Summary
この方法の目的は、前駆細胞の仕様および機能性を研究するためにインビトロで心臓界特異的心臓前駆細胞を生成し、心臓病モデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成することである。
Abstract
多能性幹細胞は、心臓の発達や病気を理解し、再生医療に大きな可能性を提供します。近年の発達心理学の進歩は多能性幹細胞から心臓細胞を生成することにつながっているが、第1および第2の心臓場(FHFおよびSHF)の2つの心臓界が多能性幹細胞系に誘導されているかどうかは不明である。この問題に対処するために、心臓界特異的心臓前駆細胞のインビトロ仕様および単離のためのプロトコルを生成した。Hcn4-GFPとTbx1-Creを運ぶ胚性幹細胞ラインを使用しました。FHFとSHFのRosa-RFPレポーターは、それぞれ、細胞膜タンパク質Cxcr4の生細胞免疫染色、SHFマーカーである。このアプローチにより、生体内の機能特性とトランスクリプトームを要約する前駆細胞を生成した。我々のプロトコルは、2つの心臓分野の早期の仕様と分離を研究し、心臓病のモデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成するために利用することができる。これはインビトロオルガノイド系であるため、正確な解剖学的情報を提供しない場合があります。しかし、このシステムは、胃の段階胚の貧弱なアクセシビリティを克服し、ハイスループットスクリーンのためにアップスケールすることができます。
Introduction
多能性幹細胞(PSC)の使用は、疾患モデリングおよび薬物療法のための患者特異的筋細胞を用いた心臓再生および個別化医療の分野に革命を起こした1,2,3,4.さらに最近では、心房対心室およびペースメーカー様PSC由来心筋細胞の生成のためのインビトロプロトコルが5、6に開発されている。しかし、心臓の発達を研究し、その後心室特異的な心臓細胞を生成するために、心形成をインビトロで再現できるかどうかは、まだ不明である。
初期胚発生の間、BMP4、WntsおよびアクティビンAなどの分泌された形態素の影響下にある中皮細胞は原始的な筋7を形成する。Mesp1の発現によってマークされた心臓中皮細胞は、心三日月を形成し、次いで原始的な心臓管7、8を形成するために前部および後者に移行する。この細胞の移動群は、心臓前駆細胞(CPC)の2つの非常に異なる集団、すなわち第1および第2の心臓場(FHFおよびSHF)9、10を含む。SHFからの細胞は非常に増殖性と移動性であり、主に心臓管の伸びとループを担当しています。さらに、SHF細胞は心筋細胞、線維芽細胞、平滑筋および内皮細胞に分化し、心臓管に入り、右心室、右心室流出路および両方の心房7、10の大部分を形成する。対照的に、FHF細胞は、左心室および心房11の小さな部分を生み出すので、主に心筋細胞に分化する増殖性および移動性が低い。さらに、SHF前駆体は、THF細胞がHcn4およびTbx511、12、13、14、15を発現する間、Tbx1、FGF8、FGF10およびSix2の発現によって特徴付けされる。
PSCは、すべての3つの胚芽層に分化し、その後、体内の任意の細胞タイプ4、16に分化することができます。したがって、それらは、心臓の発達を理解し、先天性心疾患をもたらす特定の発達欠陥をモデル化するための大きな可能性を提供し、出生時欠損の最も頻繁な原因17。先天性心疾患の大きなサブグループは、チャンバー特異的な心臓異常18,19を含む。しかし、これらは異常な心臓分野の発達に起因するかどうかは依然として不明である。さらに、出生後に増殖する心筋細胞の能力を考えると、心臓再生1、7、20のための心臓組織を作成するための広範な努力があった。心臓室間の生理的および形態学的な違いを考慮すると、PSCを用いたチャンバー特異的心臓組織の生成は非常に重要である。発達心理学の最近の進歩はPSCからの心臓細胞の堅牢な生成につながったが、2つの心臓界がPSCシステムで誘導できるかどうかはまだ不明である。
