Summary
I Doliolidi, tra cui la specie Dolioletta gegenbauri, sono piccoli zooplancton marina gelatinosi di significato ecologico che si trovano sui sistemi produttivi di scaffale subcontinentale in tutto il mondo. La difficoltà di coltivare questi delicati organismi limita la loro indagine. In questo studio vengono descritti gli approcci di coltivazione per la raccolta, l'allevamento e la manutenzione del doliolide Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Gli zooplancton gelatinosi svolgono un ruolo cruciale negli ecosistemi oceanici. Tuttavia, è generalmente difficile studiare la loro fisiologia, crescita, fecondità e interazioni trofiche principalmente a causa di sfide metodologiche, compresa la capacità di colture. Questo è particolarmente vero per il doliolide, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri si verifica comunemente nei sistemi produttivi di scaffale continentale subtropicale in tutto il mondo, spesso a concentrazioni di fioritura in grado di consumare una grande frazione della produzione primaria giornaliera. In questo studio, descriviamo approcci di coltivazione per la raccolta, l'allevamento e il mantenimento di D. gegenbauri allo scopo di condurre studi di laboratorio. D. gegenbauri e altre specie di doliolid possono essere catturati dal vivo utilizzando obliquamente towed conico 202 m reti a rete da una nave alla deriva. Le colture sono stabilite in modo più affidabile quando le temperature dell'acqua sono al di sotto dei 21 gradi centigradi e sono iniziate da gonozoidi immaturi, fostozoidi in scadenza e grandi infermieri. Le colture possono essere mantenute in vasi di coltura arrotondati su una ruota di plancton che ruota lentamente e sostenuta su una dieta di alghe coltivate nell'acqua di mare naturale per molte generazioni. Oltre alla capacità di stabilire colture di laboratorio di D. gegenbauri, dimostriamo che la condizione di raccolta, la concentrazione di alghe, la temperatura e l'esposizione all'acqua di mare naturalmente condizionata sono tutti fondamentali per la coltura crescita, sopravvivenza e riproduzione di D. gegenbauri.
Introduction
Lo zooplancton rappresenta la più grande biomassa animale dell'oceano, è componenti chiave nelle nate alimentari marine e svolge un ruolo importante nei cicli biogeochimici oceanici1,2. Lo zooplancton, anche se composto da un'enorme diversità di organismi, può essere grossolanamente distinto in due categorie: gelatinose e non gelatinose con pochi taxa intermedi3,4. Rispetto allo zooplancton non gelatinoso, lo zooplancton gelatinoso è particolarmente difficile da studiare a causa delle loro complesse storie di vita5e i loro tessuti delicati sono facilmente danneggiati durante la cattura e la manipolazione. Le specie di zooplancton gelatinose sono, quindi, notoriamente difficili da coltura in laboratorio e generalmente meno studiate rispetto alle specie non gelatinose6.
Tra i gruppi di zooplancton gelatinosi, uno abbondante e di importanza ecologica nell'oceano del mondo sono i Thaliaceani. I tunicati pelagici sono una classe di tunicati pelagici che includono gli ordini Salpida, Piromida e Doliolida7. I Doliolida, collettivamente chiamati doliolidi, sono piccoli organismi pelagici a forma di barile che possono raggiungere un'elevata abbondanza nelle regioni neritiche produttive degli oceani subtropicali. I Doliolidi sono tra i più abbondanti di tutti i gruppi zooplancton4,8. Come alimentatori di sospensioni, i doliolidi raccolgono particelle di cibo dalla colonna d'acqua creando correnti filtranti e catturandole sulle reti di muco9. Tassonomiamente, i doliolidi sono classificati nel phylum Urochordata10. Ancestrali ai cordati, e oltre al loro significato ecologico come componenti chiave dei sistemi pelagici marini, i taliacei sono importanti per comprendere le origini della storia della vita coloniale10,11 e l'evoluzione dei cordati5,7,10,12,13,14.
La storia della vita dei doliolidi è complessa e contribuisce alla difficoltà di coltivarli e sostenerli durante il loro ciclo di vita. Una rassegna del ciclo di vita e dell'anatomia doliolidi può essere trovata in Godeaux etal. Il ciclo di vita del doliolide, che comporta un'alternanza obbligatoria tra le fasi della storia sessuale e asessuata, è presentato nella Figura 1. Uova e spermatozoi sono prodotti dai gonozoidi ermatodici, l'unica fase solitaria del ciclo di vita. I gonozoidi rilasciano spermatozoi nella colonna d'acqua e le uova vengono fecondate internamente e rilasciate per svilupparsi in larve. Le larve si schiudono e si trasformano in ozooidi che possono raggiungere 1-2 mm. Suming suming conducive environmental conditions and nutrition, oozooids become early nurses within 1-2 days at 20 sC and initiate the colonial stages of the life cycle. Gli oozoidi producono cime sul loro stolone ventrale. Queste gemme lasciano lo stolone e migrano verso il cadoforo dorsale dove si allineano in tre file accoppiate. Le doppie file centrali diventano forozoidi e le due file doppie esterne diventano trofozoidi. Questi ultimi forniscono cibo sia all'infermiera che ai forozoidi16,17. I trofozoidi forniscono all'infermiera la nutrizione quando perde tutti gli organi interni. Con l'aumentare dell'abbondanza di trofozoidi, la dimensione dell'infermiera può raggiungere i 15 mm in laboratorio. Man mano che i forozoidi crescono, ingerino sempre più prede planctoniche e raggiungono 1,5 mm di dimensione prima di essere rilasciati come individui17. Un singolo infermiere può rilasciare > 100 forozoidi durante la sua durata18. Dopo che i forozoidi vengono rilasciati dal cadoforo, continuano a crescere e sono la seconda fase coloniale del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 5 mm, ogni forozoide sviluppa un gruppo di gonozoidi sul loro peduncolo ventrale. Questi gonozoidi possono ingerire particelle quando raggiungono 1 mm di lunghezza. Dopo che i gonozoidi hanno raggiunto le dimensioni da 2 a 3 mm vengono rilasciati dal forozoide e diventano l'unica fase solitaria del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 6 mm di dimensione, i gonozoidi diventano sessualmente maturi17. I gonozoidi possono raggiungere 9 mm o più di lunghezza. I gonozoidi sono ermafroditici, lo sperma viene rilasciato a intermittenza mentre la fecondazione degli ovuli avviene internamente16,17. Quando il gonozooid è di 6 mm di dimensione, rilascia fino a 6 uova fecondate. Una coltura di successo richiede il sostegno alle esigenze specifiche di ognuna di queste fasi uniche della storia della vita.
