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Immunology and Infection

चूहे में एथेरोस्क्लेरोसिस का परिमाण

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59828
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine, University of Southern Denmark (SDU)

Summary

एथेरोस्क्लेरोसिस के Murine मॉडल एक आणविक स्तर पर रोगजनक रास्ते की जांच करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं, लेकिन घाव विकास के मानकीकृत परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल महाधमनी जड़, महाधमनी चाप, और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी सहित प्रमुख धमनी वाहिकाओं में घाव के आकार को निर्धारित करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है।

Abstract

हृदय रोग दुनिया में मौत का मुख्य कारण है। ज्यादातर मामलों में अंतर्निहित कारण एथेरोस्क्लेरोसिस है, जो एक पुरानी सूजन बीमारी के हिस्से में है। प्रायोगिक atherosclerosis अध्ययन रोग की प्रक्रिया में कोलेस्ट्रॉल और सूजन की भूमिका स्पष्ट है. यह दवा एजेंटों है कि atherosclerosis के नैदानिक अभिव्यक्तियों को कम के साथ सफल नैदानिक परीक्षण करने के लिए नेतृत्व किया गया है. रोग के माउस मॉडल में सावधान और अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगों से रोग के रोगजनन को और स्पष्ट किया जा सकता है, जो पूरी तरह से समझ में नहीं आता है। मानकीकृत घाव विश्लेषण प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने और पुन: उत्पादन क्षमता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। महाधमनी जड़, महाधमनी चाप, और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में घाव के आकार का निर्धारण प्रयोगात्मक एथेरोस्क्लेरोसिस में आम समापन बिंदु हैं। इस प्रोटोकॉल एक ही माउस में इन सभी साइटों पर atherosclerosis के मूल्यांकन के लिए एक तकनीकी विवरण प्रदान करता है. प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी है जब सामग्री सीमित है, के रूप में अक्सर मामला है जब आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों की विशेषता जा रहा है.

Introduction

हृदय रोग दुनिया में मृत्यु का मुख्य कारण है जिसमें इस्कीमिक हृदयरोग और स्ट्रोक प्रत्येक चार मौतों में से एक है . अधिकांश मामले एथेरोस्क्लेरोसिस के कारण होते हैं, एक बीमारी जो बड़े और मध्यम आकार की धमनियों2में पुरानी सूजन के लक्षण के साथ लिपिड-ललित प्लेक के धीमी गति से निर्माण की विशेषता है। यह रोग आमतौर पर कई दशकों तक किसी का ध्यान नहीं रहता है जब तक कि प्लेक का टूटना या क्षरण एक धमनी थ्रोम्बोसिस को उजागर नहीं करता है जो इस्कीमिक ऊतक क्षति की ओर जाता है।

एक सामान्य धमनी endothelial कोशिकाओं और विरल वितरित चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ एक intima परत के होते हैं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और लोचदार पटल के साथ एक मीडिया परत, और ढीला संयोजी ऊतक के साथ एक आसपास के adventital परत3. एलडीएल की एक आंत प्रतिधारण atherosclerosis विकास4ऑफसेट . लिपोप्रोटीन का संचय और संशोधन धमनी के भीतर एकत्रीकरण और जाल को जन्म देताहै 5. एक भड़काऊ प्रतिक्रिया फंस और संशोधित लिपोप्रोटीन6द्वारा पैदा की है. Endothelial कोशिकाओं आसंजन अणुओं को व्यक्त करने के लिए शुरू, इस तरह के अशांत रक्त प्रवाह के साथ धमनी के पेड़ में साइटों पर VCAM-1 के रूप में, एक कोशिका कोशिकाओं और अन्य ल्यूकोसाइट्स7घूम की भर्ती के लिए अग्रणी . घुसपैठ करने वाले मोनोसाइट्स मैक्रोफेज में अंतर करते हैं जो लिपिड को आगामी परिवर्तन के साथ मैक्रोफेज फोम कोशिकाओं8में छा जाते हैं .

Atherosclerosis 1980 के दशक के मध्य के बाद से बढ़ती आवृत्ति के साथ माउस मॉडल में अध्ययन किया गया है. C57BL/6 इन अध्ययनों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया inbred माउस तनाव है, और यह आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में आनुवंशिक रूप से संशोधित9. यह विकृति सन् 1920 के10में स्थापित की गई थी और इसका जीनोम 200211में प्रकाशित हुआ था . माउस मॉडल में प्रयोगों के कई लाभ हैं: कालोनियों तेजी से पुन: पेश, आवास अंतरिक्ष कुशल है, और inbreeding प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता कम कर देता है. मॉडल भी आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अनुमति देता है, इस तरह के लक्षित जीन विलोपन और transgenes के डालने के रूप में. इससे रोग की नई समझ और नए चिकित्सा लक्ष्य12.

जंगली प्रकार C57BL/6 चूहों स्वाभाविक रूप से atherosclerosis के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. वे एचडीएल में घूम कोलेस्ट्रॉल के सबसे अधिक है, और जटिल atherosclerotic घावों का गठन नहीं कर रहे हैं यहां तक कि जब एक उच्च वसा और उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार खिलाया13. हाइपरकोलेस्टेरॉलमिक चूहों, जैसे Apoe-/- C57BL/6-पृष्ठभूमि पर, इसलिए atherosclerosis14,15के प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। ApoE की कमी अवशेष लिपोप्रोटीन के यकृत तेज और गंभीर रूप से परेशान लिपिड चयापचय ख़राब करता है। Apoeमें - / - चूहों, घूम कोलेस्ट्रॉल VLDL कणों में मुख्य रूप से है, और चूहों एक नियमित चाउ आहार पर जटिल atherosclerotic प्लेक का विकास.

Ldlr-/- चूहों पारिवारिक hypercholesterolemia16के साथ मनुष्यों में देखा atherosclerosis के विकास की नकल . Ldlr-/- चूहों atherosclerosis17विकसित करने के लिए एक पश्चिमी प्रकार के आहार की जरूरत है. पश्चिमी आहार मानव भोजन का सेवन नकल करता है और आमतौर पर 0.15% कोलेस्ट्रॉल होता है। एलडीएल रिसेप्टर ApoB100 और ApoE पहचानता है और एंडोसाइटोसिस के माध्यम से एलडीएल कणों के तेज मध्यस्थता. एलडीएल रिसेप्टर्स परिसंचरण से एलडीएल के जिगर निकासी के लिए मौलिक हैं, जबकि hematopoietic कोशिकाओं में एलडीएल रिसेप्टर अभिव्यक्ति इस प्रक्रिया को प्रभावित नहीं करता है. यह Ldlrकी अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए संभावना को खोलता है + / + कोशिकाओं hypercholesterolemic Ldlrमें - / अस्थि मज्जा chimeras आमतौर पर प्रयोगात्मक atherosclerosis में hematopoietic कोशिकाओं की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण atherosclerotic प्लेक के आकार और संरचना को प्रभावित कर सकता है, परिणामों की व्याख्या अस्पष्ट बना.

