Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering af lamina propria mononukleare celler fra murine Colon ved hjælp af collagenase E

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Målet med denne protokol er at isolere mononukleare celler, der bor i lamina propria i tyktarmen ved enzymatisk fordøjelse af vævet ved hjælp af collagenase. Denne protokol giver mulighed for effektiv isolering af mononukleare celler, hvilket resulterer i en enkelt cellesuspension, som igen kan bruges til robust immunophenotyping.

Abstract

Tarmen er hjemsted for det største antal immunceller i kroppen. De små og store tarm immun systemer politi eksponering for eksogene antigener og moduere responser på potente mikrobielt afledte immun stimuli. Af denne grund, tarmen er et stort mål sted for immun dysregulering og betændelse i mange sygdomme, herunder, men ikke begrænset til inflammatoriske tarmsygdomme såsom Crohns sygdom og colitis ulcerosa, graft-versus-Host sygdom (GVHD) efter knogle knoglemarv transplantation (BMT), og mange allergiske og smitsomme tilstande. Murine modeller af gastrointestinal inflammation og colitis er stærkt anvendt til at studere GI komplikationer og til præ-klinisk optimere strategier for forebyggelse og behandling. Data hentet fra disse modeller via isolation og fænotypisk analyse af immunceller fra tarmen er afgørende for yderligere immun forståelse, der kan anvendes til at forbedre gastrointestinale og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne rapport beskriver en meget effektiv protokol til isolering af mononukleare celler (MNC) fra tyktarmen ved hjælp af en blandet silica-baseret tæthed gradient interface. Denne metode reproducerbart isolerer et betydeligt antal levedygtige leukocytter samtidig minimere kontaminerende snavs, tillader efterfølgende immun fænotypebestemmelse ved flow cytometri eller andre metoder.

Introduction

Selvom mave-tarmkanalen primært er dedikeret til behandling og reabsorption af næringsstoffer fra fødevarer, bevarer GI-kanalen også centrale roller i integriteten af vaskulære, lymfe-og nervesystemer og mange andre organer gennem dets slimhinde og submucosale immunsystem1. GI immunsystemet har en indflydelsesrig rolle i både gastrointestinal og systemisk sundhed på grund af sin konstante udsættelse for udenlandske antigener fra fødevarer, kommensal bakterier, eller invaderende patogener1,2. Således, GI immunsystemet skal opretholde en delikat balance, hvor det tolererer ikke-patogene antigener samtidig reagere passende på patogene antigener1,2. Når balancen i tolerance og forsvar er forstyrret, lokaliseret eller systemisk immun dysregulering og betændelse kan forekomme resulterer i et utal af sygdomme1,2,3.

Tarmen havne mindst 70% af alle lymfoide celler i kroppen4. De fleste primære immunologiske interaktioner involverer mindst én af tre immun stationer i tarmen: 1) Peyers patches, 2) Intraepiteliale lymfocytter (IEL) og 3) lamina propria lymfocytter (LPL). Hver af disse består af et komplekst sammenkoblet netværk af immunceller, der hurtigt reagerer på normale immun udfordringer i tarmen5. Begrænset til stroma over muscularis mucosae, den løst strukturerede lamina propria er bindevæv i tarmslimhinden og omfatter stilladser til villus, Vaskulaturen, lymfedrænage og slimhinde nervesystem, samt mange medfødte og adaptive immun undersæt6,7,8,9. LPL består af CD4+ og CD8+ T celler i et omtrentligt forhold på 2:1, plasmaceller og myeloid Lineage celler herunder, dendritiske celler, mastceller, eosinofile og makrofager6.

Der er en stigende interesse i at forstå immun dysregulering og betændelse i tarmen, da det vedrører forskellige sygdomstilstande. Sådanne tilstande som Crohns sygdom og colitis ulcerosa alle manifesterer varierende niveauer af Colon inflammation10,11,12. Desuden kan patienter med maligne eller ikke-maligne lidelser i marv eller immunsystemet, som gennemgår en allogen knoglemarvstransplantation (Allo-BMT), udvikle forskellige former for colitis, herunder 1) direkte toksicitet fra konditioneringsregimer før BMT, 2) infektioner forårsaget af immunsuppression efter BMT og 3) graft-versus-Host sygdom (gvhd) drevet af donor-type T-celler reagerer på donor Allo-antigener i vævet efter BMT13,14,15. Alle disse post-BMT komplikationer resulterer i betydelige ændringer i immunforsvaret af tarmene16,17,18. Den foreslåede metode muliggør en pålidelig vurdering af immuncelle akkumulering i muse tyktarmen og, når den anvendes til murine modtagere efter BMT, letter en effektiv analyse af både donor og recipient immunceller involveret i transplantations tolerance19 ,20. Yderligere årsager til tarmbetændelse omfatter maligniteter, fødevareallergi, eller afbrydelse af tarm mikrobiome. Denne protokol giver adgang til Gut mononukleare celler fra tyktarmen og, med ændringer, til leukocytter af tyndtarm i nogen af disse prækliniske murine modeller.