A causa del significato ecologico ed evolutivo dei tualiacei, compresi i doliolidi, c'è bisogno delle metodologie di coltivazione per far progredire la comprensione della biologia unica di questo organismo, della fisiologia, dell'ecologia e della storia evolutiva19 . I Doliolidi hanno notevoli promesse come organismi modello sperimentale nella biologia dello sviluppo e nella genomica funzionale perché sono trasparenti e probabilmente hanno genomi semplificati20,21. La mancanza di metodi di coltivazione affidabili, tuttavia, ne ostacola l'utilità come modelli di laboratorio. Anche se una manciata di laboratori hanno pubblicato risultati basati su doliolidi coltivati, per i nostri approcci di coltivazione della conoscenza e protocolli dettagliati non sono stati pubblicati in precedenza. Sulla base di anni di esperienza, e tentativi di prova ed errore di coltivazione, lo scopo di questo studio era quello di rivedere le esperienze e di condividere i protocolli per la raccolta e la coltivazione di doliolidi, in particolare la specie Dolioletta gegenbauri.
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Protocol
1. Preparazione impianti di coltura per l'allevamento D. gegenbauri
NOTA: tutti i materiali e le attrezzature necessari sono elencati nella Tabella dei materiali.
- Preparare la soluzione 1 M di idrossido di sodio (NaOH), 0,06M di Potassio Permanganate (KMnO 4). Per preparare questa soluzione, sciogliere 400 g di NaOH in 10 L acqua deionizzata. Aggiungere 100 g di KMnO4 alla soluzione NaOH e mescolare bene.
- Preparare una soluzione bisulfite di sodio (NaHSO3)da 0,1 m dissolvendo 100 g di NaHSO3 in acqua deionizzata da 10 L e mescolare bene.
AVVISO: Questi reagenti sono irritanti che possono causare problemi respiratori se inalati. Mettere in una zona ben ventilata come un cappuccio fumatore. Evitare qualsiasi contatto con la pelle. Indossare guanti protettivi, indumenti protettivi, protezione degli occhi e protezione del viso durante la manipolazione. - Prima di stabilire e allevare colture doliolidi in laboratorio, pulire e sterilizzare i vasi di coltura.
- Sciacquare i barattoli di coltura 1.9 L e 3.8 L almeno 3 volte con acqua deionizzata. Lasciare asciugare i tappi a vite, in quanto i tappi non sono inclusi nei seguenti passaggi di pulizia.
- Pulire e sterilizzare i vasetti della coltura di vetro da 1,9 e 3,8 L immergendoli nella soluzione NaOH/KMnO 4. Lasciare in ammollo i barattoli durante la notte.
- Rimuovere i vasetti dalla soluzione NaOH/KMnO4 e immergerli nella soluzione bisulfite di sodio (NaHSO3). Lasciare in ammollo i barattoli durante la notte.
- Rimuovere i vasetti dalla soluzione NaHSO3 e risciacquare accuratamente con acqua deionizzata. Lasciare asciugare i barattoli.
- Posizionare la ruota del plancton (Figura 2) in uno spazio a temperatura controllata (camera ambientale). Elda la temperatura a 20 gradi centigradi. Per una descrizione più dettagliata della ruota personalizzata del plancton, fare riferimento alla Figura supplementare 1.
2. Cultura del fitoplancton
- Ottenere le culture algali dal National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) o altre fonti da utilizzare come cibo per D. gegenbauri. Miscele di due specie flagellolate, tra cui Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740), e una piccola diatoma, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) sono state ottenute dalla NCMA e sono state utilizzate in laboratorio precedente studi per retrovisore i doliodi con successo17.
- Preparare i supporti di crescita L1 e L1-Si22 come raccomandato dal NCMA.
- Seguire le istruzioni fornite dal fornitore per avviare le nuove colture algali.
- Per mantenere le colture stock, utilizzando rigorose tecniche di coltura ascia, trasferire 0,5 mL di vecchia coltura di senescing a 25 mL di nuovi supporti a crescita fresca in sterili tubi di coltura del vetro da 55 mL ogni due settimane.
NOTA: Non è possibile memorizzare le culture algali viventi senza trasferirle regolarmente. Se le culture non saranno utilizzate per lunghi periodi e non è possibile mantenere le colture per tutta la durata del periodo di non utilizzo, si consiglia di riacquistare queste culture algali comuni dalle loro fonti originali (ad esempio, NCMA). - Preparare volumi maggiori di fitoplancton per l'alimentazione di doliolidi in bottiglie di coltura di tessuti plastici puliti da 500 ml contenenti 200 mL di supporti di crescita.