रोग की विशिष्ट प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अतिरिक्त आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ एपो-/- और एलडीआर-/- चूहों के विभिन्न प्रकार विकसित किए गए हैं। इसका एक उदाहरण है मानव APOB100-ट्रांसजेनिक Ldlr-/- (HuBL) चूहे जो पूर्ण लंबाई वाले मानव APOB100 जीन19,20ले जाते हैं . इन चूहों एक नियमित चाउ आहार पर hypercholesterolemia और atherosclerosis का विकास. हालांकि, जटिल एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक के विकास में कम से कम छह महीने लगते हैं और कम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल आमतौर पर पश्चिमी आहार21का उपयोग करते हैं। प्लाज्मा कोलेस्ट्रॉल का एक बड़ा अंश एलडीएल कणों में घूम रहा है, जो HuBL चूहों एक अधिक मानव की तरह dyslipidemic lipoप्रोटीन प्रोफ़ाइल Apoe की तुलना में देता है -/- और Ldlr-/- चूहों. HuBL चूहों भी एक autoantigen22के रूप में मानव apoB के अध्ययन की अनुमति .

एथेरोस्क्लेरोसिस के माउस मॉडल मानव रोग की साझा विशेषताओं के साथ जटिल एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक विकसित करते हैं। हालांकि, प्लेक आगामी मायोकार्डियल इंफार्क्शन के साथ टूटना के लिए काफी प्रतिरोधी हैं। एथेरोट्रोम्बोसिस केवल छिटपुट रूप से पता लगाया जाता है और23,24,25का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक रूप से चुनौतीपूर्ण है . प्लेक टूटना के विशेष मॉडल विकसित किए गए हैं, लेकिन प्रयोगात्मक क्षेत्र में प्लेक स्थिर एजेंटों के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय और पुन: उत्पादन योग्य मॉडल का अभाव है।

साहित्य में एथेरोस्क्लेरोसिस की मात्रा कई मायनों में बताई गई है। हाल के प्रयासों ने प्रायोगिक डिजाइन, निष्पादन, और पशु अध्ययन की रिपोर्टिंग26के मानकीकरण की कोशिश की है। अन्वेषकों विभिन्न वरीयताओं और तकनीकों को अपनी प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलित किया है. अधिकांश अनुसंधान परियोजनाओं को भी एक तरीका है कि वे कुछ प्रोटोकॉल संशोधनों की आवश्यकता में अद्वितीय हैं. रोग की बहुकारक प्रकृति के कारण, इष्टतम नियंत्रण परियोजनाओं के बीच भिन्न होते हैं। स्थानीय परिस्थितियों और मानकीकरण की कमी रोग के विकास में देखा मतभेद हो सकता है, जो अनुसंधान क्षेत्र के अग्रिमों में बाधा. प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता में अंतर भी है कि सांख्यिकीय शक्ति गणना स्थानीय परिस्थितियों के तहत पायलट अध्ययन के आधार पर किया जाना चाहिए मतलब है.

संवहनी पेड़ में कई स्थानों पर एथेरोस्क्लेरोसिस की मात्रा की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे महाधमनी जड़ से परिणाम प्राप्त करने के लिए, महाधमनी चाप, और एक माउस में ब्रैकियोसेफेलिक धमनी, अन्य विश्लेषण के लिए thoracoपेटपेट महाधमनी के बाकी छोड़ने के अलावा. चेहरा तैयारियों से महाधमनी चाप में लिपिड से लदी प्लेक का तेजी से परिमाणीकरण हो जाता है। यदि नमूनों को सावधानीपूर्वक प्रदर्शित किया जाता है तो ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में रोग के बोझ को भी निर्धारित किया जा सकता है। महाधमनी रूट के पार-सेक्शन करने में अधिक समय लगता है, प्लेक संरचना के विस्तृत मूल्यांकन के लिए उपलब्ध कई वर्गों को छोड़ देता है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों नैतिक अधिकारियों द्वारा अनुमोदन की आवश्यकता है.

