Os setas indicam o tamanho previsto do GTF-si recombinante. M: marcador molecular; 1 = amostra antes do IMAC; 2 = amostra obtida pelo IMAC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: restauração funcional por adição do GTF-si recombinante. (A) a capacidade de formação de biofilme aderente derivado da sacarose é mostrada para cada cepa de S. mutans . (B) a capacidade de formar biofilmes aderentes foi restaurada em S. mutans ΔGTFC por adição de GTF-si recombinante (25 μg). WT = S. mutans WT; Δgtfc = S. mutans δgtfc; His-gtfc = S. mutans his-gtfc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pares da primeira demão	Seqüência (5 ′ a 3 ′)	Tamanho de banda esperado (BP)
1ª PCR
Gtfc-Forward Gtfc-Reverse ^{A, B}	TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC Atgatgatgatgatgactaccaccacctcc AAATCTAAAGAAATTGTCAA	1.090
SPC^r-Forward ^{A, C} SPC^r-Reverse	Ggtggtagtcatcatcatcat Gato TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGARAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC	2.232
2º PCR
Aninhadas-Forward Aninhado-reverso	TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG	3.179
Verificação de recombinação
PCR da colônia
Gtfc-Forward Colônia-reverso	TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC	1.482
Verificação final
Up-Forward Para baixo-reverso	TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG	6.173

Tabela 1: primers utilizados no protocolo. ^Um As sequências sublinhadas de ' gtfC-Reverse e SPC^r-forward ' são complementares, e o código seqüênciado em negrito para o seu-Tag (gtfc-Reverse; ATGATGATGATGATG, SPC^r-Forward; CATCATCATCATCATCAT) e GS Linker (Gtfc-reverso; ACTACCACCACCTCC, SPC^r-Forward; GGTGGTAGT). ^B O Codon do batente do ADN de Gtfc foi removido. ^C Um Codon do batente do ADN (TAA) foi adicionado imediatamente depois das seqüências polyhistidine-codificando.

Reagente	Concentração da solução de estoque	Volume	Concentração final
Premix do polymerase do ADN	2x	25 μL de	1x
Iniciador dianteiro	5 μM	2 μL de	0,2 μM
Primer reverso	5 μM	2 μL de	0,2 μM
Modelo de DNA	Variável	Variável	Variável
Água deionizada	-	Até 50 μL	-

Tabela 2: Reagentes do PCR: Para o primeiro PCR, 2 μL do molde do ADN foram adicionados. Para o segundo PCR, 0.5-2 μL do primeiro amplicon do PCR foram adicionados à mistura da reação. Para o PCR da colônia, as pilhas bacterianas foram adicionadas diretamente à mistura da reação.

Passo	Temperatura	Tempo	Número de ciclos
Desnaturação inicial	98 ° c	2 minutos	1
Desnaturação Recozimento Extensão	98 ° c 50 ° c 72 ° c	10 de s 5 s Amplicon-dependente (1 min/1 kbp)	35
Extensão final	72 ° c	Amplicon-dependente (1 min/1 kbp)	1

Tabela 3: Ciclos de amplificação de PCR.

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Discussion

O projeto de primers é o passo mais crítico do protocolo. As sequências dos primers gtfc-Reverse e SPC^r-Forward foram automaticamente determinadas com base nas sequências da região final de 3 ′ do gtfc e da região final de 5 ′ do SPC^r. Cada primer inclui 24 bases complementares que codificam um vinculador GS e uma sequência de codificação his-tag em suas 5 ' regiões. O rompimento das seqüências reguladoras nativas situadas nas regiões flanqueando ascendentes pode ser evitado pela adição de his-tag-codificando seqüências à extremidade 3 do ′. O Codon do batente do ADN deve ser removido do primer Gtfc-reverso e ser adicionado ao primer ^r-forward do SPC. Além disso, o Gtfc-Forward e o SPC^r-reverso devem ser projetados para amplificar as regiões flanqueando de aproximadamente 1 KB a montante e a jusante da região alvo da recombinação Homous no genoma do WT de S. mutans , Respectivamente. A adição de longas sequências de flanqueamento melhora a eficiência da recombinação homous. Os primers aninhados foram projetados para serem usados em vez do par de primers mais externo (Gtfc-Forward e SPC^r-Reverse) neste protocolo. A inclusão de primers aninhados é exigida para o segundo PCR, como detalhado em outra parte⁵.

A transformação pelo Electroporation é eficiente¹ e os procedimentos para a preparação de pilha competente que precede o electroporation são igualmente muito mais simples comparados aos métodos alternativos¹⁶^,¹⁷^,¹⁸, Embora seja necessário um aparelho de electroporação. Recomenda-se vivamente que se prepare o peso de s. Mutan s.novo em caso de colónias em falta na placa após electroporação. Embora a incubação por um par de horas após o electroporation possa melhorar a eficiência da transformação, a incubação extra não afeta o sucesso da transformação. As células na fase de crescimento do log devem ser usadas para a preparação da célula competente, como descrito anteriormente⁵.

Uma vez que a quantidade de proteína recombinante depende da expressão nativa do gene, a cultura de expansão pode ser necessária em casos de proteínas com menor expressão. O método apresentado aqui é limitado pela aplicação do ensaio de restauração funcional. A adição de gene de interesse não pode ser aplicada a proteínas intracelulares exogenamente. No entanto, o método desenvolvido apresenta vantagens consideráveis em termos de facilidade, eficiência e custo (por exemplo, sem reações enzimáticas além da PCR) quando se trabalha com a proteína alvo extracelular. Adicionalmente, a purificação da proteína recombinante e a confirmação da expressão gênica real podem ser executadas simplesmente usando aplicações comuns de sua marca, como mostrado na Figura 5.

O método atual, incluindo o rompimento do gene e o isolamento do produto genético, pode ser adaptado para uso futuro em outras espécies como experimentos seriados para a análise funcional de um gene de interesse.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) (números de subvenção 16K15860 e 19K10471 para T. M., 17K12032 a M. I., e 18K09926 a N. H.) e a Fundação de ciência e tecnologia da SECOM (SECOM) (número de subvenção 2018.09.10 n º 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH₂PO₄·2H₂O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH₄)₂SO₄	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spc^r
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation

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References

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