- Fitoplancton inoculato da stock axenici (4 mL) a 200 mL di mezzi di crescita (1:50 didiluizione).
- Incubare a 20 gradi centigradi con un ciclo di luce:scuro di 12:12 h sotto un'illuminazione fredda di luce bianca di 65-85 E/m2. Fiasche di coltura di laici piatte per massimizzare l'illuminazione. Delicatamente vortice cultura ogni giorno.
- Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un contatore di particelle o un microscopio per monitorare la crescita delle colture.
NOTA: Dopo 7-10 giorni dall'inoculazione, le colture flagellate conterranno 105-106 celle / mL e la coltura del diatoma conterrà 104-105 celle / mL. Queste concentrazioni sono sufficienti per mantenere le colture doliolidi. - Avviare nuovi stock di alimentazione ad un minimo di ogni due settimane per fornire biomassa algale sufficiente per sostenere tutte le attività culturali.
3. Collezione di doliolidi selvatici e acqua di mare per la cultura
NOTA: una panoramica degli approcci di raccolta e coltivazione è descritta nella Figura 3. Nella figura 4è disponibile una descrizione della rete e del cod-end di raccolta specializzati.
- Individuare i doliolidi rilevandoli utilizzando reti plancton o sistemi di imaging in situ23.
NOTA: Poiché i doliolidi sono raramente presenti nelle acque superficiali e non sono rilevabili dalla tecnologia di telerilevamento, guidati da una conoscenza prerequisita delle condizioni favorevoli ai doliolidi (vedi Discussione),la presenza di doliolidi deve essere determinata prima del campionamento. - Raccogliere l'acqua di mare ricca di particelle prima di raccogliere doliolidi vivi in preparazione per l'atto di l'idea di una coltura D. gegenbauri.
- Distribuire le bottiglie Niskin montate su una rosetta CTD o attrezzature equivalenti per raccogliere l'acqua dal sito in cui si trovano i doliolidi e dalla profondità contenente le più alte stime di clorofilla una concentrazione stimata da fluometria in situ.
NOTA: La clorofilla viene utilizzata come indicatore delle concentrazioni di particelle. Sulla piattaforma centro-continentale dell'Atlantico meridionale (SAB), la clorofilla del sottosuolo un massimo è di solito vicino al fondo, ma in altre località, potrebbe non esserlo.
- Distribuire le bottiglie Niskin montate su una rosetta CTD o attrezzature equivalenti per raccogliere l'acqua dal sito in cui si trovano i doliolidi e dalla profondità contenente le più alte stime di clorofilla una concentrazione stimata da fluometria in situ.
- Una volta individuati i doliolidi, recuperare gli zooidi dolioidi intatti utilizzando la rete e il merluzzo di merluzzo specializzati. Prima di distribuire la rete, riempire il merluzzo con acqua di mare.
- Da una nave alla deriva, abbassare e sollevare la rete attraverso la colonna d'acqua mantenendo un angolo di traino obliquo di 15 - 25 s e dispiegamento verticale e velocità di recupero non superiore a 15 m / min.
- Una volta che la rete è a bordo, trasferire delicatamente e dividere il contenuto dell'estremità del merluzzo in 3, secchi di plastica da 5 galloni (20 L) ciascuno contenente 10 L di acqua di superficie raccolta dal sito.
NOTA: I nuovi secchi di plastica devono essere condizionati dall'aggiunta di giorni di acqua di mare prima di vivere la raccolta dei doliolidi. L'obiettivo è ridurre la lisciviazione delle sostanze chimiche dalla plastica. Se l'acqua di mare non è disponibile, utilizzare purificato (ad esempio, Milli Q) o acqua di rubinetto priva di contaminanti tossici per condizionare i secchi. - Isolare gli zooidi doliolidi da altri plancton.
- In piccoli lotti (n. 2 L) trasferire plancton misti dal contenuto di traino netto (ora in secchi di plastica da 20 L) a un becher di vetro da 2 L.
- Utilizzando una pipetta di vetro larga (ID 8 mm x 38 cm di lunghezza), sifone con attenzione e trasferimento attivamente nuotando zooidi doliolidi dal becher in vasi di coltura vetro pulito contenenti acqua di mare ricca di particelle raccolti utilizzando bottiglie Di Niskin da dove i doliolidi sono stati Situato.
- Rilasciare delicatamente gli zooidi doliolidi sotto la superficie dell'acqua di mare.
NOTA: Raccogliere gonozoidi, forozoidi contenenti gonozoidi in via di sviluppo associati e stadi infermieristici contenenti trofozoidi collegati (Figura 1).
- Dopo l'aggiunta di doliolidi, aggiungere Rhodomonas sp. coltura ad una concentrazione finale di 5 x 103 – 104 cellule / mL (50 mL di una coltura contenente 5 x 104 – 1 x 105 celle / mL in un barattolo 3.8 L). Questo per determinare se i doliolidi si alimentano attivamente. Quando i doliolidi ingeriscono Rhodomonas sp,il loro tratto digestivo apparirà di colore rosso. Rimuovere gli zooidi che non sembrano nutrirsi.
- Per evitare che i doliolidi rimangano intrappolati nell'interfaccia aria-acqua, evitalo nei barattoli di coltura riempiendo completamente i barattoli con acqua di mare non filtrata ricca di particelle e posizionando un pezzo di involucro di plastica sopra l'apertura del barattolo (89 mm di larghezza).