1. माउस बलिदान और Aorta के Microdissection

  1. सीओ2 asphyxiation और रिकॉर्ड वजन द्वारा माउस बलिदान.
  2. नमूनों के फर संदूषण से बचने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे करें। माउस को एक सुपाच्य स्थिति में रखें। जुगल पायदान से, मेयो कैंची का उपयोग कर एक मिडलाइन चीरा बनाने के लिए यह लगभग नीचे जघन हड्डी के लिए विस्तार.
    चेतावनी: उच्च प्रतिशत इथेनॉल अत्यधिक ज्वलनशील है और गंभीर आंख जलन पैदा कर सकता है. एहतियाती उपाय करें।
  3. छाती की दीवार के माध्यम से हृदय पंचर द्वारा माउस को बाहर निकालने के लिए 23 जी सुई का उपयोग करें। इस प्रक्रिया को आम तौर पर एक 20 सप्ताह पुराने माउस से रक्त के 750 डिग्री सेल्सियस पैदावार. आमतौर पर, एक त्रि-पोटेशियम EDTA लेपित ट्यूब में मात्रा का आधा इकट्ठा और एक सीरम या लिथियम हेपरिन लेपित ट्यूब में अन्य आधा. धीरे से ट्यूबबारी बंद करें और उन्हें आगे के प्रसंस्करण तक कमरे के तापमान पर रखें।
  4. पेट की गुहा को खोलने के लिए मध्य रेखा में पार्श्विक पेरिटोनम को काटने के लिए मेयो कैंची का उपयोग करें। ऊतक संदंश के साथ xiphoid प्रक्रिया पकड़ो और दोनों पक्षों पर बाद में peritoneum खोलने में कटौती और डायाफ्राम खोलने के लिए जारी है।
    1. मेयो कैंची का प्रयोग करें रिब पिंजरे के माध्यम से काटने के रूप में बाद में संभव के रूप में छाती गुहा खोलने के लिए. यह उपकरणों के लिए व्यापक कोण सक्षम हो जाएगा, जबकि बाद में aorta microsecting.
  5. अपफ्यूजन द्रव जल निकासी के लिए सही auricle में एक चीरा बनाओ। हृदय के शीर्ष के माध्यम से कपाल दिशा में 27 जी सुई डालें। सुई को बाएं वेंट्रिकल में स्थिर रखें, जबकि धीरे-धीरे माउस को 10 एमएल आइस-कोल्ड फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ कम से कम 2 मिनट के दौरान perfusing. जिगर के रंग में स्थानांतरण और पालर हो रही का निरीक्षण करें।
    नोट: कुछ प्रोटोकॉल पैराफॉर्मेल्डिहाइड परफ्यूजन का उपयोग करते हैं, लेकिन यह कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप करता है, जैसे लिम्फोसाइटों का इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोई परफ्यूजन निर्धारण नहीं किया जाता है।
  6. शारीरिक संदंश और कैंची विच्छेदन का उपयोग करके ब्याज के अंगों (उदा. लिम्फ नोड्स, तिल्ली, यकृत, आंत, वंसुलिन वसा पैड, गुर्दे, आदि) को अलग करें।
  7. महाधमनी मेहराब को नुकसान पहुँचाए बिना हृदय के दाईं ओर श्वासनली और एसोफैगस काटें। डायफ्राम और संरचनाओं retroperitoneum करने के लिए विसरा संलग्न कट, दिल, ओर्टा, और situ में गुर्दे छोड़ने. फेफड़ों और विसरा caudally दूर गुना और उन्हें एक नैपकिन के साथ कवर करने के लिए पैरा-ओरेटिक लिम्फ नोड्स और पेट महाधमनी के retroperitoneal microdissection शुरू करते हैं.
  8. 6x आवर्धन पर एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत microdissection शुरू करो. Dumont forceps के साथ आसपास के ऊतकों को उठाने और Vannas कैंची के साथ तनाव के तहत काटने से महाधमनी विभाजन विच्छेदन शुरू करते हैं.
    1. पेट के विच्छेदन जारी रखें aorta cranially. महाधमनी से पेट की शाखाओं में कटौती और डायाफ्राम में महाधमनी अंतराल के माध्यम से आसन्न रूप से महाधमनी मुक्त.
      नोट: Microdissection स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, जो मास्टर करने के लिए कुछ अभ्यास लेता है के माध्यम से सटीक हाथ से आँख समन्वय की आवश्यकता है.
  9. वक्ष आवड़ा को कवर करने वाले एडीस ऊतक को निकालें। महाधमनी मेहराब को शाखाओं से मुक्त करने के लिए थाइमस के डोर्सली को सावधानी से विभाजित करें। वक्ष गुहा में कैरोटीड धमनियों को यथासंभव अलग-अलग रूप से विभाजित करना जारी रखें। विशेष मामलों में, ग्रीवा विच्छेदन carotid विभाजन शामिल करने के लिए किया जा सकता है.
  10. वास्तव में माओरता काटने से पहले deionized पानी, RNase decontamination समाधान, 70% इथेनॉल, और पीबीएस में लगातार rinses द्वारा उपकरणों को साफ करें। बल के साथ शीर्ष से दिल लिफ्ट. दिल के करीब aorta कट और पीबीएस के साथ एक ट्यूब में पूरे दिल जगह है. दिल जारी प्रसंस्करण और महाधमनी जड़ cryomounting से पहले घंटे के एक जोड़े के लिए बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  11. चित्र 1कके अनुसार महाधमनी मेहराब को काटें। महाधमनी चाप को एक ट्यूब में डाल दें जिसमें 4% फार्मेल्डिहाइड का 1 एमएल रात भर 4 डिग्री सेल्सियस था। नमूना पिनिंग और विश्लेषण से पहले कई वर्षों के लिए इस तरह से संग्रहीत किया जा सकता है।
    चेतावनी: Formaldehyde कैंसर का कारण बन सकता है, एलर्जी त्वचा प्रतिक्रियाओं, और हानिकारक है अगर निगल लिया. आवश्यकता के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का प्रयोग करें.
  12. शेष अवरोही आवरित और यह एक आरएनए स्थिरीकरण समाधान में डाल दिया या बाद में आरएनए विश्लेषण या अन्य आवेदन के लिए फ्रीज तस्वीर. विच्छेदन समय को कम करने के लिए काम के प्रवाह को अनुकूलित करना अत्यधिक आरएनए गिरावट से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  13. रक्त संग्रह ट्यूब (चरण 1.3 में एकत्र) एक centrifuge में रखो. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1500 x ग्राम पर अलग प्लाज्मा और सीरम ट्यूबों नीचे स्पिन। प्लाज्मा और सीरम को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सावधानी से स्थानांतरित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। दोनों EDTA और heparinized प्लाज्मा या सीरम इकट्ठा कई बहाव अनुप्रयोगों के लिए संभावनाओं को छोड़ देता है.
  14. एक कॉर्क बिस्तर पर दिल को अधर पक्ष का सामना करना पड़ के साथ रखें। शीर्ष के माध्यम से एक सुई के साथ कॉर्क के लिए दिल को ठीक करें। हृदय के आधार को शारीरिक बल के साथ धारण की जाए।
    1. कट की दिशा के साथ दिल के शीर्ष 2/3 को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, जिसमें स्कैल्पल के साथ दो ऑरिकल्स के बीच एक रेखा के रूप में किया जा रहा है, जो कि सैगिटल तल में 20 डिग्री और ट्रांसवर्सल तल में 20 डिग्री कपालीय रूप से होता है (चित्र 1बी)।
  15. इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक में महाधमनी जड़ एम्बेड, जो चारों ओर है, लेकिन ऊतक घुसपैठ नहीं है. OCT यौगिक में दिल के आधार विसर्जित कर दिया. OCT के साथ महाधमनी जड़ को भरने और किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए बल प्स के साथ दिल को धीरे से निचोड़ें।
  16. ओसीटी से भरे क्रायोमोल्ड के नीचे नमूने को स्थानांतरित करें। महाधमनी जड़ अब नीचे की सतह के लंबवत होना चाहिए। फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर घुड़सवार दिल रखो. इस प्रोटोकॉल में धारा 3 के अनुसार cryosectioning पीछा जब तक -80 डिग्री सेल्सियस में ज़िप लॉक बैग में नमूनों स्टोर।

Figure 1
चित्र 1: दिल और स्थिति में महाधमनी चाप. (ए) फेफड़े, श्वासनली, घेघा, और थाइमस को 20 सप्ताह पुरानी मादा एपो में सीटू में महाधमनी चाप प्रदर्शित करने के लिए हटा दिया जाता है -/- एक माइक्रोग्राफ में नियमित चाउ आहार पर माउस, स्केल बार ] 2 मिमी। डॉटेड रेखाएं दर्शाती हैं कि महाधमनी मेहराब और इसकी शाखाओं को काटने के लिए कहाँ है। (ख) हृदय और वाता का योजनाबद्ध चित्रण। लाल रंग में डॉटेड रेखा इंगित करता है कि महाधमनी जड़ को क्रायोमाउंटिंग से पहले दिल को काटने के लिए कहाँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. महाधमनी आर्क और ब्राचिओसेफैल धमनी का एन फेस विश्लेषण