En PubMed søgning ved hjælp af søgeordene "tarm og immuncelle og isolation" afslører over 200 publikationer, der beskriver metoder til tyndtarm fordøjelse til at udtrække immunceller. Men en lignende litteratursøgning for Colon giver ingen velafgrænsede protokoller, der specificerer isolering af immunceller fra tyktarmen. Dette kan være fordi tyktarmen har mere muskuløs og interstitiel lag, hvilket gør det vanskeligere at helt fordøje end den lille tarm. I modsætning til eksisterende protokoller, denne protokol specifikt bruger collagenase E fra Clostridium histolyticum uden andre bakterielle kollagenaser (collagenase D/collagenase I). Vi viser, at ved hjælp af denne protokol, kan fordøjelsen af det koloniske væv opnås samtidig bevare kvaliteten af isolerede tarm mononukleiske immunceller (MNC) uden tilsætning af anti-clumping reagenser såsom natrium versenate (EDTA), Dispase II, og deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Denne protokol er optimeret til at tillade reproducerbar robust udvinding af levedygtige MNC fra murine kolon for yderligere rettet undersøgelser og bør egner sig til studiet af immunologi af tyktarmen eller (med ændringer) tyndtarmen24, 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle undersøgelser blev gennemført i henhold til gnaver forskningsprotokoller, som blev gennemgået og godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) ved University of Miami Miller School of Medicine, som opfylder de veterinære standarder, der er fastsat af American Association for Forsøgsdyrsvidenskab (AALAS).

1. forberedelse af løsninger

  1. Som beskrevet i tabel 1, forberede Colon buffer, silica-baserede tæthed adskillelse medier 100%, silica-baserede tæthed adskillelse medier 66%, silica-baserede tæthed adskillelse medier 44%, collagenase E fordøjelses buffer, og FACS buffer.
    1. Forbered kolon buffer dagen før proceduren og opbevar natten over ved 4 °C.
    2. Forbered 100% silica-baserede tæthed adskillelse medier dagen før proceduren og opbevares natten over ved 4 °C, at placere ved stuetemperatur om morgenen af proceduren til at tø.
    3. Forbered 66% og 44% silica-baserede separations medier om morgenen af isolationen, ved hjælp af stuetemperatur 100% silica-baserede tæthed adskillelse medier og kolon buffer.
    4. Den passende mængde Clostridium histolyticum-afledt Kollagenase E og opbevares ved-20 °c natten før proceduren. Den følgende morgen, opløses i den passende mængde tyktarms buffer til at udlede Kollagenase fordøjelses buffer. For alle inkubationer med Kollagenase fordøjelses buffer på dagen for proceduren, pre-Warm opløsninger til 37 °C.
  2. For hele protokol trinene holdes en centrifuge ved 20 °C og rotationshastigheden på 859 x g, med bremser inaktiveret (0 deceleration) for gradient centrifugering. Indstil en anden til 4 °C og rotationshastighed på 859 x g, med standard deceleration, til vask trin.

2. høst tyktarmen

  1. Euthanize musen via CO2 kvælning efterfulgt af aalac-godkendt bekræftende metode.
  2. Placer musen i en liggende position og spray pels med 70% ethanol. Ved hjælp af store vævs saks, lave en lodret midterlinje indsnit og udsætte den intakte peritoneum.
  3. Brug fine dissektion saks, åbne peritoneum. Brug pincet til at flytte den lille tarm til den ene side og udsætte den nedadgående kolon. Lidt trække opad på den faldende kolon til maksimalt udsætte rektal del af tyktarmen. Skær den distale endetarm dybt i bækkenet og dissekere og fjerne hele tyktarmen som en enhed, fra den distale endetarmen til cecal cap.
  4. Overføre tyktarmen i 20 mL kølet kolon buffer i en 50 mL polypropylen rør.