- Evitare di creare bolle d'aria che possono anche danneggiare gli animali. Avvitare con attenzione il tappo sul vaso e invertire delicatamente il vaso per determinare se sono presenti bolle. Se sono presenti bolle, rimuoverle.
- Dopo che i vasetti sono pieni, pulire l'acqua in eccesso dall'esterno del barattolo.
- Montare ogni barattolo sulla ruota del plancton (Figura 2) posizionando il barattolo sulle barre metalliche verticali ricoperte di tubi di gomma e tra un morsetto in acciaio inossidabile.
- Assicurarsi che la parte posteriore del barattolo sia ammortizzata contro il tubo di gomma. Stringere il morsetto del tubo intorno al barattolo regolando la vite.
- Verificare che il barattolo non si muova una volta fissato in modo sicuro sul posto. Lasciare che i vasetti ruotino a 0,3 rpm per mantenere i doliolidi in sospensione.
AMMONIMento: È importante non stringere troppo il barattolo per evitare che il barattolo si rompa.
- Sulla nave, mantenere le navi di coltura sulla ruota del plancton a 20 gradi centigradi in luce fioca fino a quando non possono essere trasferite alla struttura di coltura di laboratorio.
- Al ritorno in laboratorio, trasferire i barattoli contenenti doliolidi nella struttura di coltura preparata. Montare i vasetti sulla ruota del plancton (vedere il passaggio 3.8) e consentire ai vasetti di continuare a ruotare a 0,3 rpm.
NOTA: Tutti gli allevamento di doliolidi in questo studio sono stati condotti a 20 gradi centigradi.
4. Mantenere le colture D. gegenbauri
- Dalla nave al laboratorio, consentire agli animali di acclimatarsi nei vasi originali alle condizioni di laboratorio per 3 giorni.
- Durante il periodo di acclimatazione, utilizzare un'ampia pipetta di vetro di foro per scambiare il 10% dell'acqua con acqua di mare non filtrata ricca di particelle dal sito di raccolta ogni giorno per 3 giorni.
- Tenere diversi copepodi nel barattolo, ma rimuovere tutti gli altri zooplancton, grandi pellet fecali e grandi particelle aggregate che potrebbero intasare l'apparato filtrante del dolio (rete di muco). Se la coltura è composta da primi infermieri, tenere un grande gonozoide (6 mm) nel barattolo.
NOTA: Non è importante quali specie di copepodi sono incluse nella cultura, ma in questo esperimento, sono state utilizzate le specie più abbondanti presenti da cui sono stati catturati i doliolidi.
- Dopo il periodo di acclimatazione, trasferire zooidi e copepodi doliolidi dal vaso originale in un barattolo di coltivazione pulito contenente l'80% di filtro in fibra di vetro (GF/F) filtrato con acqua di mare e il 20% dell'acqua di mare dal vaso originale. Preparare l'acqua di mare filtrata filtrando l'acqua di mare attraverso un GF/F con una dimensione nominale dei pori di 0,7 m di carta da filtro.
- Mantenere la nuova cultura scambiando il 10% dell'acqua con l'acqua di mare filtrata GF/F ogni 3 giorni e rimuovendo aggregati e pellet fecali. Settimanalmente, trasferiscono gli animali in un nuovo barattolo come descritto al punto 4.2.
- Alimentare i doliolidi mantenendo le concentrazioni di fitoplancton nei vasetti di coltura tra i 40 e i 95 g c/L.
NOTA: Queste concentrazioni imitano le condizioni ambientali che sono noti per sostenere le condizioni di fioritura per D. gegenbauri17. La miscela di specie di alghe varia a seconda dello stadio di vita e del numero di zooidi in ogni vaso. Durante le fasi della prima vita, aggiungere la miscela 1:1 (per contenuto di carbonio) delle alghe cryptomonad (Isochrysis galbana e Rhodomonas sp.) solo. Le specie di prede più grandi possono facilmente intasare l'apparato alimentare dei piccoli infermieri e sviluppare trofozoidi. Aggiungere la diatoma Thalassiosira weissflogii alla miscela di alghe, anche a uguale contenuto di carbonio, quando si nutrono infermieri più grandi, forozoidi e gonozoidi.- Monitorare le concentrazioni di alghe prima e dopo l'alimentazione per guidare la decisione di quanto spesso e quanta alghe aggiungere alle culture. Utilizzare un contatore di particelle per determinare le concentrazioni di alghe, perché le concentrazioni di alghe nei barattoli di coltura sono relativamente diluiti.
- Rimuovere abbastanza zooidi per mantenere le concentrazioni di alghe di 40 – 95 gC/L in modo che i doliolidi rimanenti avranno abbastanza cibo per crescere.
NOTA: La fase di vita più difficile da mantenere con successo in condizioni di laboratorio è lo sviluppo di larve e oozooid (infermiera precoce). Durante questa fase della coltura, mantenere un grande gonozooid (z 6 mm) oltre a diversi copepodi nel vaso con lo sviluppo di larve e oozooidi (20 per 3,8 L vaso). - Trasferire almeno 4 infermiere in un nuovo barattolo da coltura una volta che un minimo di 8 trofozoidi sono visibili sul cadoforo dell'infermiera (Figura 1B).
NOTA: I trohozoidi raddoppieranno ogni 1 – 2 giorni a 20 gradi centigradi. I trofozoidi sono abbastanza grandi da essere visibili ad occhio nudo.- Rimuovere due delle infermiere una volta che le infermiere sviluppano 20 trofozoodi.