  1. महाधमनी मेहराब के चेहरे विश्लेषण के लिए पिनिंग बेड तैयार करें। एक फ्लैट 25 मिमी x 25 मिमी सतह बनाने के लिए आठ बार पैराफिन मोम फिल्म के एक खंड को मोड़ें। यह काले बिजली के इन्सुलेशन टेप के साथ लपेटें aorta के लिए एक अंधेरे पृष्ठभूमि बनाने के लिए. पिनिंग बिस्तर के पीछे एक लेबल रखें और माउस पहचान संख्या लिखने के लिए लीड पेंसिल का उपयोग करें (सामान्य पेन स्याही धुंधला प्रक्रिया में गायब हो जाएगी)।
  2. महाधमनी मेहराब को पिनिंग बिस्तर पर स्थानांतरित करें और इसके ऊपर पीबीएस की एक बूंद रखें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत शेष periadventititial वसा ऊतक से aorta सफाई शुरू करो.
    1. Vannas कैंची और Dumont forceps का प्रयोग धीरे से जोड़ तोड़ या माओत को नुकसान पहुँचाए बिना सभी आसपास के वसा ऊतक छील. सूडान चतुर्थ वसा ऊतक चमकीले दाग होगा और यह इस बिंदु पर ऐसे सभी ऊतकों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है.
      नोट: जरूरत पड़ने पर अतिरिक्त पीबीएस लगाने के लिए हर समय महावत को नम रखें।
  3. महाधमनी लुमेन में Vannas कैंची शुरू करने के लिए intimal सतह का पर्दाफाश करने के द्वारा कोरोनल विमान में महाधमनी खोलने कट. दूरस्थ दिशा में आरोही मेहराब की बाहरी वक्रता को काटने के लिए शुरू करें और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी सहित शाखाओं को खोलने के लिए जारी रखें। अवरोही वक्ष क्षेत्र के पृष्ठीय भाग को छोड़ दें।
    1. कट कम वक्रता खुला और आंत सतह प्रदर्शित करने के लिए aorta खुला गुना।
      नोट: यह कदम ठीक मोटर कौशल की आवश्यकता है और मास्टर करने के लिए कुछ अभ्यास की जरूरत है.
  4. मिन्यूटिएन कीट पिनों के कुंद अंत का उपयोग करके पिनिंग बिस्तर पर खुले चाप को पिन करें। पिन लगाने के लिए माइक्रो कैस्ट्रोविजो सुई धारक का उपयोग करें। पिनों को नमूना से दूर मोड़ें जब जगह में हों। नमूना खींच के बिना बिस्तर पर aorta फ्लैट पिन. पीबीएस से भरे एक पेट्री डिश में नीचे की ओर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिन किए गए मेहराब को स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  5. सूडान चतुर्थ के एक काम समाधान तैयार करें. सूडान चतुर्थ पाउडर के 1 ग्राम, 70% इथेनॉल के 100 एमएल, और एक अंधेरे बोतल में एसीटोन के 100 एमएल मिक्स और धीरे से 10 मिनट के लिए हलचल। समाधान फिल्टर करने के लिए कोई जरूरत नहीं है और यह महीने के एक जोड़े के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर कमरे के तापमान पर अंधेरा रखा. यदि धुंधला रंग संतोषजनक नहीं है, एक नया समाधान किया जा सकता है और नमूनों को फिर से दाग.
    चेतावनी: एसीटोन एक ज्वलनशील तरल है जो गंभीर आंखों में जलन पैदा कर सकता है। एक अच्छी तरह से हवादार जगह में स्टोर और जब हैंडलिंग एहतियाती उपाय.
  6. प्रयोगशाला बेंच पर पांच पेट्री व्यंजन की व्यवस्था: एक 70% इथेनॉल से भरा, एक सूडान चतुर्थ काम कर समाधान से भरा, दो 80% इथेनॉल के साथ भरा है, और एक पीबीएस से भरा.
    1. नीचे की ओर का सामना करना पड़ चाप के साथ पहले पेट्री डिश में पिनिंग बिस्तर रखकर 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में नमूना rinsing के साथ शुरू करो। सूडान चतुर्थ काम कर समाधान करने के लिए नमूना स्थानांतरण और यह 7 मिनट के लिए मेहराब दाग.
    2. अगले, सामान्य intimal सतह destain करने के लिए दो बार 3 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में कुल्ला. Destaining समय परिणामों को अनुकूलित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. अंत में, मूल पेट्री डिश में वापस नमूना डालने से पहले पीबीएस में कुल्ला.
  7. एक डिजिटल कैमरे से जुड़े 10 बार आवर्धन पर एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर micrographs प्राप्त करें. एक पेट्री डिश के नीचे करने के लिए पिनिंग बिस्तर पकड़ करने के लिए छोटे धातु वजन (20 मिमी x 10 मिमी 5 मिमी) का उपयोग कर पीबीएस में डूबपिन्ड मेहराब की तस्वीरें ले लो। छवि के अंशांकन के लिए ओर्टा के बगल में एक शासक रखें.
  8. घाव क्षेत्र और कुल intimal सतह का निर्धारण करने के लिए एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदा. ImageJ) का प्रयोग करें। महाधमनी मेहराब को परिभाषित करने के लिए शारीरिक स्थलों की कमी के कारण, माप आमतौर पर आरोही महाधमनी के प्रारंभ से पहले इंटरकोस्टल शाखा (चित्र 2क)तक की जाती है। सॉफ्टवेयर में क्षेत्र परिमाणीकरण सुविधा का उपयोग करने के लिए मैन्युअल रूप से कुल intimal चाप क्षेत्र घेर.
    नोट:     घाव परिमाणीकरण एक अंधा फैशन में किया जाना चाहिए और यह सलाह दी जाती है कि एक दूसरे अन्वेषक परिणामों की पुष्टि करता है.
    1. ImageJ में, बहुभुज चयन उपकरण का चयन करें और दोहराए जाने वाले क्लिक द्वारा कुल चाप क्षेत्र को घेर लें। फिर परिणाम विंडो में कुल चाप क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण मेनू में माप का चयन करें।
    2. इसके बाद, सभी सूडान चतुर्थ-सना हुआ पट्टिकाओं को मेहराब में घेर लें। सूडान चतुर्थ एक lysochrome diazo डाई है कि लिपिड दाग है, ट्राइग्लिसराइड्स, और एक नारंगी-लाल रंग के साथ लिपोप्रोटीन. ImageJ में, फ्रीहैंड चयन उपकरण का चयन करें और Alt कुंजी दबाते समय सभी प्लेक को घेर लें। परिणाम विंडो में घाव मुक्त चाप क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण मेनू में उपाय क्लिक करें।
    3. कुल चाप क्षेत्र से घाव मुक्त क्षेत्र घटाकर और फिर कुल चाप क्षेत्र के साथ परिणाम विभाजित करके रिश्तेदार घाव क्षेत्र की गणना।
  9. बाकियोसेफेलिक धमनी में घाव परिमाणीकरण को सक्षम करने के लिए सबक्लेवियन और ग्रीवा धमनियों को सावधानी से पिन करें (चित्र 2क)। उपक्लेव धमनियों और आम ग्रीवा धमनियों में घावों का परिमाण आमतौर पर बहुत चुनौतीपूर्ण है और क्रमशः सार्थक नहीं है।
    1. ImageJ में, पाली कुंजी दबाने के दौरान बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग कर के सभी टुकड़ों को घेर। परिणाम विंडो में कुल ब्रैकियोसेफेलिक धमनी क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण मेनू में माप क्लिक करें।
    2. इसके बाद, फ्रीहैंड चयन उपकरण का चयन करें और ऑल्ट कुंजी को दबाते समय ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में सभी प्लेक को घेर लें। परिणाम विंडो में घाव मुक्त ब्रैकियोसेफेलिक धमनी क्षेत्र को प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण मेनू में माप क्लिक करें।
    3. कुल ब्रैकियोसेफेलिक धमनी क्षेत्र से घाव मुक्त क्षेत्र को घटाकर सापेक्ष घाव क्षेत्र की गणना करें और फिर परिणाम को कुल ब्रैकियोसेफेलिक धमनी क्षेत्र के साथ विभाजित करें।

Figure 2
चित्रा 2: Atherosclerotic घाव परिमाणीकरण. (ए) एक 20 सप्ताह पुराने पुरुष मानव APOB100से महाधमनी चाप -transgenic Ldlr-/- (HuBL) माउस दस सप्ताह के लिए पश्चिमी आहार खिलाया खुला और सूडान चतुर्थ के साथ लिपिड युक्त प्लेक के लिए दाग. कुल महाधमनी चाप सतह क्षेत्र micrograph में सफेद में डॉटेड लाइन के साथ उल्लिखित है, स्केल बार - 2 मिमी. पीले रंग की डॉटेड रेखाएँ ब्रैकियोसेफेलिक धमनी के कुल सतह क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करती हैं। (बी) महाधमनी रूट क्रॉस-सेक्शन पर 400 डिग्री सेल्सियस एक 20 सप्ताह पुराने पुरुष Ldlr में महाधमनी साइनस से - /- माउस आठ सप्ताह के लिए पश्चिमी आहार खिलाया एक micrograph में कल्पना, स्केल बार $ 500 $m. काले रंग में डॉटेड लाइनों कुल पोत क्षेत्र और atherosclerotic घावों तेल लाल ओ के साथ दाग रूपरेखा धमनी intima में स्थानीयकृत. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. महाधमनी रूट का क्रायोसेक्शनिंग