体外での心生発生を要約し、CPCの仕様と特性を研究するために、以前にPSC由来心臓スフェロイド21、22、23、24の分化に基づくシステムを使用した。最近では、FHF遺伝子Hcn4とSHF遺伝子Tbx1の制御下でGFPおよびRFPレポーターを用いてマウス胚性幹細胞(MESC)をそれぞれ生成した(mESCTbx1-Cre;ローザ RFP;HCN4-GFP) 25.インビトロ分化MESCは、GFP+およびRFP+細胞が中皮細胞の2つの異なる領域から出現し、相補的な方法でパターン化された心臓スフェロイドを形成した。得られたGFP+およびRFP+細胞は、それぞれRNAシーケンシングおよびクローン解析によって決定されたFHFおよびSHF特性を示した。重要なことに、Isl1-RFPレポーター(mESCIsl1-RFP)を搭載したMESCを用いて、SHF細胞が細胞表面タンパク質CXCR4によって忠実にマークされ、トランスジーンのない心臓場特異的細胞の単離を可能にすることが分かりました。本プロトコルは、室内特異的な心臓病を研究するための貴重なツールとして役立つ可能性のあるMESCからの心臓場特異的CPCの生成と単離について説明する。
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Protocol
注:心臓場特異的マウス心臓前駆細胞のインビトロ生成(図1)。
1. マウスESCのメンテナンス
- MESC(MESCTbx1-Cre;ローザ RFP;HCN4-GFP,mESCIsl1-RFP)25上 0.1% (w/v) ゼラチンコーティング T25 フラスコを 2i 培地 (870 mL のグラスコウ最小必須必須培地 (GMEM), 100 mL の胎児ウシ血清 (FBS), 10mL のグルタマックス, 10 mL の非必須ピルビン酸、β-メルカプトエタノールの3 μL、20 μLのリフ(200 U/mL)、0.3 μM CHIR99021および0.1 μM PD0325901。
- 細胞が70-80%の合流率に達したら、リン酸緩衝液(PBS)で細胞を一度すすいでから、トリプシンの1mLを加え、37°Cで3分間インキュベートして単一細胞に解離する。
- ダルベッコの改変イーグルミディアム(DMEM)に10%FBSの4mLを加えてトリプシンを中和する。自動セル カウンタを使用してセルをカウントします。
- 遠心分離機~3 x 105セル 270 x gと室温で3分間。
- 上清を吸引し、2i培地の5mLで細胞を再中断し、0.1%(w/v)ゼラチンコーティングT25フラスコで再プレートを維持する。
2. 心臓スフェロイドを用いた心臓前駆細胞の生成
- 遠心分離機 2.5 x 106細胞ステップ 1.3 から 270 x gおよび室温で 3 分間。
- 上清を吸引し、SFD培地の25mL(105細胞/mL)で細胞を再中断する。実験の規模に応じて、mESC番号はそれに応じて調整することができます。
注:SFD培地は、イコーブの改変ダルベッコミディアム(IMDM)の715 mL、ハムのF12の250 mLを含み、 N2サプリメントの5 mL、B27マイナスビタミンAの10mL、10%の5mL(w/v)BSA(PBS)、グルタマックス7.5mL、ペニシリン連鎖筋腫7.5mL。使用前にアスコルビン酸(50mg/mL)と3.9 x10 -3%(v/v)のモノチオグリセロールを添加します。 - 細胞懸濁液を1つの150mm x 25mmの滅菌プレートにプレートし、48時間の5%CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートし、心臓スフェロイドを24時間以内に形成する必要があります。
- 形成されたすべての心臓スフェロイドと遠心分離機を145 x gと室温で3分間収集し、スフェロイドを選択的に分離し、単一の細胞を避けます。
- 上清を吸引し、分化誘導のためのアクチビンAの1 ng/mLおよびBMP4の1.5 ng/mLのSFD媒体の25 mLでスフェロイドを再中断する。同じ150mm x 25mmの滅菌プレートにスフェロイドをプレートし、5%CO2インキュベーターで37°Cで40時間インキュベートします。
注:アクチビン A (0-3 ng/mL) と BMP4 (0.5-2 ng/mL) の異なる濃度は、mESC ラインに応じて分化の最適化に使用できます。 - 145 x gおよび室温で3分間すべての心臓のスフェロイドおよび遠心分離機を集める。
- 上清を吸引し、SFD培地の25mLでスフェロイドを再中断する。再懸濁したDBを超低アタッチメント75cm2フラスコで転写し、5%CO2インキュベーターで37°Cで48時間インキュベートします。
3. 蛍光レポーターを用した心臓界特異的心臓前駆細胞の単離
- 遠心分離機心臓スフェロイド145 x gと室温3分で上清を吸引する。トリプシンの1 mLを追加し、37 °Cでインキュベート 3分間.
