Summary
动脉粥样硬化的月酸模型是研究分子水平上致病途径的有用工具,但需要对病变发展进行标准化定量。该协议描述了一种优化的方法,以确定主动脉血管(包括主动脉根、主动脉弓和脑动脉)的病变大小。
Abstract
心血管疾病是世界上死亡的主要原因。在大多数情况下,根本原因是动脉粥样硬化,这是一种慢性炎症性疾病。实验性动脉粥样硬化研究已经阐明了胆固醇和炎症在疾病过程中的作用。这导致了成功的临床试验与药物,以减少动脉粥样硬化的临床表现。在小鼠模型中进行仔细和控制良好的实验可以进一步阐明该病的发病机制,而该疾病尚未完全了解。标准化病变分析对减少实验变异性和增加可重复性具有重要意义。确定主动脉根、主动脉和胸动脉的病变大小是实验性动脉粥样硬化的常见终点。该协议提供一个技术描述,用于在一个鼠标评估所有这些部位的动脉粥样硬化。当材料有限时,该协议特别有用,就像转基因动物被定性时经常出现的情况一样。
Introduction
心血管疾病是世界上死亡的主要原因,缺血性心脏病和中风占每四例死亡中就有一人死亡。大多数病例是由动脉粥样硬化引起的,这种疾病的特点是脂质斑块缓慢积累,大中型动脉有慢性炎症的迹象2。这种疾病通常在几十年内不被注意,直到斑块破裂或侵蚀导致动脉血栓形成,导致缺血组织损伤。
正常动脉由内皮细胞和稀疏分布的平滑肌细胞的内皮瘤层、具有平滑肌细胞和弹性层的介质层以及具有松散结缔组织3的周围新发层组成。LDL 的内印保留偏移动脉粥样硬化发展4.脂蛋白的积累和修饰导致动脉内5的聚集和诱捕。受困和修饰的脂蛋白6引起炎症反应。内皮细胞开始表达粘附分子,如VCAM-1在动脉树的部位有湍流血流,导致招募循环单核细胞和其他白细胞7。渗透的单核细胞分化成巨噬细胞,吞没脂质,随后转化为巨噬细胞泡沫细胞8。
自20世纪80年代中期以来,动脉粥样硬化在小鼠模型中的研究频率越来越高。C57BL/6是这些研究中最常用的近亲小鼠菌株,它被用作大多数转基因菌株9的遗传背景。该菌株于1920年10月建立,其基因组于2002年11日公布。小鼠模型的实验有几个好处:菌落繁殖快,外壳空间高效,近亲繁殖减少实验变异性。该模型还允许基因操作,如靶向基因删除和转基因插入。这导致了对这种疾病的新病理生理学认识和新的治疗目标12。
野生型C57BL/6小鼠天然抵抗动脉粥样硬化。他们有大部分的循环胆固醇在高密度脂蛋白,和复杂的动脉粥样硬化病变没有形成,即使喂食高脂肪和高胆固醇的饮食13。因此,在C57BL/6背景上,高胆固醇小鼠,如Apoe-/-,被用作动脉粥样硬化14、15的实验模型。ApoE的缺乏会损害残留脂蛋白的肝素摄入,并严重干扰脂质代谢。在Apoe-/-小鼠中,循环胆固醇主要在 VLDL 颗粒中,小鼠在常规饮食中形成复杂的动脉粥样硬化斑块。
Ldlr-/-小鼠模仿在家族性高胆固醇血症16的人类中所看到的动脉粥样硬化的发展。Ldlr-/-小鼠需要西方饮食来发展动脉粥样硬化17。西方饮食模仿人类食物的摄入量,通常含有0.15%的胆固醇。LDL受体识别ApoB100和ApoE,并通过内分泌调节LDL颗粒的摄入。LDL受体是低密度脂蛋白从循环中清除肝脏的基础,而造血细胞中的低密度脂蛋白受体表达不影响这一过程。这为Ldlr[/] 细胞的骨髓移植到高胆固醇Ldlr -/-受体和评估动脉粥样硬化发展提供了可能性。骨髓嵌合体通常用于研究造血细胞参与实验性动脉粥样硬化。然而,骨髓移植可能会影响动脉粥样硬化斑块的大小和组成,使得对结果的解释变得模糊不清。
已开发出具有额外基因改变的Apoe-/-和Ldlr----小鼠的不同变异,以研究该疾病的具体过程18。一个例子是携带全长人类APOB100基因19、20的人类APOB100-转基因Ldlr-/-(HuBL)小鼠。这些小鼠在常规饮食中发展高胆固醇血症和动脉粥样硬化。然而,复杂动脉粥样硬化斑块的发展至少需要6个月,较短的实验方案通常使用西方饮食21。与Apoe-/-和Ldlr-/-小鼠相比,很大一部分血浆胆固醇在低密度脂蛋白颗粒中循环,这使得HuBL小鼠具有更人性化的脂蛋白。HuBL小鼠还允许研究人类apoB作为自体抗原22。
动脉粥样硬化的小鼠模型开发具有人类疾病共同特征的复杂动脉粥样硬化斑块。然而,斑块是相当耐破裂与随后心肌梗死。Atherothromis只是偶尔被检测到,并且实验性地具有挑战性的评估23,24,25。建立了斑块破裂的特殊模型,但实验领域缺乏用于评价斑块稳定剂的可靠、可重复的模型。
动脉粥样硬化的定量报告在文献中有很多方面。最近的努力试图标准化实验设计,执行和报告动物研究26。调查人员有不同的偏好和技术,以适应他们的实验室。大多数研究项目也独一无二,它们需要一些协议修改。由于疾病的多因素性质,最佳控制因项目而异。当地条件和缺乏标准化可能导致观察到的疾病发展差异,从而阻碍研究领域的进步。实验变异性的差异也意味着统计功率计算需要基于当地条件下的试点研究。