- Rimuovere un infermiere quando le infermiere sviluppano > 30 trofozoodi sui loro cadofori. Lasciare che l'infermiera rimanente sviluppi i forozoidi sul suo cadoforo.
- Rimuovere l'infermiera una volta che l'infermiera rilascia fino a 30 forozoidi.
- Ridurre il numero di animali nel barattolo una volta che i forozoidi raggiungono i 3 mm di dimensione.
- Rimuovere tutti i forozoidi tranne quattro quando i forozoidi diventano più grandi (> 5 mm) e hanno sviluppato cluster gonozoidi.
- Ridurre la coltura a due forozoidi quando il numero di cluster gonozoidi aumenta di dimensioni e inizia a nutrirsi.
- Rimuovere i forozoidi una volta che i forozoidi rilasciano fino a 30 gonozoidi.
- Ridurre il numero di gonozoidi da 30 zooidi a 2 per vaso. Lasciare che le uova fecondate vengano rilasciate nel barattolo.
- Rimuovere un gonozooid lasciando un singolo gonozoide nel barattolo una volta che gli oozoidi si sviluppano.
NOTA: Infermieri, forozoidi e gonozoidi abbandonati possono essere utilizzati per semare colture aggiuntive e per condurre ulteriori esperimenti.
- Rimuovere un gonozooid lasciando un singolo gonozoide nel barattolo una volta che gli oozoidi si sviluppano.
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Representative Results
Seguendo le procedure descritte per la raccolta e la coltura del doliolide, D. gegenbauri delineato figura 3, è possibile mantenere una cultura di D. gegenbauri per tutta la sua storia di vita complessa (Figura 1) e sostenerlo per molte generazioni. Anche se la coltivazione di D. gegenbauri è descritta qui, queste procedure dovrebbero essere rilevanti anche per la coltivazione di altre specie doliolidi.
L'acquisizione di zooidi doliolidi sani e intatti richiede l'applicazione di reti specializzate e procedure di traino (Figura 4). Come animali delicati senza strutture dure, è necessario prestare attenzione a ridurre al minimo le procedure che possono causare danni fisici. Questi fattori possono includere turbolenza, pressione e interazioni con le superfici, tra cui la rete, le bolle d'aria e d'aria. Nonostante la loro natura delicata, tuttavia, gli zooidi doliolidi intatti possono essere raccolti utilizzando una rete conica di plancton con un rapporto di diametro di apertura/lunghezza di 1:5 e dotati di un merluzzo non filtrante relativamente grande. Di routine abbiamo usato una rete di plancton da 202 m mesh da 2,5 m (lunghezza) con un'apertura di 0,5 m montata in un cablaggio girelle e dotata di un cod-end non filtrante 4 L (Figura4). Anche se l'effetto della dimensione della maglia di plancton sulla cattura di zooidi di D. gegenbauri coltivabili non è stato sistematicamente studiato, teoricamente, l'uso di una rete con una dimensione di rete più grande può comportare un ulteriore miglioramento in quanto una dimensione della rete più grande ridurre il campo di pressione generato durante il traino. In alternativa, una maggiore dimensione della maglia si tradurrà in un maggiore flusso d'acqua attraverso la rete, potenzialmente dannosi zooidi doliolidi. La velocità di traino e l'angolo netto devono essere ottimizzati per ridurre al minimo il tempo di traino e i danni durante la raccolta. Nella nostra esperienza, abbiamo scoperto che condizioni di traino sufficientemente delicate possono essere raggiunte trainando la rete obliquamente ad un angolo di 15-25 gradi da una nave alla deriva con velocità di dispiegamento e recupero verticali non superiori a 15 m/min. Per orientare la rete verso la direzione del flusso d'acqua, la rete plancton è montata in un cablaggio girevole. Di solito è il caso che la distribuzione dei doliolidi nella colonna d'acqua non sia casuale e generalmente maggiore nella regione con i carichi di particolato più alti24. Pertanto, la colonna d'acqua da sotto il sottosuolo clorofilla massima alla superficie deve essere campionata. Nella bassa piattaforma centrale SAB (20 - 45 m), viene campionata la colonna d'acqua da 1 m dal fondo alla superficie.
Una volta che sono stati raccolti zooidi sani, è fondamentale mantenerli in modo da ridurre al minimo l'esposizione alle superfici. Per ridurre al minimo gli incontri con superfici doliolidi sono tenuti in vasetti arrotondati riempiti con acqua di mare e delicatamente caduto su una ruota di plancton lentamente rotante (Figura 2).
Anche se è teoricamente possibile iniziare una cultura con zooidi di qualsiasi fase di vita, l'esplorazione di successi e fallimenti nella creazione di nuove culture di D. gegenbauri da 6 tentativi tra il 2015 e il 2018 nella Bight dell'Atlantico meridionale suggeriscono che il successo è più spesso ottenuto quando gli zooidi vengono raccolti da acque che sono < 21oC, e quando vengono utilizzate stadi di vita diversi dai gonozoidi grandi maturi per iniziare una nuova cultura (Tabella 1 e Tabella 2). In pratica, è utile, o almeno non dannoso, includere più fasi di vita degli zooidi doliolidi quando si invita una nuova cultura.