- DMEMに10%FBSの4 mLを追加してトリプシンを不活性化し、ピペッティングでよく混ぜます。解離されていないEBを除去するには、70mmストレーナーを使用してミックスをフィルタリングし、濾過細胞を270 x gおよび室温で3分間遠心分離します。
- 蛍光レポーターを搭載したCPC(MESCTbx1-Creに由来するCPC)ローザ RFP;HCN4-GFP)は、上清を吸引し、500 μLのFACS選別液(1%(v/v)FBS、200 mM HEPESおよびPBSのEDTAの10 mM)を再中断するために追加する。
- ソート前にすべてのセルクラスターを除去するには、40 μm セル ストレーナーを使用して 5 mL ポリスチレン丸底チューブを使用してセルを再度フィルタリングします。ソートするまで細胞を氷の上に保ちます。
- 細胞を並べ替えて Tbx1-Cre を分離します。蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いてローザRFPおよびHCN4-GFP陽性CPC。FBSの1 mLでソートされた細胞を収集します。細胞サンプルとソートされた細胞を4°Cに保ちます。
4. 細胞表面タンパク質マーカーとしてCxcr4を用いて心臓界特異的心臓前駆細胞の単離
- 表面タンパク質受容体Cxcr4の発現に基づいて第1および第2の心臓場CPCを単離するには、mESCIsl1-RFPラインを使用する。ステップ3.3から上清を吸引し、1:200(vol/vol)PerCP-efluor 710結合抗Cxcr4抗体を含むPBSで10%FBSの300 μLで単一のCPCを再中断する。
- 室温で5分間インキュベートし、1~2mLの冷たいPBSを加えて洗浄します。270 x gおよび室温で3分間単一のCPCを遠心分離し、遠心分離が続いてさらに2回洗浄する。
- 上清を吸引し、500 μLのFACS選別ソリューションを追加して、ステップ3.4のように単一のCPCとフィルタを再サスペンドします。
- FACS を使用して Cxcr4+ および Cxcr4- セルを分離します。FBSの1 mLでソートされた細胞を収集します。細胞サンプルとソートされた細胞を4°Cに保ちます。
5. 単離心臓場特異的心臓前駆細胞の解析
- 遠心分離機は、270 x gと室温で3分間CPCをソートしました。ソートされた細胞は、遺伝子およびタンパク質発現解析に使用することも、後の時点での分析のために再培養することもできます。
- 単離されたCPCを再培養するには、上清を吸引し、SFD培地で細胞を再定置し、0.1%(w/v)ゼラチンでコーティングした384ウェルプレートのウェルあたり約3x104細胞を再び振り返す。 細胞死の増加がソート後に指摘された場合は、Y-27632(ROCK阻害剤)の10μMをサンプルに加える。再培養の2日後には、自発的な打撃に留意すべきである。
- メッキCPCが心筋細胞に分化する能力を分析するには、分化の12日目に細胞を集める。ステップ1.2-1.5で説明されているようにトリプシンを使用して、単一のMSを単一のMSを分離し、4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を再中断し、室温で30分間インキュベートして細胞を固定します。
- 895 x gで3分間細胞を遠心分離し、室温を用いた。上清を吸引し、PBSの細胞を再中断してPFAを洗浄する。この手順をもう一度繰り返します。
- 上清を吸引し、PBSで10%FBSで細胞を再中断します。マウス抗トロポニンT抗体(1:500)で細胞サンプルの半分をインキュベートし、残りのサンプルを陰性対照として使用します。室温で30分間インキュベートします。
- PBSを使用してステップ5.4に記載されているように細胞を2回洗浄する。上清を吸引し、1:500ロバ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 647コンジュゲートを使用してPBSの10%FBSで両方の細胞サンプルを再中断します。室温で30分間インキュベートします。
- ステップ5.6のようにPBSで2回洗浄します。上清を吸引し、PBSの200 μLで細胞を再中断する。フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。