建议在血管树的几个位置进行动脉粥样硬化的定量。该协议描述如何从主动脉根、主动脉和单只小鼠的胸腔头动脉获得结果,以及离开胸腔主动脉的其余部分进行其他分析。面部制剂允许快速定量主动脉拱门中含脂斑块。如果仔细显示标本,也可以量化胸脑动脉的疾病负担。主动脉根的更耗时的横截面留下几个部分可用于详细评估斑块成分。
Protocol
所有动物实验都需要得到伦理权威的批准。
1. 大塔的小鼠牺牲和微解剖
- 通过CO2窒息和记录重量牺牲鼠标。
- 用 70% 乙醇喷洒鼠标,以避免样品的毛皮污染。将鼠标置于一个苏普林位置。从壶形切口,用梅奥剪刀做一个中线切口,几乎延伸到阴骨。
警告:高百分比乙醇是高度易燃的,可能导致严重的眼睛刺激。采取预防措施。 - 使用23G针通过胸腔壁通过心脏穿刺来驱除小鼠。此过程通常从 20 周大的小鼠中产生 750 μL 的血液。通常,在三钾EDTA涂层管中收集一半的体积,在血清或肝素锂涂层管中收集另一半。轻轻转动管子,使其保持在室温下,直到进一步加工。
- 使用 Mayo 剪刀在中线切割腹膜,以打开腹腔。用组织钳子保持西风处理,并横向切开两侧的围膜,并继续打开隔膜。
- 使用 Mayo 剪刀尽可能横向地穿过肋骨笼来打开胸腔。这将使仪器的广角,而微解剖主塔以后。
- 在右侧灌注液排水器中切开。以颅方向插入一根27G的针,穿过心脏的顶点。将针头固定在左心室,同时缓慢地将鼠标注入10 mL冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS),至少2分钟。
注:有些方案使用甲醛灌注,但这干扰了几种下游应用,如淋巴细胞的免疫性化学分析。因此,本协议中不执行甲醛灌注固定。 - 使用解剖钳和解剖剪刀解剖感兴趣的器官(如淋巴结、脾脏、肝脏、肠道、内脏脂肪垫、肾脏等)。
- 在不损坏主动脉拱门的情况下,在心脏右侧切开气管和食道。切开膜片和将内脏附着在子宫内膜的结构,将心脏、主盘和肾脏原位留在原位。折叠肺部和内脏,用餐巾纸盖住它们,开始对副主动脉淋巴结和腹部主动脉进行逆腹微解剖。
- 以6倍放大的倍率在立体显微镜下开始微解剖。开始解剖主动脉分叉,用杜蒙特钳子提起周围的组织,用Vannas剪刀在张力下切割。
- 继续解剖腹部主颅骨。从主动脉切开腹部分支,并通过隔膜中的主动脉痛点将主动脉近质释放。
注:微解剖需要通过立体显微镜进行精确的手眼协调,这需要一些练习来掌握。
- 继续解剖腹部主颅骨。从主动脉切开腹部分支,并通过隔膜中的主动脉痛点将主动脉近质释放。
- 取出覆盖胸主塔的脂肪组织。仔细解剖胸腺的斜端,以释放主动脉拱与分支。继续在胸腔中尽可能不分泌胡萝卜动脉。在特殊情况下,可以进行颈部解剖,以包括胡萝卜分叉。
- 在实际切割主塔之前,在去离子水、RNase 去污溶液、70% 乙醇和 PBS 中连续冲洗,清洁仪器。用钳子将心脏提起顶点。切主塔靠近心脏,把整个心脏放在一个管与PBS。心脏可以在冰上储存几个小时,然后继续处理和冷冻主动脉根。
- 根据图1A切割主动脉拱门。将主动脉拱门放入含有1mL 4%甲醛的管中过夜,温度为4°C。标本可以以这种方式存储几年,然后再固定和分析。
警告:甲醛可能导致癌症,过敏性皮肤反应,如果吞咽是有害的。根据需要使用个人防护设备。 - 解剖剩余的下降主方,并将其放入RNA稳定溶液中,或将其卡扣冷冻,以便后续的RNA分析或其他应用。优化工作流程,尽量减少解剖时间,对于避免RNA过度降解至关重要。
- 将采血管(在步骤 1.3 中收集)放入离心机。在室温下,以1,500 x g将单独的血浆和血清管旋转15分钟。小心地将血浆和血清转移到微离心管中,并储存在-80°C。收集 EDTA 和肝素化血浆或血清可为多种下游应用留下可能性。
- 将心脏放在软木床上,腹腔侧朝上。用针把心脏固定在软木塞上。用解剖钳子握住心脏底部。
- 使用手术刀切掉心脏的2/3,切割方向是两个腹腔之间的线,手术刀在下垂平面中倾斜20°,在横平面中旋转20°颅骨(图1B)。
- 将主动脉根嵌入最佳切割温度 (OCT) 化合物中,该化合物环绕,但不渗入组织。将心脏底部浸入 OCT 化合物中。用钳子轻轻挤压心脏,用 OCT 填充主动脉根并清除任何气泡。
- 将试样转移到充满 OCT 的低温底部。主动脉根现在应垂直于底部表面。将安装的心脏放在干冰上冷冻。将试样存放在-80°C的拉链锁袋中,直到根据本协议中的第3节进行冷冻剖分。
图1:心和主动脉原形拱门原位。(A) 肺、气管、食道和胸腺被移除,以原位显示主动脉拱门原位在20周大的女性Apoe-/-小鼠在显微图,刻度棒=2毫米的常规食物饮食。虚线表示在何处切割主动脉拱门及其分支。(B) 心脏和主动脉的示意图描述.红色虚线表示在冷冻主动脉根之前切心脏的位置。请点击此处查看此图的较大版本。