Il successo nel sostenere una cultura di D. gegenbauri, come è stato descritto per altre specie di tunicati pelagici20, dipende dal fornire sufficiente, ma non eccessivo, diversità alimentare e alimentare necessaria per sostenere ogni fase della vita. Poiché i requisiti di dieta variano durante l'intero ciclo di vita, la quantità di alghe fornita ad ogni tempo di alimentazione deve essere variata per mantenere le concentrazioni di cibo ai livelli target desiderati (40 – 95 g C/L) (Tabella 3). Concentrazioni al di sopra o al di sotto di questi livelli possono comportare un aumento dei tassi di mortalità (G.A. Paffenh-fer pers. comm.). Anche se la dieta naturale di D. gegenbauri rimane poco compresa6, le colture possono essere mantenute fornendo miscele relativamente semplici di alghe coltivate e utilizzando procedure che consentono a diverse comunità microbiche di stabilirsi in la cultura. Aumentare la potenziale diversità del campo delle prede si ottiene trattenendo una frazione di acqua carica di particelle proveniente da colture più vecchie e l'inclusione di un piccolo numero di copepodi viventi e grandi doliolidi ad ogni cambiamento o trasferimento dell'acqua. Presumibilmente, questi organismi elaborano alghe e materiale detritico e servono a diversificare le dimensioni delle particelle e lo spettro di qualità disponibili per la nutrizione dei doliolidi, ma sono necessari ulteriori studi per confermare questa ipotesi.
La disponibilità di colture doliolidi fornisce i mezzi per studiare, in condizioni sperimentali controllate, molti aspetti importanti della biologia doliolide, fisiologia, ecologia e biologia molecolare. Ad esempio, sebbene i doliolidi siano abbondanti in numerose regioni dell'oceano costiero e siano i principali pascoli planctonici25, i dati sui tassi di alimentazione e crescita rimangono scarsi26. L'utilizzo di colture di D. gegenbauri, un centro della ricerca basata sulla cultura è stato quello di quantificare i tassi di alimentazione e crescita in risposta a parametri ambientali critici tra cui temperatura e concentrazioni alimentari26. I risultati di questi studi hanno indicato che i tassi di clearance sono simili a concentrazioni da 20 a 60 g c/L e diminuiscono con l'aumentare delle concentrazioni di cibo (Figura 5A). I tassi di sdoganamento aumentano proporzionalmente rispetto agli intervalli di temperatura a sostegno della crescita di D. gegenbauri (Figura5B). I tassi di crescita (k) variano da 0,1 a 0,7/giorno in funzione della temperatura e della disponibilità di cibo (Figura 6). Questi studi, oltre a fornire informazioni pratiche per la coltura, hanno permesso di determinare le relazioni quantitative tra l'alimentazione dei doliolidi e i tassi di crescita in funzione dei parametri ambientali e forniscono informazioni critiche la biologia e l'ecologia dei doliolidi necessari per includere questo importante gruppo di zooplancton in quadri di modellazione27.
Figura 1: Il ciclo di vita D. gegenbauri a 20 gradi centigradi.
Il disegno del ciclo di vita (1A) è stato modificato dopo Walters et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ruota del plancton utilizzata per la coltura D. gegenbauri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Panoramica schematica di D. gegenbauri approccio di raccolta e coltivazione.
Raccolta in mare (A), trasferimento da secchi concentrati a piccoli bicchieri di vetro in piccoli lotti (B), isolamento degli zooidi doliolidi in barattoli di coltivazione contenenti acqua di mare ricca di particelle (C), manutenzione sulla ruota del plancton per tutto il ciclo di vita (D,E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rete di plancton e distribuzione.
Distribuzione (in alto a sinistra), recupero (in alto a destra) e schema dell'estremità netta e del merluzzo (in basso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Tassi di sdoganamento delle alghe D. gegenbauri gonozooidi.
(A) relazione tra (A) Tassi medi di sdoganamento (mL/zooid/giorno) e concentrazione di fitoplancton (g C/L) per tre misure di D. gegenbauri gonozooid. Ogni punto rappresenta 4-11 osservazioni. (B) Tassi medi di sdoganamento (mL/zooid/giorno) rispetto alla temperatura (C) per tre taglie di d. gegenbauri gonozooid. Ogni punto rappresenta 4-12 osservazioni. Le dimensioni dei Gonozoidi
sono 2,5
mm ( ), 4,5 mm ( ) e 6,5 mm (
). Le cifre sono state ridisegnate con il permesso26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Tassi di crescita D. gegenbauri gonozooid.
Relazione tra (A) Tassi medi di crescita (K) contro concentrazione di fitoplancton (G C/L) per tre taglie di gonozoidi Doliogebauri. Ogni punto rappresenta 4-11 osservazioni. (B) Tassi medi di crescita (k) rispetto alla temperatura (C) per tre taglie di gonozoidi Dolioletta gegenbauri. Ogni punto rappresenta 4-12 osservazioni. Le dimensioni dei Gonozoidisono 2,5mm ( ), 4,5 mm ( ) e 6,5 mm (). Le figure sono state ridisegnate con il permesso di Gibson e Paffenh-fer26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tabella 1. Condizioni oceanografiche e abbondanza di Doliolid | |||||||||||
| superficie | Fondoschiena | superficie | Fondoschiena | superficie | Fondoschiena | Abbondanza di Doliolid | |||||
| data | ID crociera | Latitudine (N) | Longitudine (W) | Profondità (m) | Temperatura (0C) | Temperatura (0C) | Salinità (PSU) | Salinità (PSU) | Chla (G/L) | Chla (G/L) | zooidi/m3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | Na | 0.20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | Na |
| NA: dati non disponibili | |||||||||||
Tabella 1: condizioni oceanografiche e abbondanza di doliolidi sulla piattaforma centrocontinentale South Atlantic Bight all'ora e alla posizione in cui D. gegenbauri zooidi sono stati raccolti e utilizzati per avviare nuove culture.