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Representative Results
約132時間の分化後、Tbx1-RFPおよびHcn4-GFP CPCを蛍光顕微鏡で検出することができる(図2)。一般に、GFP セルと RFP セルはほぼ同じ時刻に表示されます。CPC の 2 つの母集団は、近接して、一般的に相補的なパターンで拡大し続けています。アクティビン A と BMP4 の濃度を調整すると、FHF 対 SHF CPC のパーセンテージが変化します (図3)。インビトロでのCPC仕様は、主にBMP4の濃度によって決定された。したがって、私たちの心臓スフェロイドシステムは、CPC仕様を研究するために使用することができます。
同様に、Isl1-RFP レポーター mESC 回線を使用して、132 時間の差別化の後、Isl1-RFP+ CPC が表示されます。CPCのCPCの免疫染色後、Isl1-RFP+、Cxcr4+対Isl1-RFP+、Cxcr4-細胞を単離することができる(図4)。
mESC由来CPCが心筋細胞に分化する能力を分析するために、心臓トロポニンTに対する免疫染色は、分化の12日目に行うことができる。FHF細胞が主に筋細胞に分化するモデルと一致して、Hcn4-GFP+CPCに由来する細胞は主に筋原性である(図5A,B)。同様に、Isl1+、CXCR4-CPCに由来する細胞は、Isl1+、CXCR4-CPC(図5CPC)と比較してはるかに高い割合で心筋細胞を生み出す。
時折、MESC は効率的に区別できず、心臓フィールド固有の CPC の非常に低い数値を形成します (図6)。
図 1: 心臓界特異的心臓前駆細胞のインビトロ仕様の概略表図。mESCは48時間以内にスフェロイドを形成する。その後、40時間のアクチビンAおよびBMP4への暴露は、中皮誘導につながる。心臓前駆細胞は約36時間後に発症する。第2または第1の心臓場の前駆子は、蛍光活性化細胞選別を用いてソートすることができる。第2の心臓フィールド細胞は、Hcn4-GFPによってマークされたTbx1-RFP発現対最初の心臓フィールドによってマークされる。あるいは、Isl1-RFPはCPCをマークし、Cxcr4に対してライブ免疫染色を使用して、それぞれ第2対第1の心臓フィールド細胞を表すIsl1+、Cxcr4+対Isl1+、Cxcr4-CPCをソートすることができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:CPC仕様後の心臓スフェロイドの代表的な画像。RFP は Tbx1+ をマークし、GFP は Hcn4+ CPC をマークします。2つの細胞集団は、無料パターンで近接して形成される。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: アクチビンAおよびBMP4の異なる濃度に曝露した後の心臓スフェロイドのフローサイトメトリック分析。2つのモルフォゲンの濃度を調整すると、Tbx1+とHcn4+CPCの異なるパーセンテージにつながります。2つの集団は主にBMP4濃度の調整によって影響を受けた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: Isl1を発現する心臓前駆細胞のフローサイトメトリック解析とCxcr4に対する免疫染色である。心臓前駆体は、最初にIsl1発現に基づいてゲートされ、次いでIsl1+、Cxcr4+対Isl1+、Cxcr4-細胞をソートした。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 心臓トロポニンT用に染色された心臓場特異的CPC由来細胞のフローサイトメトリック分析(A) FHF細胞の高い筋原性電位と一致し、Hcn4-GFP+細胞の高い割合は筋細胞に分化する。(B) MESC由来心筋細胞の分析により、その大部分がHcn4-GFP+である。(C) Cxcr4- CPCは心筋細胞のより高い割合と区別する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:インビトロ分化における失敗/低効率の代表的な細胞測定分析。(A) Hcn4-GFP細胞の形成を示さない132時間の分化後のフローサイトメトリー分析と、Tbx1-RFP+細胞の非常に低い割合を示す。