2. 主动脉拱门和胸动脉的面分析
- 准备固定床,用于主动脉拱门的面部分析。折叠一段石蜡蜡膜 8 次,使表面平坦 25 mm x 25 mm。用黑色电绝缘胶带包裹,为主塔制作深色背景。在固定床的背面放置一个标签,并使用铅铅笔写鼠标识别号(正常的笔墨在染色过程中将消失)。
- 将主动脉拱门转移到固定床,并在其顶部放置一滴 PBS。开始在立体显微镜下清洁剩余的围周脂肪组织主塔。
- 使用 Vannas 剪刀和 Dumont 钳子轻轻剥去周围所有脂肪组织,而不会操纵或损坏主塔。苏丹四号将明亮地染色脂肪组织,此时清除所有此类组织至关重要。
注:在需要时,始终保持主塔湿润,应用额外的 PBS。
- 使用 Vannas 剪刀和 Dumont 钳子轻轻剥去周围所有脂肪组织,而不会操纵或损坏主塔。苏丹四号将明亮地染色脂肪组织,此时清除所有此类组织至关重要。
- 通过在主动脉流明中引入 Vannas 剪刀来暴露中显面,切开日冕平面中的主动脉。开始从远方向切割上升拱门的外曲率,并继续切开树枝,包括胸腔头动脉。备用下降胸腔区域的背部分。
- 切开较小的曲率并折叠打开主塔以显示中显面。
注:这一步需要精细的运动技能,需要一些练习来掌握。
- 切开较小的曲率并折叠打开主塔以显示中显面。
- 使用 Minutien 昆虫销的钝端将打开的拱门固定到固定床。使用微型嘉实维约针架将针脚固定到位。到位时,将销子轻轻弯曲,远离试样。将主盘平固定在床上,而不拉伸试样。将固定拱朝下存放在 4°C 的培养皿中,里面装满了 PBS。
注:可以在此处暂停该协议。 - 准备苏丹四国的工作解决方案。将 1 g 苏丹 IV 粉末、100 mL 70% 乙醇和 100 mL 丙酮混合在深色瓶子中,轻轻搅拌 10 分钟。无需过滤溶液,如果在室温下保持黑暗,可以使用几个月。如果染色颜色不令人满意,可以做出新的解决方案,使标本再次染色。
警告:丙酮是一种易燃液体,可引起严重的眼部刺激。存放在通风良好的地方,处理时采取预防措施。 - 在实验室的长凳上安排五个培养皿:一个装满了70%乙醇,一个装满苏丹IV工作溶液,两个装满80%乙醇,一个装满PBS。
- 首先,将固定床放在第一个培养皿中,拱朝下,用 70% 乙醇将试样下坡 5 分钟。将标本转移到苏丹四号工作溶液,让它在拱门上染色7分钟。
- 接下来,用80%乙醇冲洗3分钟两次,以去除正常的印面表面。可以调整染色时间以优化结果。最后,在将标本放回原培养皿之前,先在PBS中冲洗。
- 使用立体显微镜获取显微图,放大倍数为数码相机的 10 倍。使用小金属重量(20 mm x 10 mm x 5 mm)拍摄浸在 PBS 中的固定拱门的照片,将固定床固定在培养皿的底部。在主塔旁边放置一个标尺以校准图像。
- 使用图像分析软件(例如 ImageJ)确定病变区域和总中位表面。在缺乏解剖地标来定义主动脉拱门时,测量通常从上升主动脉的开始一下到第一个成本分支(图2A)。使用软件中的区域量化特征手动包围总的内点拱区域。
注:病变定量应以致盲的方式进行,建议第二名调查员确认结果。- 在 ImageJ 中,选择多边形选择工具,然后通过重复单击包围整个拱形区域。然后在分析菜单中选择度量值以在结果窗口中显示总拱区。
- 接下来,将所有苏丹IV色斑块包围在拱门内。苏丹IV是一种乳液色素二氮染料,染色脂质、甘油三酯和脂蛋白,呈橙红色。在 ImageJ 中,选择手绘选择工具,并在按下 Alt 键时包围所有斑块。单击分析菜单中的度量值,在结果窗口中显示无病变的拱区域。
- 计算相对病变面积,方法是从总拱区中减去无病变面积,然后将结果与总拱区除以。
- 小心地固定亚冠和胡萝卜动脉,使病变在胸腔头动脉中进行定量(图2A)。亚环大动脉和普通胡萝卜动脉的病变定量通常非常具有挑战性,没有意义。
- 在 ImageJ 中,在按下移位键时,使用多边形选择工具包围胸动脉的两部分。单击分析菜单中的测量以在结果窗口中显示总胸脑动脉区域。
- 接下来,选择手绘工具,在按下 Alt 键时将胸椎动脉中的所有斑块包围。单击分析菜单中的测量以在结果窗口中显示无病变的胸动脉区域。
- 计算相对病变面积,方法是从总胸脑动脉面积中减去无病变面积,然后将结果与总胸脑动脉面积除以。
图2:动脉粥样硬化病变定量。(A) 主动脉拱门从一个20周大的雄性APOB100-转基因Ldlr-/-(HuBL)小鼠喂养西方饮食10周固定打开和染色的富含脂质的斑块与苏丹IV。 总主动脉拱面面积在显微图中以白色虚线勾勒出,比例尺 = 2 mm。黄色的虚线勾勒出脑动脉的总表面积。(B) 主动脉根横截面在400 μm从主动脉主动脉网,在20周大的雄性Ldlr -/-小鼠喂养西方饮食八周在显微图,刻度栏 = 500μm。黑色虚线勾勒出总容器面积和动脉内染中沾染的油红 O 的动脉粥样硬化病变。请点击此处查看此图的较大版本。