3. rengøring af tyktarmen

  1. Placer tyktarmen på et fugtet papirhåndklæde og Udpak den solide afføring ved at anvende mildt Tryk på tarmvæggen med den stumme ende af saks eller pincet.
  2. Placer tyktarmen i en Petri skål og skyl tarmen med 10 mL kølet kolon buffer ved hjælp af en 10 mL sprøjte med 18 G stump nål.
  3. Overfør kolon til en kolon buffer fugtet papir håndklæde og fjerne mesenterium og fedt med den skarpe ende af saks.
  4. Placer tyktarmen i en Petri skål fyldt med 5-10 ml kølet kolon buffer agitere manuelt for at vaske resterende Colon indhold. Gentag 2-3 gange.
  5. Skær tyktarmen i længderetningen fra sin mere muskuløs rektal ende til det proximale kolon (genererer et enkelt rektangulært åbent kolon stykke) i en Petri skål fyldt med frisk kølet kolon buffer. Kassér eksisterende medier og fyld med ren kølet kolon buffer.
  6. Skyl tarmen 3 gange ved kraftigt at hvirvlende det i Petri skålen og erstatte 5-10 mL kølet kolon buffer efter med hver vask.
  7. Placer det rektangulære tyktarms væv på et papirhåndklæde fugtet med kolon buffer og skær det ved at skære det horisontalt og derefter i små fragmenter (3 mm x 3 mm sektioner).
  8. Saml kolon fragmenter forsigtigt ved hjælp af fine pincet i 20 mL kølet kolon buffer i en 50 mL polypropylen konisk rør.
  9. Vask tyktarmen fragmenter 3 gange, hver vask i 20 mL kolon buffer, ved kraftigt hvirvlende røret for 30 s. mellem hver agitation, tillade vævs fragmenter at bosætte sig i bunden af røret. Decant eller vakuum aspirerer supernatanten, samtidig med at vævs fragment tabet forhindres i Aspirations processen mellem hver vask.
    Bemærk: Der er ingen grund til at skifte røret efter hver vask.

4. collagenase fordøjelse 1

  1. 20 mL af Kollagenasefordøjelses bufferen tilsættes de vaskede kolon fragmenter i 50 mL polypropylen-konisk slange.
  2. Det lukkede 50 mL-rør placeres ved 37 °C i en inkuberet orbital shaker med rotationshastigheden sat til 2 x g for 60 min. Sørg for, at vævs fragmenter er i konstant bevægelse under agitation; Hvis det er nødvendigt, øge rotationshastigheden trinvist for at sikre, at ingen vævs fragmenter bosætte sig på røret bunden.

5. Forbered silica-baserede separations medie gradienter

  1. Forbered 66% og 44% silica-baserede tæthed adskillelse medier, ved hjælp af 100% silica-baserede tæthed adskillelse medier ved 20 °C (stuetemperatur) og kolon buffer.
  2. 5 mL 66% silica-baserede tætheds separerings medier hældes i hver af de 3 separate 15 mL polypropylenrør. Forbered 3 rør pr. kolon. Dette danner den højere tæthed base af gradient isolation procedure, på hvilken lavere tæthed adskillelse medier vil blive lagdelt for at skabe separation gradient.
  3. Opbevares ved 20 °C indtil brug.

6. samling af supernatant fra fordøjelsen 1

  1. Supernatanten opsamles kun ved hjælp af en 25 mL serologisk pipette, og supernatanten filtreres gennem et 40 μm pore filtreringsstof cellefilter, som er anbragt i et rent 50 mL konisk rør af polypropylen, efter at Kollagenase fordøjelsen 1 er afsluttet. Vær omhyggelig med ikke at aspirere eksisterende vævs fragmenter.
    Bemærk: Opbevar alle resterende synlige vævs fragmenter i røret. Disse vil gennemgå anden kollagenase fordøjelse (trin 8).

7. quenching Kollagenase fordøjelses buffer

  1. Fyld 50 mL polypropylen rør helt med kølet kolon buffer.
    Bemærk: Collagenase er aktiv ved 37 °C; Derfor afkøles buffer inaktiverer dette enzym.
  2. Centrifugeglasset centrifugeres ved 4 °C ved 800 x g i 5 min.
    1. Kassér supernatanten via vakuum aspiration. Vask cellerne med 25 mL frisk kolon buffer og centrifugeres ved 800 x g i 5 min.
    2. Resuspension af pellet i mindre end 1 mL frisk kølet kolon buffer.
    3. Den 50 mL polypropylen-konisk slange placeres på is.