(B) Isl1の非常に低いレベルを発現するMESCの低分化効率。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々のプロトコルでは、心臓スフェロイドおよび単離された心臓場特異的CPCを生成する方法論について説明する。これらは、CPC仕様とその特性のメカニズムを研究するだけでなく、心臓室特異的疾患モデリングのために使用することができます。以前に発表された1つの研究は、2つの蛍光レポーター(Mef2c/Nkx2.5)を用いてmESCラインを用いてインビトロでの心生形成を研究したが、これらのマーカーはいずれも心筋細胞が既に形成されている9.5-10日目に発現される。我々の知るうう上、心臓分野特異的なCPCをインビトロで分離する方法は現在ありません。さらに重要なのは、我々のプロトコルをヒト幹細胞にも適用でき、CXCR4を使用して高レベルのIsl125を発現するSHF CPCを単離できることです。さらに、当社の二重蛍光レポーターmESCラインは、CPCの心臓界の仕様または細胞極性に影響を与える可能性のある化合物および転写因子のライブラリーをスクリーニングするために使用することができます。
プロトコルの重要な手順の 1 つは、MESC の開始数です。低いまたは高い数字を使用すると、心臓スフェロイドのサイズと分化効率に大きな影響を与えます。異なる mESC ラインに対して異なるセル番号(7.5-10 x 104セル/mL)をテストすることをお勧めします。あるいは、心臓スフェロイドの大きさが有意に変動する場合、指定されたサイズのマイクロウェルを含むウェルを有するプレートも再現性を高めるために使用することができる。研究者はまた、中皮誘導の特定のタイミングと持続時間だけでなく、細胞の選別のタイミングに注意する必要があります。さらに、異なるmESCラインでは、心臓スフェロイドでCPCを生成する能力をテストする前に、モルフォゲン濃度の最適化を行う必要があります。古い/期限切れのサイトカインまたは細胞培養培地の使用、またはモルフォゲンの一貫性のない濃度は、分化効率に影響を与えます。最後に、約15〜20回以上通過したmESCラインは、効率的に区別する能力を失っているように見える。
当社の差別化システムは、特定の変更を可能にします。Cxcr4は、蛍光レポーターなしでmESCラインのSHF CPCの唯一のマーカーとして使用することができます。ただし、調査者は、Cxcr4+ と Cxcr4- CPC25を並べ替える前に、Isl1+ CPC の割合を増やすために差別化プロトコルを最適化する必要があります。さらに、アクチビンAは、Wnt3aまたはCHIR99021(GSK3b阻害剤)などの正規Wntアゴニスト/活性化剤で置換することができ、SHF CPC25の仕様をさらに高めることができる。
このプロトコルは、明確に定義された条件、タイムラプスモニタリング、および無制限の数のセルを使用してCPC仕様の研究を可能にします。したがって、胚を分析するのと比較して、より表面的で効率的でコストが低い。それにもかかわらず、心臓界特異的CPCの絶対遺伝子発現値が生体内遺伝子発現レベルと密接に相関しないインビトロシステムである。したがって、我々のシステムでは、BMP4のみ、両方の心臓界からCPCを指定することができ、それぞれの比率を大幅に変更することができます。さらに、分散効率に関して変動性が存在する可能性があります。
結論として、mESC蛍光レポーターラインまたは細胞膜タンパク質の免疫染色を用いて、インビトロおよび単離された心臓場特異的CPCにおける心形成を要約した。これにより、CPC仕様と機能特性を仲介する初期シグナルの研究と、心臓分野/チャンバー特異的先天性心疾患のモデリングが可能になります。
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Disclosures
著者は開示のために何も持っていません。
Acknowledgments
E. T. はマジック・マターズとAHAによって支えられました。C. K. は NICHD/NIH (R01HD086026)、AHA、および MSCRF からの助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
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