| Tabella 2. Risultati dei tentativi di Recupero di D. gegenbauri | ||||
| data | ID crociera | Raccolte negli zooidi | risultato | Commenti |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Gonozoidi grandi (6-7 mm) sessualmente maturi | fallito | Tutti i gonozoidi erano morti dopo 4 giorni. Oozooid e le prime fasi di vita dell'infermiera sono stati prodotti, ma non sono riusciti a prosperare. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Gonozoidi grandi (8-10 mm) sessualmente maturi | fallito | Gonozoidi morì poco dopo la raccolta. Oozooidi e primi infermieri sono stati prodotti, ma non è riuscito a prosperare. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Raccolta mista comprendente infermiera in ritardo (4-5 mm) con trofozoidi collegati, gonozoidi di grandi dimensioni sessualmente maturi (6 mm) e oozooidi (2 mm) | di successo | Coltivati per 4 generazioni complete, ulteriori gonozoidi e infermieri raccolti a gennaio e marzo 2016 sono stati aggiunti alla cultura. Il laboratorio è stato evacuato per 4 giorni durante l'uragano Matthew nell'ottobre 2016 e la cultura non è sopravvissuta. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Collezione mista comprendente gonozoidi (1,5-5 mm) e grandi forozoidi (6 mm) con gruppi gonozoidi collegati | di successo | Coltivati per 4 generazioni complete, ulteriori gonozoidi raccolti nell'aprile 2017 sono stati aggiunti alla cultura. Ha terminato la cultura nel settembre 2017 in anticipo rispetto all'uragano Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozoidi (3-6 mm) | fallito | Grande gonozooid morì dopo 1 giorno. Il gonozoide immaturo sopravvisse in cultura per 14 giorni. Le uova sono state rilasciate da entrambi i gonozoidi. Gli oozooidi sono stati prodotti, ma non sono riusciti a svilupparsi in stadi infermieristici. La cultura fallì dopo 1 mese. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Grande (6-7 mm) infermiera in ritardo senza trofozoidi | di successo | In coltura l'infermiera ha prodotto trofozoidi. La cultura è stata mantenuta per 3 generazioni ed è stata terminata alla fine di giugno 2018 quando sono stati conclusi gli esperimenti. |
Tabella 2: Risultato dei tentativi di stabilire colture di laboratorio di D. gegenbauri raccolti dalla piattaforma continentale del Sud Atlantic Bight.
| Dolioletta gegenbauri | numero zooid per | numero zooid per | |||
| fase della vita | 3,9 L barattolo | vaso da 1,9 L | Isochrysis galbana | Rhodomonas sp. | Thalassiosira weissflogii |
| oozooid | 20 | 10 | includere | includere | NON INCLUDERE |
| infermiera precoce | 20 | 10 | includere | includere | NON INCLUDERE |
| infermiera in ritardo con 8 trofozoidi | 4 | 2 | includere | includere | includere |
| infermiera in ritardo con 20 trolozoidi | 2 | 1 | includere | includere | includere |
| infermiera in ritardo con 30 trolozoidi | 1 | 1 | includere | includere | includere |
| forozoide (da 1 a 3 mm) | 30 | 15 | includere | includere | includere |
| ammasso gonozoide ovozooide (> 5 mm) | 2 | 1 | includere | includere | includere |
| gonozoide (da 1 a 3 mm) | 30 | 15 | includere | includere | includere |
| gonozoide (> 5 mm) | 2 | 1 | includere | includere | includere |
| Le concentrazioni obiettive di alghe devono essere mantenute tra i 40 e i 95 g di C/L con miscele uguali (per contenuto di carbonio) di ciascuna specie algale | |||||
Tabella 3: Condizioni di coltura di destinazione per D. fase del ciclo di vita di gegenbauri.
Figura supplementare 1: descrizione dettagliata della ruota personalizzata del plancton. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
La capacità di coltura doliolidi è stata stabilita nel corso degli ultimi decenni ed è stata utilizzata per sostenere la ricerca in diversi settori. Studi sperimentali nei nostri laboratori hanno sostenuto la pubblicazione di almeno 15 studi scientifici incentrati sull'alimentazione e la crescita18,26, riproduzione18,28, dieta6, 29, fisiologia30, ecologia31, e modellazione ecologica27 di doliolidi.
Anche se la cultura di questi delicati animali è attualmente laboriosa e dispendiosa in termini di tempo, la coltivazione dei doliolidi è fattibile e, se intrapresa dalla comunità più ampia, favorirà il progresso della comprensione di questo aspetto ecologico e gruppo di animali di importanza evolutiva. L'obiettivo di questo studio era descrivere gli attuali approcci per la raccolta, l'allevamento e il mantenimento di D. gegenbauri nella coltura allo scopo di condurre studi di laboratorio.
L'istituzione di una coltura doliolide richiede la raccolta di animali sani e intatti e, una volta catturati, un trattamento delicato, un'alimentazione adeguata e un allevamento. Doliolidi, in particolare la specie D. gegenbauri, si verifica globalmente su scaffali continentali subtropicali, ma l'abbondanza può essere altamente variabile. Ad esempio, in un recente studio incentrato sulla regione media del SAB, anche se l'abbondanza variava notevolmente da <1/m3 a > 20.000/m3, i doliolidi erano presenti durante tutto l'anno6. A causa dell'elevata variabilità dei doliolidi nello spazio e nel tempo e della relativa difficoltà nel campionamento di ambienti continentali di margine di scaffale, una conoscenza affidabile delle dinamiche della comunità doliolidi in cui vengono condotti studi è un importante prerequisito per il successo dell'istituzione della cultura.