8. collagenase fordøjelse 2

  1. Gentag trin 4 (fordøjelse 1) med de resterende vævs fragmenter tilbageholdt fra trin 6,1.

9. vævs Disaggregering efter fordøjelse 2

  1. Skyl vævs fragmenter kraftigt frem og tilbage mellem røret og en 10 mL sprøjte gennem en 18 G stump-ende nål.
  2. Gentag denne flush i mindst 7-8 komplette passager, indtil der ikke er synlige bruttovævs fragmenter eller snavs.

10. Filtrer celler

  1. Pass væv opdeling suspension gennem en 40 μm-pore filtration stof celle si i en ren 50 ml polypropylen rør.
  2. Vask filtration stof celle si med 10 ml kølet kolon buffer til at inddrive eventuelle celler fanget i filteret.

11. dæmpning Kollagenase fordøjelse

  1. Fyld 50 mL polypropylen konisk rør til fælgen med kølet kolon buffer.
    Bemærk: Temperaturen af tyktarmen buffer er afgørende for at sikre slukning af kollagenase aktivitet.
  2. Spin ved 4 °C og 800 x g i 5 min.
  3. Kassér supernatanten via vakuum aspiration.
  4. Vask ved opsuspension i 25 mL frisk kølet kolon buffer, efterfulgt af centrifugering ved 4 °c, 800 x g i 5 min.
  5. Kassér supernatanten via vakuum aspiration.
  6. Samle den opslæmmede pellet fra Kollagenase fordøjelse 1 (trin 7) til det tilsvarende rør fra trin 11,4.
  7. Gentag trin 11,4 (vask og centrifugering).

12. silica-baseret tæthed adskillelse medier gradient adskillelse

Bemærk: Udfør trin 12-18 så hurtigt som muligt for at sikre hurtig slukning af kollagenaseaktiviteten.

  1. Efter trin 11,7, resuspension hver pellet i 24 mL i alt 44% silica-baserede tæthed adskillelse medier pr kolon.
  2. Der udtages langsomt 8 mL af mediet fra trin 12,1 på hvert af de tre rør, som er fremstillet i trin 5,2 (indeholdende 66% silica-baserede tætheds separerings medier) ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette. Opretholde en stabil og langsom strøm af 44% tæthed adskillelse medier mens lagdeling gradient for at undgå afbrydelse af grænsefladen.
  3. Afbalancerer omhyggeligt alle rør i centrifuge spande ved hjælp af en veje skala eller en balance.
  4. Drej rørene 20 min ved 859 x g i en centrifuge uden bremse ved 20 °c. Lad rotorerne til at komme til at fuldføre hvile, før du fjerner rør, passe på ikke at forstyrre cellerne på gradient interface.

13. Saml mononukleare celler fra gradient interface

  1. Visualiser gradient interface (nær 5 mL-mærket), hvor typisk et 1-2 mm tykt hvidt bånd (indeholdende MNC) er til stede.
    Bemærk: Man kan eller kan ikke se et hvidt bånd. Men, MNC vil være på denne grænseflade og bør Sky klarhed af gradient interface.
  2. Vakuum Aspirér og kassér de øverste 7 mL af den øverste gradient for at give lettere pipette adgang til grænsefladen.
  3. Brug kontinuerlig manuel sugning og stabil roterende håndled bevægelse, indsamle grænsefladen lag af celler i en ren 50 mL polypropylen konisk rør. Saml indtil grænsefladen mellem de 2 gradienter er klar og refraktiel (fri for celler).
  4. Fyld opsamlingsrøret med 50 mL kølet FACS buffer. Spin ved 4 °C, 800 x g i 5 min.
  5. Du aspirerer supernatanten via vakuum aspiration og opslæmmer pellet i 1 mL FACS buffer.
  6. Tæl cellerne på et hemocytometer ved en 1:2 fortynding ved hjælp af passende døde celle udelukkelses metoder.
  7. Fortsæt til FACS farvning eller andre assays med frisk isoleret Colon MNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når du arbejder med murine tyktarms sygdom modeller, det er nyttigt at være i stand til både kvantificere og kvalitativt vurdere, blandt MNC af tyktarmen, flere immunceller undergrupper involveret i den inflammatoriske proces. Single-cellesuspension af MNC opnået gennem anvendelsen af denne protokol letter sådanne fænotypiske karakterisering i en robust og reproducerbar måde. Som et bevis på princippet for anvendelsen af denne isolationsmetode under forskellige eksperimentelle indstillinger, vi hentede Colon MNC ved hjælp af denne metode og udførte multi-parameter flow flowcytometri på celler isoleret fra mus med (figur 1 og Figur 2 , allogen BMT) og uden (figur 2a, SYNGENEISK BMT) signifikant immunmedieret kolonisk skade efter BMT.