  1. क्रायोस्टैट तापमान को -20 डिग्री सेल्सियस और खंड मोटाई को 10 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। वेंट्रिकुलर ऊतक के बाहर का सामना करने वाले नमूना धारक पर महाधमनी जड़ वाले ओसीटी ब्लॉक को माउंट करें। कटौती करने के लिए शुरू करते समय, ठीक धुन अनुभाग सतह के संरेखण नमूना धारक के समानांतर होने के लिए।
  2. गुना के बिना वर्गों को इकट्ठा करने के लिए यह आसान बनाने के लिए अत्यधिक आसपास के OCT निकालें. महाधमनी जड़ अब चाकू ब्लेड के लंबवत तैनात किया जाना चाहिए यह देखते हुए कि दिल का आधार मोल्ड में सही ढंग से रखा गया था.
  3. साधारण माइक्रोस्कोप स्लाइड, जो खारिज कर दिया जाएगा पर प्रारंभिक नियंत्रण वर्गों ले लीजिए। पहले वर्गों केवल दिल की मांसपेशियों के ऊतकों को शामिल करना चाहिए. उस समय अनुभागिंग को 200 डिग्री तक प्रगति करें। एक अनुभाग ले लीजिए और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ प्रगति की जाँच करें।
  4. जब बाएं वेंट्रिकल बहिर्वाह पथ के करीब हो रही है, माइक्रोस्कोप के तहत हर 100 डिग्री की जाँच करें। जब पोत की दीवार के प्रारंभिक संकेत पाए जाते हैं, तो गति को 50 डिग्री मी तक धीमा कर दें।
    नोट: जब पहला महाधमनी उभयाग्र प्रकट होता है, तो यह खंडों को एकत्र करने के लिए बिंदु शून्य होगा। यह देखना मुश्किल हो सकता है जब cusps बिल्कुल दिखाई देते हैं, लेकिन एक सटीक स्थानीयकरण एक ही क्षेत्र में घावों की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. दो अन्य उभयाग्रों के साथ अनुभाग तल संरेखित करने के लिए बिंदु शून्य उभयाग्र की ओर नमूना झुकाएँ। यह aorta के सच्चे पार वर्गों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. महाधमनी जड़ का एक ड्राइंग बनाओ, cusps का संकेत के रूप में वे दिखाई देते हैं, और हर 10 डिग्री अनुभाग है कि बिंदु शून्य से बाद में कटौती कर रहे हैं गिनती.
    1. जब दूसरा उभयाग्र दिखाई देता है, तो नमूना को तीसरे उभयाग्र के साथ संरेखित करने के लिए नमूना को फिर से उभयाग्र से दूर झुकाएं। उभयाग्रों के बीच का स्तर अंतर 50 डिग्री मी से अधिक नहीं होना चाहिए। 90 उ और उसके बाद की स्लाइडों पर अनुभागों को एकत्र करना प्रारंभ करें।
    2. चित्र 3में स्लाइड योजना के अनुसार अनुभागों को एकत्र करें। यदि महाधमनी मूल 50 डिग्री मीटर से अधिक झुका हुआ है, तो अनुभागों का संग्रह 190 डिग्री मी से प्रारंभ किया जा सकता है, ताकि आगे की गति को सीधे स्थिति में संरेखित किया जा सके। बिंदु शून्य से 800 डिग्री मीटर के स्तर तक पहुँचने तक अनुभागीकरण जारी रखें। यदि इस स्तर पर अभी भी दृश्यमान प्लेक हैं, तो संग्रह को 1,000 डिग्री तक विस्तारित किया जा सकता है।
      नोट: पूरक चित्र 1में एक सरलीकृत स्लाइड संगठन प्रस्तुत किया गया है, जो अनुभागीय गति को बढ़ा सकता है. इष्टतम स्लाइड योजना परियोजना योजना के आधार पर तय की जानी चाहिए।
  6. संग्रह के बाद वर्गों को ठीक करें।
    1. तेल लाल ओ धुंधला और Picrosirius लाल कोलेजन के लिए एकत्र वर्गों को ठीक 10 मिनट के लिए 4% formaldehyde में. deionized पानी में कुल्ला, सूखी, और कमरे के तापमान में स्टोर जब तक इस प्रोटोकॉल में धारा 4 के साथ पीछा. यदि स्लाइड तेल लाल ओ के साथ दाग होना चाहिए अभी और अभी भी गीला कर रहे हैं, उन्हें में जगह 60% isopropanol के लिए 1 मिनट सुखाने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए.
      चेतावनी: Isopropanol एक ज्वलनशील तरल है कि गंभीर आंख जलन पैदा कर सकता है और उनींदापन या चक्कर आना पैदा कर सकता है. एक अच्छी तरह से हवादार जगह में स्टोर और जब हैंडलिंग एहतियाती उपाय.
    2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसी के लिए एकत्र किए गए वर्गों को 10 मिनट के लिए बर्फ के ठंडे शुद्ध एसीटोन में ठीक करें। कमरे के तापमान में 30 मिनट के लिए ड्राइन -20 डिग्री सेल्सियस में स्टोर अनुभाग।

Figure 3
चित्र 3: महाधमनी रूट के सीरियल सेक्शनों के लिए स्लाइड्स का संगठन. आरोही महाधमनी के पहले 800 डिग्री मीटर तक फैले प्रत्येक 10 डिग्री मीटर मोटी खंड के क्रायोसेक्शनिंग के दौरान एकत्र किया जाना चाहिए। विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त अनुभाग प्राप्त करने के लिए एक व्यवस्थित स्लाइड संगठन की आवश्यकता होती है। घाव संरचना का विश्लेषण आमतौर पर लिपिड के लिए तेल लाल ओ धुंधला और कोलेजन के लिए Picrosirius लाल धुंधला भी शामिल है। शेष वर्गों एकत्र कर रहे हैं और एसीटोन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए तय. यह आंकड़ा Gister et al30से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. तेल लाल हे धुंधला और Aortic जड़ें में Atherosclerosis की मात्रा