Una volta che gli zooidi doliolidi sono stati localizzati e catturati, può essere difficile determinare se gli animali sono stati danneggiati. Gli animali possono sembrare intatti e mostrano comportamenti attivi di nuoto e fuga, ma anche il più piccolo infortunio può causare la loro mancanza di prosperare. Una caratteristica che è particolarmente pertinente alla valutazione della salute degli zooidi doliolidi catturati è la loro capacità di nutrirsi. L'attività di alimentazione può essere valutata semplicemente fornendo alghe pigmentate ad animali appena catturati. Se un animale si nutre, l'intestino diventerà colorato entro un breve periodo di tempo. Nella nostra esperienza, abbiamo scoperto che l'aggiunta di una piccola quantità di alghe pigmentate rosse, Rhodomonas sp., fornisce rapidamente informazioni sull'attività di alimentazione. Se l'alimentazione non viene osservata, è altamente improbabile che si possa stabilire una cultura.
Vigilanza e buona allevamento sono fondamentali per stabilire e sostenere i doliolidi durante tutto il loro complesso ciclo di vita. Forse lo stadio più problematico è lo sviluppo di un infermiere vitale dalla fase larvale e la produzione (sprouting) dei trofozoidi di alimentazione. In questa fase della vita, ipotizziamo che il fabbisogno alimentare, per quanto riguarda la quantità, la qualità e le dimensioni delle particelle, sia più limitato. Per quanto ne sappiamo, non ci sono stati studi precedenti che hanno studiato l'attività alimentare delle larve e degli ozooidi D. gegenbauri. Ad esempio, anche se i gonozoidi e i forozoidi in via di sviluppo sono in grado di ingerire particelle su un'ampia gamma di dimensioni, la capacità delle larve, degli oozoidi e dei piccoli infermieri è probabilmente più limitata. In pratica, scopriamo che la coltivazione di successo in queste fasi della vita può essere ottenuta omettendo diatomee dalla miscela alimentare algale, mantenendo le concentrazioni di cibo a livelli moderati, effettuando frequenti allaminazioni a concentrazioni più basse, mantenendo un singolo gonozoide più grande e alcuni copepodi con la coltura, e rimuovendo manualmente grandi aggregati di detriti.
Anche se abbiamo mantenuto colture di D. gegenbauri per più generazioni provenienti da una singola collezione, quando possibile integriamo regolarmente le colture esistenti con animali appena raccolti per aumentare la diversità genetica e la robustezza della cultura. Un potenziale pericolo di questa pratica è l'introduzione di parassiti o malattie nella cultura, ma a nostra conoscenza, non abbiamo mai incontrato questo problema. Anche se ci sono state poche segnalazioni di parassiti di doliolidi32, senza dubbio, esistono. È interessante notare che in un recente studio che confronta la dieta dei gonozoidi D. gegenbauri coltivati esposti ad acque naturali con D. gegenbauri gonozooidi catturati sul campo, sono stati rilevati presunti parassiti Apicomplexa nella popolazione selvatica che assente negli animali coltivati6.
Una limitazione esistente della tecnologia di coltura descritta è la limitazione del volume di produzione zooide. In particolare perché le tecniche descritte comportano la coltivazione in vasetti sigillati a bassa densità su una ruota di plancton rotante, non è chiaro se questo approccio potrebbe essere scalato o che il flusso di lavoro sarebbe suscettibile all'automazione. Sistemi di coltivazione più grandi, tuttavia, per un'altra delicata piccola specie di zooplancton marino gelatinosa, la larva larvace Oikopleura dioica, sono stati descritti20,33,34, suggerendo che può essere possibile progettare sistemi simili per i doliolidi in futuro. Tuttavia, la complessa storia della vita di D. gegenbauri rispetto alla più semplice storia di vita di O. dioica rimarrà una sfida significativa per la coltivazione su larga scala.
In conclusione, seguendo i protocolli qui descritti, D. gegenbauri può essere coltivato in modo affidabile in condizioni di laboratorio controllate per tutta la sua complessa storia di vita. Questa capacità rende la specie suscettibile a una varietà di studi sperimentali controllati, e forse di sviluppare doliolidi come un nuovo modello animale nella biologia dello sviluppo e nell'evoluzione. Limitazioni della scala di produzione, tuttavia, dovranno essere superate prima di raggiungere questo obiettivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Siamo grati alle molte persone che hanno contribuito alla conoscenza accumulata a questo progetto nel corso degli anni, tra cui G.-A. Paffenhàfer e D. Deibel che originariamente svilupparono questi protocolli. Anche M. Kàster e L. Lamboley hanno contribuito in modo significativo allo sviluppo di queste procedure. N.B. L'Pez-Figueroa e l'E.E. Rodriguez-Santiago hanno generato le stime dell'abbondanza di doliolidi fornite nella tabella 1. Questo studio è stato sostenuto in parte dai premi della US National Science Foundation OCE 082599, 1031263 a MEF, progetti collaborativi OCE 1459293 e OCE 14595010 a MEF e DMG e, il premio National Oceanic and Atmospheric Administration NA16SEC4810000 a DMG. Siamo grati all'equipaggio laborioso e professionale della R/V Savannah. Lee Ann DeLeo preparò le figure, Charles Y. Robertson rileviillo del manoscritto e James (Jimmy) Williams produsse la ruota del plancton
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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