Flowcytometri og dataanalyser blev udført for at sammenligne brøkdele af apoptotiske og nekrotiske døde lymfocytter ved brug af enten Kollagenase E eller D til isolation, med eller uden behandling med DNase 1. Den gating-strategi, der anvendes under strømnings cytometri, er angivet i figur 1a.  Efter annekset i v (apoptose markør) og Fikselig levende/dødt blåt farvestof (nekrose markør) ved enkelt celle suspensioner efter hver isolation viste collagenase E uden DNase en signifikant højere procentdel af bilagI Vneg Levende/døde blåneg levende celler (median 43,3%, område 26,5%-59,9%, n = 3) efter isolation sammenlignet med collagenase D uden DNase (median 8,7%, interval 3,6%-10,2%, n = 3), selv sammenlignet med collagenase E + DNase (median 8,18%, interval 4,7%-20,4%, n = 3) eller Collagenase D + DNAse (median 15.10%, interval 9,9%-21,4%, n = 3). Desuden identificerede vi bilagI VnegLive/Dead Blue + nekrotiske celler med en median procentdel på 41,0% i collagenase E gruppen (interval 37.1%-58,8%, n = 3) versus 90,0% i collagenase D Gruppen (interval 69.7%-95,5%, n = 3), 75,9% i collagenase E + DNase Gruppen og 80,3% i gruppen collagenase D + DNAse (interval 65.7%-79,5%, interval 54.9%-89,9%, n = 3). Repræsentative FACER parceller fra n = 1 dyr i hver gruppe er vist figur 1b).

Som yderligere bevis på princippet om konsistens og udbytte af levedygtige MNC ved hjælp af denne procedure i syge mus, multi-parametrisk flow flowcytometri blev anvendt på MNC isoleret fra cd 45.2 Balb/c recipient mus på dag 7 efter at have modtaget BMT af enten allogen (CD 45.1 C57BL/6 donor) eller og (CD 45.1 Balb/c donor) BMT-modeller. Ved hjælp af absolutte MNC-tal ganget med procent gated immun undersæt opnået ved flowcytometri-analyser kunne det gennemsnitlige absolutte antal donor CD4+ og CD8+ T- celler udvundet fra BMT-modtagerens kolon beregnes og sammenlignes (n = 4 pr. gruppe, figur 2a). Da det kan være vigtigt at identificere og/eller kvantificere sjældne immuncelle populationer i sådanne musemodeller, vurderede vi sjældne delmængder, herunder donor afledte (CD 45.1+) Foxp3+ T regulatoriske celler (treg) i både syngeneiske og allogene BMT-modeller. Den gating strategi for at nå donor Treg celler (CD4+CD25+FoxP3+) fra antistof-farvede enkelt cellesuspension er vist (sekvens af porte afgrænset af en rød pil; Figur 2b). Ved hjælp af denne metode, selv sjældne undergrupper såsom donor afledt Colon treg infiltrerende modtager mus kolon efter BMT kunne analyseres (figur 2c, repræsentative plot; n = 1).

Figur 3 viser en udvidet anvendelse af denne metode i historiske data fra vores gruppe ved hjælp af den præsenterede protokol til at sammenligne akkumulering af gvhd-INDUCERENDE CD8 + versus CD4 + donor-afledte T-celler i tyktarmen af Balb/c-mus enten beskyttet eller ikke beskyttet fra GVHD af præ-BMT behandlings forberedelses-(konditionerings) regime20. De testede præparative regimer inkluderede 800 cGy/myeloablativ total krops bestråling (TBI800) eller ikke-myeloablativ TBI (400TBI) samt nonmyeloablativ konditionering ved brug af total lymfom bestråling (TLI), hvor bestråling blev leveret til lymfeknuder knuder, thymus og milt med afskærmning af kraniet, lunger, lemmer, bækken og hale. Alle konditionering blev kombineret med anti-thymocyt serum (ATS), et immunmodulerende middel. Så tidligt som dag 6 efter BMT resulterede denne koloniske MNC-isolations protokol i robuste flow cytometriske analyser sammenlignet med identiske analyser af flere lymfocyt berigede GVHD-målorganer såsom milt og mesenteriske lymfeknuder (MLN) (figur 3a)20 . Reproducerbar isolering af Colon MNC på tværs af BMT-modtagere (n = 7-10 pr. behandlingsgruppe) gav mulighed for en solid statistisk sammenligning af absolutte tal for donor CD8+ Effector T-celler mellem forskellige prætransplantations konditionerings behandlingsgrupper ( Figur 3b), hvilket gav vigtige data om immun fænotyper, som førte til vigtige undersøgelser, der afslørede de medfødte immun mekanismer af gvhd-beskyttelse mod tli i modsætning til TBI pre-BMT conditioning. 20