  1. आइसोप्रोपेनोल के 100 एमएल में 1 ग्राम तेल लाल ओ को भंग करके एक संतृप्त तेल लाल हे विलयन तैयार की जा सकता है। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक अंधेरे बोतल में समाधान हिलाओ. संतृप्त समाधान कई महीनों के लिए रखा जा सकता है।
    नोट: तेल लाल ओ धुंधला के लिए प्रयोगशाला उपकरण नामित करने की सलाह दी जाती है क्योंकि समाधान के साथ संपर्क में रहने वाले उपकरणों को साफ करना मुश्किल है।
  2. 50 एमएल deionized पानी के साथ संतृप्त तेल लाल हे समाधान के 75 एमएल मिश्रण से एक काम समाधान तैयार करें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान में खड़े हो जाओ. एक गुणात्मक फिल्टर कागज के माध्यम से फ़िल्टर।
  3. 20 मिनट के लिए तेल लाल ओ कार्य समाधान में स्लाइड प्लेस 5 मिनट के लिए नल के पानी में कुल्ला.
  4. ऊतक दृश्य की सहायता के लिए, 1 मिनट के लिए मेयर hematoxylin के साथ दाग 5 मिनट के लिए गुनगुना नल के पानी में कुल्ला. सभी नाभिक अब नीले रंग में दाग होना चाहिए, परिणाम का अनुकूलन करने के लिए धुंधला समय समायोजित करें।
  5. एक जलीय बढ़ते माध्यम में स्लाइड माउंट (उदा., कैसर ग्लिसरॉल जिलेटिन). गर्म कैसर के ग्लिसरॉल जिलेटिन 40 डिग्री सेल्सियस के लिए यह उपयोग करने से पहले तरल पदार्थ बनाने के लिए। स्लाइड को सुखाने के लिए आवश्यक नहीं है क्योंकि बढ़ते माध्यम पानी आधारित है। कवर ग्लास जोड़ते समय हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए सावधान रहें।
    चेतावनी: कैसर के ग्लिसरॉल जिलेटिन में फीनॉल होता है, जो आनुवंशिक दोष पैदा करने का संदेह है। आवश्यकता के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का प्रयोग करें.
  6. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे का उपयोग कर डिजिटल micrographs प्राप्त करें. आमतौर पर पूर्ण पोत दीवार और घाव सीमाओं स्पष्ट रूप से 50 बार आवर्धन द्वारा कल्पना की जा सकती है. उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को सहेजें, अधिमानतः टैग किए गए छवि फ़ाइल स्वरूप (TIFF) में.
  7. कंप्यूटर की सहायता से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रणाली का उपयोग कर घाव आकार का विश्लेषण प्रदर्शन। तेल लाल हे एक लाइसोक्रोम डायजो डाई है जो तटस्थ लिपिड को दाग देता है और एक तीव्र लाल रंग के साथ एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक को विज़ुअलाइज़ करता है, जो घाव परिमाणीकरण में सहायता करता है।
    नोट:     घाव परिमाणीकरण एक अंधा फैशन में किया जाना चाहिए और यह सलाह दी जाती है कि एक दूसरे अन्वेषक प्राप्त परिणामों की पुष्टि करता है.
    1. महाधमनी पोत दीवार के बाह्य लोचदार पटल को घेरकर कुल पोत क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में क्षेत्र परिमाणीकरण सुविधा का प्रयोग कीजिए (चित्र 2ख) ImageJ में, बहुभुज चयन उपकरण का चयन करें और दोहराए जाने वाले क्लिक द्वारा क्षेत्र को घेर लें. फिर विश्लेषण मेनू में माप का चयन करें. कुल पोत क्षेत्र परिणाम विंडो में प्रदर्शित किया जाता है।
    2. पोत की आंतरिक परत में atherosclerotic घावों की मात्रा निर्धारित करने के लिए जारी रखें, आंतरिक लोचदार पटल और luminal सीमा द्वारा परिभाषित. आमतौर पर वाल्व उभयाग्रों पर घावों को माप27से बाहर रखा जाता है . ImageJ में, फ्रीहैंड चयन उपकरण का चयन करें और Alt कुंजी दबाते समय सभी प्लेक को घेर लें। परिणाम विंडो में घाव मुक्त पोत क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण मेनू में उपाय का चयन करें।
    3. कुल पोत क्षेत्र से घाव मुक्त क्षेत्र को घटाकर और फिर कुल पोत क्षेत्र के साथ परिणाम विभाजित करके सापेक्ष घाव क्षेत्र की गणना करें।
      नोट: वर्ग माइक्रोमीटर में निरपेक्ष घाव क्षेत्र प्राप्त करने के लिए प्रयुक्त आवर्धन के अनुसार छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में परिणाम ों को कैलिब्रेट करें।
  8. कुल घाव क्षेत्र के तेल लाल हे सकारात्मक क्षेत्र के प्रतिशत की गणना करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक रंग सीमा सुविधा का उपयोग करके घावों में तेल लाल ओ सना हुआ क्षेत्र को परिभाषित करें।
    1. ImageJ में, शिफ्ट कुंजी दबाने के दौरान मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग करके सभी घाव क्षेत्र को घेर। कुल घाव क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण मेनू में उपाय का चयन करें परिणाम विंडो में है।
    2. संपादन मेनू में बाहर साफ़ करें का चयन करें. छवि प्रकार को छवि मेनू में 8-बिट में बदलें.
    3. छवि मेनू के समायोजित सबमेनू में थ्रेशोल्ड का चयन करके तेल लाल हे नकारात्मक क्षेत्र के लिए एक लाल सीमा निर्धारित करें। लागू करें क्लिक करें. छवि बाइनरी प्रक्रिया मेनू के बायनेरी सबमेनू में इस विकल्प का चयन करके बनाओ।
      नोट: आमतौर पर तेल लाल हे धुंधला बैचों के बीच भिन्न होता है. इसलिए, रंग दहलीज केवल एक ही धुंधला बैच के भीतर की सिफारिश की है. परिणाम कैसे सीमा निर्धारित और मानकीकृत किया गया था एक विवरण के साथ प्रस्तुत किया जाना चाहिए.
    4. विश्लेषण मेनू में कणों का विश्लेषण का चयन करके चित्र का विश्लेषण करें और ठीक क्लिक करें। कुल तेल लाल हे नकारात्मक घाव क्षेत्र अब सारांश विंडो में प्रदर्शित किया जाता है. सापेक्ष तेल लाल हे धनात्मक क्षेत्र की गणना कुल घाव क्षेत्र से तेल लाल हे नकारात्मक क्षेत्र को घटाकर और फिर कुल घाव क्षेत्र के साथ विभाजित करके।

Representative Results

एथेरोस्क्लेरोसिस के माउस मॉडल में सबसे प्रमुख घाव महाधमनी जड़ और महाधमनी चाप में विकसित होते हैं। इस प्रोटोकॉल महाधमनी जड़ में atherosclerosis के परिमाणीकरण का वर्णन करता है, महाधमनी चाप, और एक ही माउस में ब्रैकियोसेफेलिक धमनी. वक्ष अवरोही आरोता और पेट के आवरा में मेसुमेय घाव केवल अग्रिम रोग वाले पशुओं में पाए जाते हैं। इस प्रोटोकॉल में, इन भागों atherosclerotic बोझ के लिए विश्लेषण नहीं कर रहे हैं, लेकिन MRNA स्तर या अन्य विश्लेषण के बाद विश्लेषण के लिए बचाया. महाधमनी जड़ में atherosclerotic घावों के सीरियल वर्गों आमतौर पर y-अक्ष पर घाव आकार और एक्स-अक्ष28पर महाधमनी साइनस के लिए दूरी के साथ एक ग्राफ में प्रदर्शित कर रहे हैं। यह सच है पार वर्गों घाव आकार परिमाणीकरण के लिए महत्वपूर्ण हैं. अस्पष्ट वर्गों घाव आकार overestimate कर सकते हैं और केवल 20 डिग्री के झुकाव 15%29द्वारा पूर्ण घाव की सतह overestimate सकता है . तथापि, कुल पोत क्षेत्र के घाव अंश की गणना करने से अनुभागन के दौरान संभावित कोण अंतरों के प्रति परिणाम कम संवेदनशील हो जाता है (चित्र 4क)। समूहों के बीच अंतर का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त सांख्यिकीय विधि आमतौर पर प्रसरण (ANOVA) का एक नियमित रूप से 2-way विश्लेषण है। बोनफेरोनी पोस्ट-परीक्षण ों के लिए कुछ स्तरों पर अंतरों का पता लगाने के लिए किए जाते हैं। फिशर के कम से कम महत्वपूर्ण अंतर भी ANOVA के लिए एक अनुवर्ती परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रकार द्वितीय सांख्यिकीय त्रुटियों की संभावना कम कर देता है, लेकिन कई तुलना के लिए खाता नहीं है. इसके अतिरिक्त, वक्र के नीचे के क्षेत्र की गणना करने के लिए या माउस प्रति औसत घाव आकार का उदाहरण दिया जा सकता है और समूहों के भीतर अलग-अलग भिन्नता को आगे देखने के लिए डेटा को डॉट प्लॉट में प्रस्तुत किया जा सकता है (चित्र 4ख)।