3. 主动脉根的冷冻剖分
- 将低温温度设定在-20°C,截面厚度设置为10μm.将含有主动脉根的OCT块安装在试样支架上,心室组织朝外。开始切割时,微调截面表面的对齐方式,以便与试样支架平行。
- 移除过多的周围 OCT,以便更轻松地收集没有折叠的截面。主动脉根现在应垂直于刀刃,因为心脏的底座正确放置在模具中。
- 收集普通显微镜幻灯片上的初始控制部分,这些部分将被丢弃。第一部分应只包含心肌组织。将切片进度时前进 200 μm。收集部分,用光学显微镜检查进度。
- 接近左心室流出区时,在显微镜下检查每100μm。当观察到血管壁的初始指示时,将速度减慢到50μm。
注:当出现第一个主动脉尖时,这将是收集部分的零点。很难看到尖峰何时准确出现,但准确的定位对于对同一区域的病变进行比较至关重要。 -
将试样倾斜至点零尖,使截面平面与另外两个尖点对齐。这对获得主塔的真正横截面至关重要。绘制主动脉根,指示其出现时出现的尖尖,并计算从零点开始切割的每 10 μm 截面。
- 当出现第二个尖时,将试样再次从尖点稍微倾斜,使试样与第三个尖点对齐。尖尖之间的水平差不应超过50 μm。开始从90μm水平起收集幻灯片上的部分。
- 根据图 3中的幻灯片规划收集部分。如果主动脉根倾斜超过 50 μm,则部分集合可以从 190 μm 开始,以留出更多空间将根位于直线位置。继续切片,直到从零点达到800 μm水平。如果在此级别仍有可见的斑块,则收集范围可扩展到 1,000 μm。
注:在补充图1中介绍了一个简化的幻灯片组织,它可以提高切片速度。应根据项目计划确定最佳幻灯片计划。
-
在收集后修复这些部分。
- 修复收集的油红O染色和皮罗西狼红染色胶原蛋白在4%甲醛10分钟。冲洗在去离子水,干燥,并存储在室温,直到追求与本协议第4节。如果幻灯片应立即沾上油红 O,并且仍然潮湿,则将其放入 60% 异丙醇中 1 分钟,以加快干燥过程。
警告:异丙醇是一种易燃液体,可引起严重的眼部刺激,并可能导致嗜睡或头晕。存放在通风良好的地方,处理时采取预防措施。 - 在冰冷的纯丙酮中固定为免疫组化学或免疫荧光收集的部分10分钟,在室温下干燥30分钟。在-20°C中储存部分。
- 修复收集的油红O染色和皮罗西狼红染色胶原蛋白在4%甲醛10分钟。冲洗在去离子水,干燥,并存储在室温,直到追求与本协议第4节。如果幻灯片应立即沾上油红 O,并且仍然潮湿,则将其放入 60% 异丙醇中 1 分钟,以加快干燥过程。
图 3:主动脉根的串行部分的幻灯片组织。在主动脉根的低温剖面过程中,应收集跨越上升主动脉前 800 μm 的 10 μm 厚部分。需要一个系统的幻灯片组织来获得适合各种应用的节。病变成分分析通常包括脂质的油红O染色和胶原蛋白的皮罗西狼红色染色。其余部分被收集,丙酮固定用于免疫组化学和免疫荧光染色。这个数字已由吉斯特等人30修改。请点击此处查看此图的较大版本。
4. 主动脉根动脉粥样硬化的油红O染色和定量
- 通过在 100 mL 异丙醇中溶解 1 克油红 O 溶液,制备饱和油红 O 溶液。在室温下将溶液在暗瓶中搅拌1小时。饱和溶液可以保存数月。
注:建议指定实验室设备用于油红 O 染色,因为很难清洁与溶液接触的设备。 - 通过将 75 mL 的饱和油红 O 溶液与 50 mL 的去离子水混合,准备工作溶液。在室温下站立10分钟,通过定性滤纸过滤。
- 将幻灯片放入油红色 O 工作溶液中 20 分钟,在自来水中冲洗 5 分钟。
- 为协助组织可视化,用迈尔的血氧素染色1分钟,在温水自来水中冲洗5分钟。所有核现在应该以蓝色染色,调整染色时间以优化结果。
- 将滑轨安装在水性安装介质中(例如,凯撒的甘油明胶)。热凯撒的甘油明胶到40°C,使其在使用前流动。无需干燥滑轨,因为安装介质是水基的。添加盖玻璃时,小心避免气泡形成。
警告:Kaiser的甘油明胶含有苯酚,怀疑引起遗传缺陷。根据需要使用个人防护设备。 - 使用连接到光学显微镜的相机获取数字显微图。通常,整个容器壁和病变边界可以通过50倍的放大倍率清晰地可视化。保存高分辨率图像,最好采用带标签的图像文件格式 (TIFF)。
- 使用计算机辅助图像分析软件系统对病变大小进行分析。油红O是一种液化铬二氮染料,染色中性脂质,并可视化动脉粥样硬化斑块与强烈的红色,这有助于病变定量。
注:病变定量应以致盲的方式进行,建议第二名调查员确认获得的结果。- 使用图像分析软件中的区域量化特征,通过包围主动脉壁的外部弹性层压来定义总容器面积(图2B)。在 ImageJ 中,选择多边形选择工具,然后通过重复单击来包围区域。然后在分析菜单中选择度量值。总容器面积显示在结果窗口中。
- 继续量化容器的中压层中的动脉粥样硬化病变,由内部弹性层状和发光边界定义。通常,在阀门尖上的病变被排除在测量27。在 ImageJ 中,选择手绘选择工具,并在按下 Alt 键时包围所有斑块。在分析菜单中选择度量值,在结果窗口中显示无病变容器区域。
- 计算相对病变面积,方法是从总容器面积中减去无病变区域,然后将结果与总容器面积除以。
注:根据使用的放大倍率在图像分析软件中校准结果,获得以平方微米计的绝对病变面积。
- 使用图像分析软件中的颜色阈值特征来计算总病变区域中的油红 O 正面积的百分比,从而定义病变中的油红色 O 染色区域。
- 在 ImageJ 中,在按下换档键时,使用手绘选择工具包围所有病变区域。在分析菜单中选择度量值以在结果窗口中显示总病变区域。
- 在编辑菜单中选择清除外部。在图像菜单中将图像类型更改为 8 位。
- 通过在图像菜单的调整子菜单中选择阈值,为油红色 O 负区域设置红色阈值。单击"应用"。通过在进程菜单的二进制子菜单中选择此选项,使图像二进制。
注:通常油红O染色因批次而异。因此,仅在同一染色批次中建议使用颜色阈值。结果应随描述阈值的确定和标准化一起显示。 - 通过在分析菜单中选择分析粒子来分析图片,然后单击"确定"。总油红O负病变区域现在显示在摘要窗口中。计算相对油红O正面积,从总病变区域减去油红O负面积,然后除以总病变面积。
Representative Results
在动脉粥样硬化的小鼠模型中,最突出的病变往往在主动脉根和主动脉弓中发展。该协议描述主动脉粥样硬化在主动脉根,主动脉弓,和胸动脉在一个单一的小鼠的定量。胸腔下大头和腹部大头塔的可测量病变只存在于有先天疾病的动物身上。在此协议中,这些部分不分析动脉粥样硬化负担,但保存用于后续的mRNA水平分析或其他分析。主动脉根动脉粥样硬化病变的序列部分通常显示在y轴上的病变大小和x轴28上主动脉网面距离的图形中。真正的横截面对于病变大小定量至关重要。倾斜部分可以高估病变大小,倾斜只有20°可以高估绝对病变表面15%29。然而,计算总容器面积的病变分数会使结果对切片过程中可能的角度差异不太敏感(图4A)。检测组间差异的适当统计方法通常是对方差 (ANOVA) 进行常规双向分析。然后进行 Bonferroni 后测试,以检测特定级别的差异。费舍尔最不显著的差异也可用作ANOVA的后续测试。它降低了类型 II 统计错误的可能性,但不考虑多个比较。此外,计算曲线下的面积或每只小鼠的平均病变大小,并将数据呈现在点图中,以进一步可视化组内的个体变异(图 4B), 可能说明。
油红O是一种脂溶性鲜红的二氮染料,它污渍中性脂质。细胞膜中的极性脂质没有染色。油红O染色可以在新鲜、冷冻或正式固定样品上进行,但不能在石蜡嵌入样品上进行,因为在所需的脱蜡过程中去除脂质。病变脂质积累可以通过颜色阈值对总病变区域的油红O正面积进行定量(图4C)。血氧林产生细胞核的蓝色染色,有助于形象化斑块形态。左右冠状动脉通常偏离主动脉约250 μm从主动脉27,这往往与最突出的病变大小重合。来自此区域的横截面通常显示为具有代表性的结果 (图 4D)。
图4:主动脉根动脉粥样硬化病变。(A) 对喂食西方饮食八周的二十八周大的男性骨髓嵌合体进行了评估,以确定Smad7缺乏T细胞对动脉粥样硬化发展的影响。实验性Ldlr-/-嵌合体接受Cd4-Cre=Smad7fl/fl骨髓,对照组接受Cd4-Cre+Smad7fl/+骨髓。该图显示从八个连续部分的动脉粥样硬化病变区域的定量,从主动脉主阴极显示为整个血管表面的病变部分100 - 800 μm(Cd4-Cre=Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre=Smad7fl/fl /ldlr-/- n = 9,带 Bonferroni 的后测试的双向 ANOVA,图显示平均值 =SEM,大括号表示应变比较的显著性水平。(B) 组合点图和条形图显示主动脉根部分的平均动脉粥样硬化病变区域(Cd4-Cre=Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre=Smad7fl/fl / fl /Ldlr-/- n = 9,学生t-测试) (C) 在病变中的油红色 O 染色区域的馏分 (Cd4-Cre=Smad7fl/+/= Ldlr-/- n = 4, Cd4-Cre=Smad7fl/fl/fl/Ldlr-/- n = 6,学生的 t-test,ns=非显著性) (B-C) 点表示单个小鼠和条形显示均值 =SEM. (D)代表显微图显示油红色 O 染色(红色主动脉根 300 μm 中中性脂质的颜色(从主动脉网(50 倍放大率),刻度条 = 500 μm。 这个数字已由Gisteré等人修改为31。请点击此处查看此图的较大版本。
油红O可用于染色的en face准备大头塔,但该协议使用苏丹IV,另一种方便的脂溶性二氮染料。苏丹IV通过染色脂质、甘油三酯和脂蛋白,清晰地以橙红色显示动脉粥样硬化斑块。去除主动脉拱门代表图像中的黑暗背景可以增强视觉显示(图5A)。通常病变大小在组内正常分布,允许在组之间使用学生 t-test 进行统计测试。 显示单个鼠标和各组之间的均值的点图是显示结果的信息性方法(图 5B-C)。由于组内的变化通常不同,在血管树中的位置之间,通常需要单独的功率计算。方法熟练度和协议标准化可以避免不必要的变异。获得具有统计显著性的结果很重要,但始终需要考虑观察到的差异的生物学相关性。
图5:主动脉弓和胸腔颈动脉的动脉粥样硬化病变。(A) 代表面对主动脉拱门的显微图,上面印有苏丹IV(橙色)的脂质斑块,来自20周大的老鼠,在一起喂食西方饮食10周,一起想象。比例棒 = 2 mm. 人类APOB100-转基因Ldlr-/- (HuBL) 小鼠被作为对照,实验组由 TCR 转基因小鼠组成,具有 LDL 反应性 T 细胞 (BT1) 与HuBL小鼠杂交。(B) 主动脉拱形动脉粥样硬化病变(HuBL n = 10,BT1xHuBL n = 12; 学生的t-测试)。(C) 胸腔性脑动脉的动脉粥样硬化病变(HuBL n = 8,BT1xHuBL n = 9,学生t-测试)。 (B-C)点表示单个小鼠,条形显示平均值 [SEM. ] p = 0.05。 这个数字已由Gisteré等人修改为32。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1:主动脉根的串行部分的幻灯片的替代组织。一个简化的系统幻灯片组织,用于从主动脉根收集部分。该系列使油红O染色的脂质和免疫组化学或免疫荧光染色。省略了胶原蛋白的皮罗西里亚斯红色染色的专用幻灯片。请点击此处下载此文件。
Discussion
心血管疾病是世界上的主要杀手,需要新的预防措施。小鼠疾病模型为病理生理学和实验治疗研究提供了一个综合平台13。可靠的病变大小定量是这种方法的关键。然而,不同实验室的量化方法不同。标准化和优化自1980年代的13、27、33、34以来一直持续进行。主动脉根已成为量化实验性动脉粥样硬化的最流行的地点。斑块的横截面可以比较组之间的斑块体积。在主塔的较大部分,En 面部制剂有利于病变定量。en face 方法可视化斑块数量,实现斑块面积覆盖的量化,但不考虑斑块厚度。在血管树的不同位置的相干结果证实了观测到的差异的生物学相关性。评估不同地点的动脉粥样硬化发展可解决可能的现场特定影响。移植造血细胞对动脉粥样硬化发育的影响,可在高胆固醇Ldlr-/- chimeras中评估。然而,全身照射影响动脉粥样硬化过程与位点特异性效果。更突出的动脉粥样硬化病变是在主动脉根,而减少病变的发展观察到主动脉拱门35。
重要的是,不仅在实验动脉粥样硬化的研究中需要解决病变大小。病变组成也是一个关键参数。几个斑块特征与人类疾病的表现有关36。主动脉根的串行切片留下几个部分可用于仔细分析斑块成分。人类斑块破裂的特点是薄纤维帽,几乎没有平滑肌细胞,胶原蛋白含量稀疏,斑块36有炎症迹象。虽然斑块破裂是小鼠动脉粥样硬化模型中的罕见事件,但斑块稳定性的标记是值得评估的信息。转化方法可以证实小鼠模型的机械性发现,并揭示人类疾病的重要特征31。动脉粥样硬化斑块的炎症状态可以通过VCAM-1、MHCII类、巨噬细胞和淋巴细胞30的免疫组织化学染色来确定。有些方案使用主动脉或胸腔头动脉的冠状平面的纵向部分来测量动脉粥样硬化病变的大小和组成37。但是,这种替代方法仅留下几个要分析的部分,这限制了其应用。
该协议的第一个关键步骤是能够有效地收获主塔。显微镜下的手眼协调需要实践,对微解剖和主动脉拱的后续固定都至关重要。此协议的下一个关键步骤是从主动脉根收集串行部分。应为每个鼠标收集八个连续部分,这需要专注和耐心。方法学熟练程度可以大大加快所述进程。然而,动脉粥样硬化病变定量仍然是一项耗时的任务。新技术、自动处理和小动物成像可能有助于将来对实验性动脉粥样硬化进行量化。动脉粥样硬化的进展是缓慢的,大多数实验协议在小鼠模型需要4个月以上才能完成13。因此,在研究端点中需要以优化的方式收集大数。该协议为高效收获主动脉提供了全面的指南,建议的加工准备主动脉用于多用途,包括主动脉根、主动脉和胸动脉的病变定量。希望该协议能够减少实验变异性,提高结果的可靠性,并得出一些发现,为治疗动脉粥样硬化的新疗法铺平道路。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Gürran K Hansson的实验心血管研究部门的所有成员在过去25年中帮助开发了这一协议。我们特别感谢安东尼诺·尼科尔蒂、周兴华、安娜-卡琳·罗伯逊和英格·博丁的贡献。这项工作得到了瑞典研究理事会349-2007-8703项目赠款06816和Linnaeus支持,以及瑞典心连基金会、斯德哥尔摩郡议会、南娜·斯瓦尔茨教授基金会、Loo和Hans Osterman的赠款支持。医学研究基金会、卡罗林斯卡研究所研究基金会和卡罗林斯卡研究所老年病基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
| Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | - | To create pinning beds for aortic arches. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
| Cork board | Any specialized retailer | - | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
| Deionized water | - | - | For rinsing and preparation of solutions. |
| Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
| Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
| Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
| Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
| Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
| Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| ImageJ | NIH | - | Image analysis software. |
| Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
| Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
| Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
| Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
| Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
| Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
| Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
| Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
| Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
| Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
| Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
| Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
| Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
| Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
| Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Any cell culture supplier | - | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | - | - | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
| Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
| Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
| Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
| Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
| Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
| Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Gistera, A., Hansson, G. K.
- Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
- Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
- Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
- Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
- Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
- Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
- Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
- Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
- Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
- Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J.
- Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
- Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
- Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
- Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
- Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
- Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
- Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
- Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
- Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
- Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
- Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
- Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
- Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
- Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
- Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).
- Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
- Daugherty, A., Whitman, S. C.
- Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
- Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
- Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
- Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).