Figure 1
Figur 1: flow cytometrisk analyse af Colon MNC på dag 7 efter BMT i allogene musemodel systemer, når de er isoleret med collagenase E og D med og uden DNase 1. Wild-type (WT) (CD 45.2+) Balb/c (H2Kd +) mus MODTOG BMT fra CD45 congenic (CD 45.1+) C57BL/6 donor mus (allogen BMT, n = 3 pr. gruppe). WT (CD 45.2+) Balb/c modtager mus blev administreret 800cGy TBI (Balb/c) 1 dag før BMT. På dag 7 efter BMT, enkelt celle suspensioner af recipient kolon blev fremstillet efter metoderne i dette manuskript med brug af collagenase E (100 U/mL), collagenase E (100 U/mL) med DNAse 1 (500 μg/mL), collagenase D (500 μg/mL) eller collagenase D (500μg/mL) med DNAse 1 (500μg/mL) (n = 3 pr. gruppe). Celler blev plettet med Live/Dead-UV450 (Live/Dead Blue), annekset i V-APC, H-2Kd-PE, CD 45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue, og CD11B-PE-Cy7 antistoffer. A) gating-strategi for FACS-analyser. Gate 0, Forward scatter (FSC-a) og side scatter (SSC-a) på enkelt cellesuspension af MNC bruges til at identificere leukocytter; Gate 1, udelukkelse af ikke-enkeltceller ved hjælp af SSC-A; Gate 2, udelukkelse af ikke-enkeltceller ved hjælp af FSC-A; Gate 3, identifikation af bilagI v-positive (apoptotic) og fixable levedygtighed Dye Live/Dead-UV450+annexin v-negative (nekrotiske) celle undersæt. B) repræsentative facer parceller i bilag V og fixable levedygtighed farve farvning af gated leukocytter blandt MNC for de 4 eksperimentelle grupper. N = 1 repræsentativ mus pr. gruppe i grupper: collagenase E (100 U/mL), collagenase E (100 U/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL), collagenase D (500 μg/ml) og collagenase D (500 μg/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: flow cytometrisk karakterisering af Colon MNC på dag 7 efter BMT i allogene og syngeneiske musemodel systemer. WT (CD 45.2+) C57BL/6 (H2Kd-neg) og Balb/c (H2Kd +) mus fik BMT fra CD45-congenic (CD 45.1+) C57BL/6 og Balb/c donor mus (syngeneic eller allogen BMT, n = 4 pr. eksperimentel gruppe). C57BL/6 og BALB/c recipient-mus fik klargørende konditioneringsregimer af 950cGy (C57BL/6) og 800cGy (BALB/c) myeloablativ TBI, leveret en dag før BMT. På dag 7 efter BMT, enkelt-celle suspensioner af recipient Colon MNC blev udarbejdet efter metoderne i dette manuskript. Celler blev plettet med levende døde-BV510, H-2Kd-PE, CD 45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-CY7, CD25-PacificBlue, FOXP3-AF647, og CD11B-PE-Cy7 antistoffer, N = 4 mus pr. gruppe. (A) gennemsnit ± SEM absolut tal (log 10) CD 45.1+ h-2kd-neg eller cd45.1 + h-2kd + (donor-type, i hvert tilfælde) CD11bnegCD4+ og CD8+ T-celler isoleret fra recipient kolon på dag 7 Efter konditionering og CD 45.1 C57BL/6 (donor) → CD 45.2 BALB/c (modtager) BMT. N = 4 pr. gruppe. B) gating-strategi for FACS-analyser. Gate 0, Forward scatter (FSC-a) og side scatter (SSC-a) på enkelt cellesuspension af MNC bruges til at identificere leukocytter; Gate 1, udelukkelse af ikke-enkeltceller ved hjælp af SSC-A; Gate 2, udelukkelse af ikke-enkeltceller ved hjælp af FSC-A; Gate 3, levende celle udvælgelse Gate 4, adskillelse af hæmatopoietiske celler af BMT donor versus BMT modtager oprindelse; Gate 5, udvælgelse af donor ikke-myeloid Lineage celler; Gate 6, selektiv gating af CD4+ T- celler; Gate 7, separat gating af CD4+CD25+FoxP3+ T regulatoriske (treg) celler. Den røde pil angiver nedrulnings strategi. C) repræsentative FACER CD25 og FoxP3 farvning ved hjælp af gating-strategien i (B) på dag 7 efter konditionering og BMT i tyktarmen af en Balb/c-modtager af ALLOGEN BMT (C57BL/6 → Balb/c). Procentdel af cellerne i hver port er givet inden for porten. WT = vildtype; TBI = total bestråling af kroppen; BM = 10 x 106 CD 45.1+ congenic C57BL/6 eller Balb/c donor knoglemarvsceller; Teff = T Effector celler; Treg = Foxp3+ T regulerende celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ikke-myeloablativ TLI/ATS, men ikke TBI/ATS conditioning nedsætter donor TCRαβ+CD8+ Effector T celle akkumulering. A) repræsentative FACER parceller af CD4 og CD8 farvning af gated h-2kb +tcrαβ+ celler fra donor h-2kb + C57BL/6 mus i milt (øverste række), mesenterisk lymfeknude (MLN) (midterste række), og kolon (nederste række) af modtagere på dag 6 efter konditionering og transplantation. Procentdel af cellerne i hver port er givet over porten. (B) gennemsnit ± SEM absolut tal (log 10) H-2kB +tcrαβ+CD8+ celler i MILT (øverste panel), MLN (midterste panel), og kolon (nederste panel) af modtagere på dag 6 efter konditionering og BMT. WT = vildtype; TBI = total bestråling af kroppen; TLI =: Total lymfoid bestråling; ATS = anti-thymocyt serum; BM = 50 x 106 WT C57BL/6 donor knoglemarvsceller; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 donor milt celler; TBI800, TBI400 = cGy doser af myeloablativ (TBI800) eller non-myeloablativ (TBI400) TBI. * Dette tal er blevet modificeret fra Van der Merwe et al.20. Copyright 2013. Den amerikanske forening af Immunologists, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Løsning Formel
Kolon buffer 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (varme inaktiveret ved 56oC i 60 minutter, ph justeret til 7,3)
Silica-baserede massefylde gradient medier 100% (pr. kolon) 22,5 mL silica-baseret massefylde gradient medie + 2,5 ml 10X PBS.
Silica-baserede massefylde gradient medier 66% (pr. kolon) 10,72 mL silica-baseret massefylde gradient medier 100% + 5,28 ml kolon buffer
Silica-baserede massefylde gradient medier 44% (pr. kolon) 11 mL silica-baseret massefylde gradient medier 100% + 14 ml kolon buffer
Kollagenase fordøjelses buffer (pr. kolon) 100 U/mL collagenase E fra Clostridium histolyticum, opløst i 40 ml tyktarms buffer
FACS buffer 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g natriumazid