तेल लाल हे एक वसा में घुलनशील उज्ज्वल लाल diazo डाई है, जो तटस्थ लिपिड दाग. कोशिका झिल्ली में ध्रुवीय लिपिड दाग नहीं हैं। तेल लाल हे धुंधला ताजा, जमे हुए, या formalin निर्धारित नमूनों पर किया जा सकता है, लेकिन आवश्यक deparaffinization प्रक्रिया में लिपिड को हटाने के कारण पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों पर नहीं. कुल घाव क्षेत्र के तेल लाल हे धनात्मक क्षेत्र को थ्रेबल करते हुए रंग द्वारा लेशनल लिपिड संचय का परिमाणन किया जा सकता है (चित्र 4 ब्) । हेमेटॉक्सिलिन सेल नाभिक का एक नीला दाग पैदा करता है, जो प्लेक आकारिकी की कल्पना करने में सहायक होता है। दाएँ और बाएँ कोरोनरी धमनियों आमतौर पर महाधमनी साइनस27से लगभग 250 डिग्री के आसपास महाधमनी से अलग हो जाते हैं, जो अक्सर सबसे प्रमुख घाव आकार के साथ मेल खाते हैं। इस क्षेत्र के क्रॉस-सेक्शन अक्सर प्रतिनिधि परिणामों के रूप में प्रदर्शित किए जाते हैं (चित्र 4D) .

Figure 4
चित्रा 4: महाधमनी जड़ में Atherosclerotic घावों. (अ) अट्ठाईस सप्ताह पुराने नर अस्थि मज्जा chimeras आठ सप्ताह के लिए पश्चिमी आहार खिलाया atherosclerosis विकास पर Smad7- कमी टी कोशिकाओं के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए मूल्यांकन किया गया. प्रायोगिक Ldlr-/- chimeras प्राप्त Cd4-Cre+Smad7fl/fl अस्थि मज्जा और नियंत्रण प्राप्त Cd4-Cre+Smad7fl/+ अस्थि मज्जा. ग्राफ आठ लगातार वर्गों से atherosclerotic घाव क्षेत्र के परिमाणीकरण से पता चलता है, 100 - 800 डिग्री कुल पोत सतह के घाव अंश के रूप में प्रदर्शित महाधमनी साइनस से(Cd4-Cre+Smad7fl// n]6, Cd4-Cre+Smad7 fl/fl/Ldlr-/- n $ 9, 2-way ANOVA Bonferroni के बाद परीक्षण के साथ, ग्राफ से पता चलता है मतलब है $SEM, ब्रेसिज़ तनाव तुलना के लिए महत्व के स्तर से संकेत मिलता है). (बी) संयुक्त डॉट साजिश और बार ग्राफ महाधमनी जड़ वर्गों से मतलब atherosclerotic घाव क्षेत्र से पता चलता है (Cd4-Cre+Smad7fl// Ldlr-/- n $6, Cd4-Cre+Smad7fl / Ldlr-/- n ] 9, छात्र के t-test) (C) घावों में तेल लाल ओ दाग क्षेत्र का अंश (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n ] 4, Cd4-Cre+Smad7fl/ /Ldlr-/- n ] 6, छात्र के t-test, ns$non-significant) (B-C) डॉट्स अलग-अलग चूहों और सलाखों के शो का प्रतिनिधित्व करते हैं मतलब है [SEM. (D) प्रतिनिधि micrographs दिखा तेल लाल ओ धुंधला (लाल रंग में महाधमनी जड़ में तटस्थ लिपिड के रंग) 300 $m महाधमनी साइनस से (50x आवर्धन), स्केल बार $ 500 m. *p $ 0.05, * * *p $ 0.001. यह आंकड़ा Gister] एट अल31से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तेल लाल हे en चेहरा तैयार aortas के धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल सूडान चतुर्थ, एक और सुविधाजनक वसा में घुलनशील diazo डाई का उपयोग करता है. सूडान चतुर्थ स्पष्ट रूप से लिपिड, ट्राइग्लिसराइड्स, और लिपोप्रोटीन धुंधला द्वारा एक नारंगी-लाल रंग में atherosclerotic प्लेक कल्पना करता है। एन फेस महाधमनी मेहराब के प्रतिनिधि छवियों में अंधेरे पृष्ठभूमि को हटाने दृश्य प्रदर्शन को बढ़ा सकता है (चित्र 5A) . आमतौर पर घाव आकार आम तौर पर समूहों के भीतर वितरित किया जाता है, समूहों के बीच छात्र टीपरीक्षण के साथ सांख्यिकीय परीक्षण की अनुमति. एक डॉट प्लॉट जो अलग-अलग चूहों और माध्य दोनों को दर्शाता है, जिसकी तुलना समूहों के बीच की जाती है, परिणामों को प्रदर्शित करने का एक सूचनात्मक तरीका है (चित्र 5ठ-ब्)। समूहों के भीतर भिन्नता आम तौर पर संवहनी पेड़ में स्थानों के बीच अलग है के बाद से, अलग शक्ति गणना आमतौर पर आवश्यक हैं. विधि प्रवीणता और प्रोटोकॉल मानकीकरण द्वारा अनावश्यक भिन्नता से बचा जा सकता है। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करना महत्वपूर्ण है, लेकिन एक मनाया अंतर के लिए जैविक प्रासंगिकता हमेशा के रूप में अच्छी तरह से विचार किया जाना चाहिए.

Figure 5
चित्रा 5: महाधमनी चाप और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव। (ए) प्रतिनिधि एन चेहरा महाधमनी मेहराब के साथ लिपिड से लदी प्लेक सूडान चतुर्थ (नारंगी रंग में) के साथ दाग 20 सप्ताह पुराने चूहों से दस सप्ताह के लिए पश्चिमी आहार खिलाया, एक साथ कल्पना की. स्केल बार - 2 मिमी मानव APOB100-transgenic Ldlr-/- (HuBL) चूहों नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया और प्रयोगात्मक समूह एलडीएल-रिएक्टिव टी कोशिकाओं के साथ TCR-ट्रांसजेनिक चूहों शामिल थे (BT1) HuBL चूहों के लिए crossbred. (ख) महाधमनी चाप में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव(हुबल द ] 10 , BT1xHuBL n ] 12; छात्र की टी-परीक्षण). (C) ब्रैकियोसेफैलिक धमनी में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव (हुब्ल एन ] 8, BT1xHuBL n ] 9, छात्र का t-परीक्षण)। (बी-सी) डॉट्स अलग-अलग चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं, सलाखों के मतलब दिखाने के मतलब [SEM. *p $ 0.05. यह आंकड़ा Gister] एट अल32से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: महाधमनी रूट के सीरियल सेक्शनों के लिए स्लाइड्स का वैकल्पिक संगठन. महाधमनी जड़ से वर्गों के संग्रह के लिए एक सरलीकृत व्यवस्थित स्लाइड संगठन. संग्रह लिपिड और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए तेल लाल ओ धुंधला सक्षम बनाता है। कोलेजन के Picrosirius लाल दाग के लिए समर्पित स्लाइड छोड़ दिया जाता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हृदय रोग दुनिया में मुख्य हत्यारा है और नए निवारक माप2की जरूरत है . रोग के माउस मॉडल पैथोफिजियोलॉजी और प्रयोगात्मक उपचार13की जांच के लिए एक व्यापक मंच प्रदान करते हैं । विश्वसनीय घाव आकार परिमाणीकरण इस दृष्टिकोण के लिए आवश्यक है. तथापि, परिमाणीकरण विधियों में प्रयोगशालाओं के बीच अंतर है। मानकीकरण और अनुकूलन 1980 के13,27,33,34के बाद से एक सतत प्रक्रिया रही है . महाधमनी जड़ों प्रयोगात्मक atherosclerosis मात्रा के लिए सबसे लोकप्रिय साइट के रूप में उभरा है. प्लेक के क्रॉस-सेक्शन समूहों के बीच प्लेक वॉल्यूम की तुलना को सक्षम करते हैं। सामना की तैयारी महाराष्ट्रीयन के बड़े क्षेत्रों में घाव परिमाणीकरण के लिए अनुकूल हैं। एन फेस विधि प्लेक मात्रा की कल्पना करती है और प्लेक क्षेत्र कवरेज के परिमाणीकरण को सक्षम करती है, लेकिन खाते में प्लेक मोटाई न लें। मनाया मतभेदों के लिए जैविक प्रासंगिकता संवहनी पेड़ में विभिन्न स्थानों पर सुसंगत परिणामों द्वारा पुष्टि की है. विभिन्न स्थानों पर atherosclerosis विकास का मूल्यांकन संभव साइट विशिष्ट प्रभाव पते. एथेरोस्क्लेरोसिस विकास पर प्रतिरोपित हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन हाइपरकोलेस्टेरॉलर्मिक एल्डलर-/- चिमेरास में किया जा सकता है। हालांकि, पूरे शरीर विकिरण साइट विशिष्ट प्रभाव के साथ atherosclerosis प्रक्रिया को प्रभावित करता है. महाधमनी जड़ में अधिक प्रमुख एथेरोस्क्लेरोटिक घाव विकसित होते हैं, जबकि कम घाव विकास महाधमनी मेहराब35में मनाया जाता है।

महत्वपूर्ण बात यह है कि न केवल घाव आकार प्रयोगात्मक atherosclerosis के अध्ययन में संबोधित किया जाना चाहिए. लेसन संरचना भी एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. मानव में रोग की अभिव्यक्ति के साथ कई पट्टिका विशेषताएं जुड़ी हुईहैं . महाधमनी जड़ के सीरियल सेक्शनिंग प्लेक संरचना के सावधान विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई वर्गों को छोड़ देता है। मनुष्यों में फलक टूटना कुछ चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, विरल कोलेजन सामग्री और प्लेक36में सूजन के लक्षण के साथ एक पतली रेशेदार टोपी की विशेषता है। हालांकि पट्टिका टूटना atherosclerosis के माउस मॉडल में एक दुर्लभ घटना है, पट्टिका स्थिरता के लिए मार्करों का मूल्यांकन करने के लिए जानकारीपूर्ण हैं. अनुवादात्मक दृष्टिकोण माउस मॉडलों से मशीनी निष्कर्षों की पुष्टि कर सकता है और मानव रोग की महत्वपूर्ण विशेषताओं को उजागर कर सकताहै 31. एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक की सूजन स्थिति वीसीएएम-1, एमएचसी श्रेणी द्वितीय, मैक्रोफेज, और लिम्फोसाइट30साइटों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के दाग द्वारा निर्धारित की जा सकती है। कुछ प्रोटोकॉल महाधमनी चाप के कोरोनल तल में अनुदैर्घ्य खंडों का प्रयोग करते हैं या एथेरोस्क्लेरोटिक घाव के आकार और संरचना37को मापने के लिए ब्रैकियोसेफेलिक धमनी का उपयोग करते हैं . हालांकि, इस वैकल्पिक विधि का विश्लेषण किया जा करने के लिए केवल कुछ वर्गों छोड़ देता है, जो अपने अनुप्रयोगों को सीमित करता है.

इस प्रोटोकॉल में एक प्रारंभिक महत्वपूर्ण कदम कुशलता से aortas फसल की क्षमता है. माइक्रोस्कोप के तहत हाथ से आँख समन्वय अभ्यास की आवश्यकता है और दोनों microdissection और महाधमनी चाप के बाद pinning के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल में अगले महत्वपूर्ण कदम महाधमनी जड़ से सीरियल वर्गों का संग्रह है. अस्सी लगातार वर्गों प्रत्येक माउस, जो दोनों ध्यान और धैर्य की आवश्यकता के लिए एकत्र किया जाना चाहिए. मेथोलॉजिकल प्रवीणता वर्णित प्रक्रियाओं को काफी गति दे सकती है। फिर भी, atherosclerotic घाव परिमाणीकरण अभी भी एक समय लेने वाली काम है. नई तकनीक, स्वचालित हैंडलिंग, और छोटे पशु इमेजिंग भविष्य में प्रयोगात्मक atherosclerosis के परिमाणीकरण की सुविधा हो सकती है. एथेरोस्क्लेरोसिस की प्रगति धीमी है और माउस मॉडल में अधिकांश प्रायोगिक प्रोटोकॉलों को13को पूरा होने में चार महीने से अधिक का समय लगता है . इसलिए, aortas अध्ययन समापन बिंदु पर एक अनुकूलित तरीके से एकत्र करने की जरूरत है. यह प्रोटोकॉल कुशलता से महाधमनी फसल के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करता है और प्रस्तावित प्रसंस्करण महाधमनी जड़, महाधमनी मेहराब, और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में घाव परिमाणीकरण सहित बहु-उद्देश्य उपयोग के लिए महाधमनी तैयार करता है। उम्मीद है कि प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं, परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए, और निष्कर्ष है कि atherosclerosis के खिलाफ नए उपचार के लिए मार्ग प्रशस्त होगा करने के लिए नेतृत्व.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पिछले चौथाई सदी में इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में मदद की है कि जीरन के हंससन के प्रयोगात्मक हृदय अनुसंधान इकाई के सभी पिछले सदस्यों को धन्यवाद. हम Antonino Nicoletti, Xinghua झोउ, अन्ना-Karin Robertson, और Inger Bodin द्वारा योगदान के लिए विशेष रूप से आभारी हैं. यह काम परियोजना अनुदान 06816 और Linnaeus समर्थन 349-2007-8703 स्वीडिश अनुसंधान परिषद से द्वारा समर्थित किया गया था, और स्वीडिश हार्ट-लंग फाउंडेशन, स्टॉकहोम काउंटी परिषद, प्रोफेसर नाना Svartz फाउंडेशन, लू और हंस Osterman से अनुदान द्वारा चिकित्सा अनुसंधान के लिए फाउंडेशन, Karolinska Institute's रिसर्च फाउंडेशन और कारोलिंस्का संस्थान में जराचिकित्सा रोगों के लिए फाउंडेशन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer - To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer - For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water - - For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH - Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100 mm x 20 mm) Any cell culture supplier - Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) - - Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.

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References

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