Tabel 1: tabel til klargøring af opløsningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne visuelle protokol beskriver veltolereret metoder til isolering af koloniske mononukleare celler, herunder lamina propria lymfocytter (LPL). I betragtning af, at denne protokol blev optimeret til at evaluere alvorlige post-transplantation muse colitis modeller, hvor inflammatoriske cytokiner og vævsskade egner sig til dårlig levedygtighed af genvundet MNC, vi forventer, at disse metoder kan oversættes til andre applikationer, der kræver fænotypisk analyse af Colon MNC. Disse omfatter, men, er ikke begrænset til at vurdere tyktarmsbetændelse i musemodeller af inflammatorisk tarmsygdom, undersøgelser af immunrespons af colitis-målrettede behandlinger, og colitis produceret af infektiøse patogener. Derudover indikerer vores data ved hjælp af isoleringer i raske (syngeneiske BMT) mus, at isolations proceduren ikke kræver signifikant inflammatorisk infiltrat for at tillade immuncelle detektering i MNC-isolaterne. Der er faktisk opnået lignende data ved hjælp af ubehandlede raske (ikke-BMT) mus (data ikke vist).

Flere af de vigtigste trin i denne protokol adskiller den fra andre offentliggjorte metoder og bidrager til et højt udbytte og levedygtighed. For eksempel, optimering af Clostridium histolyticum-afledte kollagenase E aktivitet (100 U/ml endelige aktivitetsniveau) tillader konsekvente beregninger for forskellige partier af enzym over langtrækkende eksperimenter26. Der er 28 forskellige medlemmer i kollagen familien, tilsammen udgør næsten 30% af alle proteiner i pattedyr kroppen27. Derudover har forskellige væv særskilte fordelinger af kollagen-undertyper, der hver kræver unikke kollagenaser til fordøjelse28. Collagenase fra C. histolyticum indeholder 6 forskellige proteiner, der er klassificeret i to klasser29,30. Den specifikke type af kollagenase anvendes kan ændre levedygtigheden og den samlede kvalitet af cellerne isoleret fra tyktarmen31. Tidligere undersøgelser har vist, at kollagenase type C-2139 (kollagenase E) tillader et højt udbytte af lymfocytter blandt MNC isoleret fra tyndtarmen25. Men, disse protokoller ikke adresse fordøjelsen af tyktarmen, en langt mere muskuløs orgel med betydeligt mere komplekse kollagen sammensætning end tyndtarmen.

Tilstrækkelighed og pålidelighed af enzymatisk vævs nedbrydning er en etableret faktor, der påvirker det samlede celle udbytte og levedygtighed ved at minimere behovet for tilbagevendende mekaniske forstyrrelser (hvilket inducerer øget mekanisk traume til vævet). På grund af tilstrækkelig enzymatisk fordøjelse af den interstitielle og slimhinde kollagen ved hjælp af en kollagenase E-specifik protokol (i forhold til kollagenase D-mediated fordøjelsesprotokoller i standard brug), denne protokol minimerer mængden af mekanisk manipulation af vævs fragmenter, der er nødvendige for at forstyrre interstitiumet og frigive immuncelle undersæt til suspension. Dette øger yderligere levedygtigheden af isolerede MNC for efterfølgende assays. Som det fremgår af dataene (figur 1b), eliminerer dette behovet for DNase og andre kemiske eller mekaniske anti-clumping manøvrer ud over standard filtrering af en enkelt cellesuspension gennem en Strainer. Andre rapporter, der skitserer isolering af tarm lymfoide celler har brugt ditiotreitol (DTT) og EDTA som mucolytiske agenter til at forbedre både udbytte og levedygtighed af de isolerede mononukleale leukocytter24.

Et andet unikt aspekt af denne protokol, som forbedrer celle udbyttet er anvendelsen af en finjusteret silica-baseret tæthed adskillelse medie gradient. Andre fordøjelsesmetoder papirer offentliggjort til dato ikke bruge en sådan tæthed separation gradient21,31. Men i forfatterne ' erfaring og de af samarbejdspartnere udnytte denne protokol til at isolere funktionelt aktive lymfoide celler, tæthed gradient rensning forbedrer både levedygtighed og renhed af MNC genvundet efter fordøjelsen19 , 20 , 32.

Selv om ikke et fokus i dette manuskript, værd at nævne for dem, der arbejder med tarmbetændelse modeller i mus er, at metoderne i dette manuskript kan ændres for at tillade lignende høj kvalitet isolering af levedygtige MNC fra tyndtarmen. Ændringen af den primære Colon protokol kræves for at opnå dette er brugen af en enkelt 90-min fordøjelse (snarere end 2 60-min digestions), med alle andre trin (herunder enzym aktivitetsniveau og slukke trin) identisk med dem, der vises. Denne modifikation giver typisk en række 0,8-4 x 106 MNC pr. tyndtarm uden eller 1,5-2.5 x 106 MNC med optagelsen af Terminal ileum herunder leukocyt-rige cecal cap. Derfor er en nyhed i denne protokol er, at anvende den primære protokol til tyktarmen og den modificerede protokol til tyndtarm, man kunne isolere MNC med høj reproducerbarhed og god levedygtighed fra både tyndtarmen og kolon af individuelle forsøgsdyr i samme eksperiment.

Sammenfattende, den beskrevne protokol giver mulighed for effektiv og reproducerbar isolering af mononukleare celler fra tyktarmen eller, med ændringer, den lille tarm. Med 2 dygtige operatører arbejder sammen, så mange som 10 separate koloner kan behandles og analyseres på en enkelt dag, og enkelt-celle suspensioner kan være klar til efterfølgende fænotypiske og funktionelle analyse inden for 6-8 h fra vævs høst. Anvendelsen af denne protokol kan vise sig værdifulde for andre forskningsformål kræver immun vurdering af Colon inflammation, så andre investigatorer til at karakterisere immunsystemet af musen kolon i en stringent og reproducerbar måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Grants #1K08HL088260 og #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), og Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 og BALB/c mus, der anvendes i denne undersøgelse blev enten opdrættet i vores facilitet eller leveres af Jackson Labs eller Taconic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Tags

Immunologi og infektion lymfocytter kolon murine lamina propria colitis transplantation flow cytometri enzymatisk fordøjelse inflammation mononukleære celler
Isolering af lamina propria mononukleare celler fra murine Colon ved hjælp af collagenase E
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, … More

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter