Summary
ここでは、4つの骨髄系統に対する臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞の免疫発食特性特性およびサイトカイン誘導分化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルの応用には、CD34+細胞の骨髄性分化に対する骨髄疾患変異または小分子の影響に関する調査が含まれる。
Abstract
ヒト造血幹細胞の外生分化は造血症を研究するために広く使用されているモデルである。ここで説明するプロトコルは、4つの骨髄系統細胞に対するCD34+造血幹細胞および前駆細胞のサイトカイン誘導分化を用いる。CD34+細胞は、ヒト臍帯血から単離され、サイトカインの存在下でMS-5間質細胞と共培養される。幹細胞および前駆細胞の免疫表現型特性、および分化した骨髄系統細胞について記載されている。このプロトコルを使用して、CD34+細胞は、ミエロイド分化への影響を調べるために、小分子またはレンチウイルスでトランスベートして骨髄疾患変異を発現させ得る。
Introduction
造血幹細胞(HSC)の正常な分化は、すべての血球系統の生理学的レベルの維持に重要である。分化の間、成長因子およびサイトカインを含む細胞外手がかりに対する協調的な応答において、HSCは最初にリンパ浮腫電位1、2、3を有する多能性前駆体(MPP)細胞を生じる 、4 (図1)MMPは、一般的な骨髄前駆体(CMP)および系統制限されている一般的なリンパ前駆体(CLP)を生み出す。CLPは、B、T、およびナチュラルキラー細胞からなるリンパ系系統に分化する。CCMは、さらに2つの制限された前駆体集団、巨核球赤血球前駆体(MEP)、および顆粒球単球前駆体(GGP)を介して骨髄系統を生成する。MEPは巨核球と赤血球を生み出すのに対し、GGPは顆粒球と単球を生じる。CMPを介して生じるだけでなく、巨核球はまた、非正規経路5、6を介してHSCまたは初期のPMPから直接生じることが報告されている。
造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、表面マーカーCD34および系統特異的マーカーの欠如(Lin−)によって特徴付げられる。HSCと骨髄前駆体を区別するために一般的に使用される他の表面マーカーには、CD38、CD45RA、およびCD1232(図1)が含まれる。HPC と MMP はそれぞれ Lin-/CD34+/CD38-と Lin-/CD34+/CD38+です。骨髄性前駆体集団は、CD45RAおよびCD123の有無によって区別される。CCMはリン-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo、GGP は Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo、 MEP は Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123-.
CD34+幹および前駆細胞の総集団は、ヒト臍帯血(UCB)、骨髄、および末梢血から得ることができる。CD34+細胞はヒトUCBにおける全単核細胞(MNC)の0.02%から1.46%を構成するのに対し、その割合は骨髄で0.5%から5.3%の間で変化し、末梢血7、8、9では〜0.01%とはるかに低い。 .UCB由来CD34+細胞の増殖能力および分化電位は、骨髄または末梢血細胞1、10のそれよりも有意に高く、それによって得られる明確な利点を提供する分化中の細胞の免疫発知性および形態学的特徴付けを行うことと組み合わせて分子解析に十分な材料。
臍帯血由来CD34+HSPCの外生分化は、正常な血清症および血統病のメカニズムを調用するための広く適用されたモデルである。適切なサイトカインで培養すると、UCB CD34+ HSPCは、骨髄またはリンパ系系統11、12、13、14、15に沿って分化するように誘導することができる。,16.ここでは、ヒトUCBからのCD34+HSPCの単離および免疫表現性特性、および骨髄系統細胞への分化のためのプロトコルについて説明する。この培養システムは、骨髄の微小環境を模倣するMS-5間質細胞の存在下でのHSPCのサイトカイン誘導分化に基づいている。培養条件は、CD34+細胞の初期増殖を引き起こし、続いて4つの骨髄系統細胞、すなわち顆粒球細胞(CD66b)、単球(CD14)、巨核球(CD41)、および、および4つの骨髄系統細胞のマーカーを発現する細胞への分化を引き起こす。赤血球(CD235a)。CD34+細胞分化プロトコルの応用には、血化を調節する分子機構に関する研究、および自己再生に伴う骨髄性疾患および小分子の影響の調査およびHSPC の差別化。
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Protocol
実験のためのヒト臍帯血は、フェニックスのマリコパ統合保健システム(MIHS)にインフォームドコンセントの後、健康な個人によって寄付されました。識別されなかったユニットは、MIHSとアリゾナ大学との間の材料移転契約を通じて取得されました。
1. 試薬とバッファー
注:生物学的安全キャビネット内の無菌条件下ですべての試薬およびバッファーを準備する。
- 滅菌PBS-BSA-EDTA(PBE)バッファーを調製し、無菌35%ウシ血清アルブミン(BSA;無菌組織培養グレード35%BSA)の7.2mLを添加し、無菌0.5Mエチレン亜酸テトラ酢酸(EDTA)を487.8mLに添加菌のblを添加する。生理理知(DPBS)。フィルターは、少なくとも2時間の生物学的安全キャビネットに真空に取り付けられたフィルタを残すことによってバッファを殺菌し、ガスを脱ガスし、より小さな容積(250 mL)で脱ガスバッファーをアリコートし、4°Cで保存します。
- 1xハンクスバランス塩溶液(1x HBSS)を準備します。滅菌蒸留水の900 mLで100mLの100mLを希釈し、1x HBSSの1Lを作り、pHを7.2に調整します。フィルターは使用前に1x HBSSを殺菌する。
- 蒸留水の98mLに氷河酢酸の2 mLを添加することにより、2%酢酸溶液を調出します。
- 1x PBSで20 ng/mL組換えヒトフィブロネクチン断片溶液を調作する。48ウェルプレートあたり10 mLを作ります。
- 2%BSAを準備します。100 mL 1x PBSに、使用前に殺菌するBSA分画V.フィルターの2グラムを追加します。
- DMEM粉末、3.7gm重炭酸ナトリウム、100mL胎児ウシ血清(FBS)および5 mLペニシリン連鎖マイシン(PS)を無菌蒸留水の800mLに加えることによって、完全なダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)を作ります。1Lにボリュームを混ぜて構成し、使用前に殺菌をフィルタリングします。
- FBSの90 mLと無菌ジメチルスルホキシド(DMSO)の10mLを混合して凍結培地を調作する。
- 刺激培地を調調す。血清フリー培地にL-グルタミンを2mMに添加し、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、およびFms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)、およびインターロイキン-3(IL3)の最終濃度50ng/mLにサイトカインを添加する(IL3)材料サイトカインストックソリューションの調製用)。48ウェルプレートあたり5 mLを作ります。
- 1x骨髄分化培地を調記する。DMEMを完了するには、SCF、Flt3L、IL3の最終濃度に5 ng/mL、TPOで50 ng/mL、エリスロポエチン(EPO)に4単位/mLを追加します。48ウェルプレートあたり5 mLを作ります。
- 2x骨髄分化培地を調記する。DMEM を完了するには、SCF、Flt3L、IL3 の最終濃度 10 ng/mL、TPO の場合は 100 ng/mL、EPO では 8 単位/mL にサイトカインを追加します。48ウェルプレートあたり5 mLを作ります。
- フローサイトメトリーバッファを準備します。1x PBSの1Lに、BSA画分Vの10gを加える。
- 1x PBSで1%のパラホルムアルデヒドを調調します(詳細は材料表を参照)。
- 1x PBSの49.5 mLに10mg/mLポリLリジンの500 μLを添加してポリL-リジン溶液を調製します。
2. 臍帯血からの単核細胞の分離
注:以下に説明するプロトコルでは、90~100mLの臍帯血量が用いられた。CD34+細胞の単離は、生物学的安全キャビネット内の無菌条件下で行われなければならない。
- UCBを含む袋に70%エタノールを入れてスプレーし、外表面を殺菌してから、生物学的安全キャビネットに取り込みます。UCBを無菌の250 mLペットボトルに移し、室温(RT)1x HBSSを同量に加えて1:1に希釈します。
- チューブあたりのMNC分画媒体(MFM;材料の表を参照)の15 mLを約6つの滅菌50 mL円錐形チューブに分配します。MFMでチューブを傾け、30mLの希釈されたUCBを邪魔することなくMFM層に静かに注ぎます。
- ゆっくりと加速し、ブレーキなしでRTで30分間400 x gのチューブを遠心分離します。
- 遠心分離後、MNC層上のプラズマの15〜20 mLの間で吸引する。ピペットでMNCをそっと集め、新しい50 mL円錐形チューブに移します。
注:MNCは、プラズマとMFMの界面に白色バフィー層として堆積し、円錐管の底部に赤血球(RBC)沈水を付着させる。 - 2~3本のチューブから集めたプールMNC。コールドPBEバッファで各チューブの体積を50mLにします。
- 4 °Cで10分間300 x gでチューブを遠心分離し、ブレーキを低くします。
- 上清を吸引し、チューブを軽くタップして細胞ペレットを緩めます。
- ペレット化した細胞を5mLの氷冷PBEバッファーで再中断する。同じ5 mLの再懸濁細胞を使用して、他のチューブから細胞を収集します。3~4本のチューブを1本の50mL円錐管にまとめます。
- 残りの細胞を回収するには、5 mLの冷たいPBEバッファーですべてのチューブを洗浄し、50 mL円錐管に追加します。
- 10 μLの細胞懸濁液を490 μL酢酸溶液に希釈してMNCを数えます。
注:酢酸は、MNCのカウントを容易にするために、任意の汚染RBCを溶解します。 - 氷冷PBEバッファでセルサスペンションの体積を50mLにします。4°Cで10分間300 x gでセルを遠心分離し、ブレーキを低くします。
注:MNC懸濁液は、CD34+セルの単離のために直ちに処理されるか、または後のアプリケーションのために凍結することができる。 - MNCを凍結するには、上清を取り除き、RTで凍結培地で2 x 107セル/mLの密度で再中断します。
- 細胞凍結容器で-80°Cで一晩で細胞を凍結し、液体窒素に移します。
3. 単核細胞からのCD34+細胞の分離
- 新しく分離された MNC を使用する場合は、手順 3.3 に直接進みます。
- 冷凍MNCを使用する場合は、37°Cの水浴で冷凍細胞を素早く解凍し、50mL円錐管に移します。氷冷PBEバッファーの1 mLでバイアル内の残りの細胞を収集し、50 mL円錐管に転送します。
- MNCサスペンションの体積を50mLにし、冷たいPBEバッファーと遠心分離機を600 x gで4°Cで5分間作ります。
- 上清を取り除き、チューブを軽くタップして細胞ペレットを緩めます。300 μL の氷冷 PBE バッファーで、MNC を 1 x 108セルに再中断します。
- 磁気活性化セル選別(MACS)ヒトCD34マイクロビーズキットから100μLのFcRブロッキング試薬を1x108 MNCごとに追加し、穏やかに混合します。
注:これにより、CD34マイクロビーズへの非特異的結合がブロックされます。 - CD34マイクロビーズを1 x 108セルにつき100μLを加えます。穏やかに混ぜ、冷蔵庫で30分間4°Cでインキュベートします。氷の上でインキュベートしないでください。
- セルがインキュベーションされている間、LS カラムと分離前フィルターを MACS セパレータ磁場に配置します。分離前フィルタで2 mLをカラムに直接追加し、1mLを追加することで、氷冷PBEバッファでカラムを平衡化します。カラムを15 mLの円錐形のチューブに空にし、流れを破棄します。
- 4 °CからMNCを取り外し、氷冷PBEバッファを追加して体積を15mLにし、4°Cで10分間300xgで遠心分離し、ブレーキを低くします。
- 上清を吸引し、氷冷PBEバッファーの1 mLで細胞を再中断します。
- LS カラムに配置された分離前フィルタにセルサスペンションを追加します。
注:分離前フィルタは、列をブロックする可能性のある大きなセル集約を削除します。 - 3 mLの氷冷PBEバッファーでチューブをすすいで、LSカラムに置かれた分離前フィルターに追加します。この後、分離前フィルタを破棄します。
- LSカラムを3 mLの氷冷PBEバッファを追加してLSカラムを4回洗い、毎回カラムを排水できるようにします。
注:CD34+セルは列にバインドされたままになり、ラベルのないセルは列を通過します。 - 最後の洗浄後、MACSセパレータ磁場からカラムを取り外し、磁石から離れた新しい15 mL円錐管に入れます。
- カラムに5 mLの氷冷PBEバッファを追加し、プランジャーをしっかりと押してバインドされたCD34+セルを排出します。
- 必要に応じて、前述のように分離前フィルタを使用して、最初の列から分離された CD34+セルを別の LS カラムに渡します (手順 3.10−3.13)。
- 単離されたCD34+細胞をトリパンブルー(細胞の10μLとトリパンブルーの10 μL)でカウントし、生細胞の総数を決定します。
注:この段階では、単離されたCD34+細胞は、後で使用するために凍結されてもよいし、フローサイトメトリー(セクション4)によるHSPCの分析のために直接処理されるか、またはミエロイド系統細胞への分化のために処理されてもよい(セクション5)。 - RTで5分間600 x gのセルサスペンションを遠心分離し、ブレーキを低くします。
- CD34+細胞を凍結させるには、上清を吸引し、上述のように凍結培地の1mLで最大5 x 106細胞を再停止し、上記のように凍結する(ステップ2.13)。それ以外の場合は、セクション 4 または 5 に進みます。
4. フローサイトメトリーによるステムおよび前駆体集団の決定
- 新たに単離されたCD34 +HSPCにおける幹細胞および前駆体集団の分画を決定するには、それらを600 x gで5分間遠心分離し、50 μLのフローサイトメトリーバッファーで1 x 106細胞を再定時停止します。
- 1 x 106 CD34+細胞に、抗体(希釈のための材料の表を参照)を系統マーカー(CD3、CD7、CD10、CD11b、CD19およびCD235a-すべてのFITCラベル付き)、CD34(APC-Cy7)、CD38(PE-Cy7)、CD45RA(PE-Cy7)、CD123(APC)に追加します。アミノアクチノマイシンD(7-AAD;生きた/死んだ汚れとして)を構成し、総体積を100μLにする。
注:分析に1 x 106 CD34+細胞未満が用いられる。より少ない細胞を染色する場合は、それに応じて添加された抗体の総体積と体積を減少させるべきである。フローサイトメトリー分析では、染色されていない単一染色されたMNCを、各蛍色素に対して正ゲートと負のゲートを設定するためのコントロールとして使用する必要があります。 - インキュベーション後、1mLのフローサイトメトリーバッファーと遠心分離機で細胞を5分間600xgで洗浄します。
- 必要に応じて、染色された細胞を1%パラホルムアルデヒド溶液の0.5mLでRTで暗闇の中で10分間固定する。
- 5分間600 x gで遠心分離機を吸引します。
- 固定/染色された細胞を1 mLのフローサイトメトリーバッファーと遠心分離機で600 x gで4°Cで5分間洗浄します。
- 上清を吸引し、500μLのフローサイトメトリーバッファーで細胞を再中断し、フローサイトメーター(材料表)で分析する。
5. CD34+造血幹細胞および前駆細胞の骨髄分化
注:CD34+HSPCを骨髄系統細胞に分化させるために、それらは最初に組換えヒトフィブロネクチン断片コーティングプレートで刺激され、次いで骨髄分化培地におけるMS-5間質細胞の層に播種される。分化は、4つの骨髄系に特異的な細胞表面マーカーの発現に基づいて3週間毎週モニタリングされ得る。刺激および分化の間、すべてのインキュベーションは加湿された部屋の37 °Cおよび5%CO2で行われる。すべてのステップは、生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。
- 再生中のヒトフィブロネクチン溶液の200 μL/ウェルをRTで2時間1x PBSに加えて、無菌のコーティングされていない48ウェルプレートのウェルをコーティングします。
- 2時間後、組換えヒトフィブロネクチン溶液を慎重に取り出し、廃棄する。
- RTで30分間2%BSAの200 μL/ウェルでウェルをブロックします。
- BSA溶液を吸引し、無菌1x PBSの500 μLでウェルを2回洗浄します。
注:フィブロネクチン断片被覆プレートは、最大2週間4°Cで保存することができる。 - CD34+HSPCを刺激するために、(ステップ3.17から)1 x 105細胞/200 μLまたは5 x 105細胞/mLの温かい1x刺激媒体の密度で(ステップ3.17から)再中断します。
- 凍結CD34+細胞を使用する場合は、迅速に解凍し、暖かい完全なDMEMを含む15 mL円錐管に細胞を転送します。600 x gで5分間遠心分離し、ステップ5.5に記載されているように細胞を再中断する。
- CD34+セル懸濁液のプレート200μLをフィブロネクチン断片のウェル当たり48ウェルプレートを被覆し、48時間インキュベートする。
- 翌日、48ウェル組織培養処理プレートのウェル当たり200μLの完全なDMEMの25,000 MS-5間質細胞を種子し、24時間37°Cでインキュベートする。
- 刺激の48時間後、穏やかなピペッティングによってCD34+細胞を収集する。500 μL の温かい DMEM とプールをセルサスペンションで洗浄します。
- トリパンブルーでセルを数えます。懸濁液を600xgで5分間遠心分離し、1x骨髄分化培地の5,000細胞/200μLの密度で再懸濁する。
- MS-5間質細胞で播種した48ウェル組織培養プレートから、細胞を乱すことなく培地を静かに吸引する。CD34+細胞懸濁液の層200μL(5,000細胞)をプレートのウェル当たり、37°Cでインキュベートする。
注:MS-5細胞の培養は、完全なDMEMで維持することができる。CD34+細胞が播種された日に、MS-5細胞は均一な層(80〜90%合流)でなければなりません。MS-5細胞は、CD34+細胞の播種の少なくとも24時間前にめっきすることを推奨する。 MS-5細胞がCD34+細胞を播種する前に48時間または72時間メッキされる場合、細胞密度はそれに応じて調整されるべきである。また、48ウェルプレートの周辺ウェルは、エッジ効果を避けるために、白く残すか、200 μLの滅菌水で満たされることをお勧めします。 - 各ウェルの上部から100μLの培地を静かに取り除き、ウェル当たり2倍ミエロイド分化媒体の100 μLに置き換えることで、3~4日ごとに半中変化を行います。
- 21日目に、フローサイトメトリーによる骨髄系統マーカー発現の分析のために細胞を採取する。MS-5層を邪魔することなく、培地を優しくピペットし、細胞を5mLチューブに移します。
注:染色およびフローサイトメトリー分析のために、1-2ウェルからの細胞は十分である。分化は、1日目、7日目、および14日目に監視することもできる。複数の日に免疫表現型を実行する場合は、分析に必要なウェルの数がそれに応じて計算する必要があります。 - CD34(APC-Cy7)、CD66b(PE-Cy7)、CD14(PE)、CD41(PerCP-Cy5.5)、CD235a(APC)に対する抗体を持つ5 x 105細胞を合計50μLの総容積で染色し、単一の染色を含む各蛍色素の正と負のゲート、および分析から死んだ細胞を排除するために生きている/死んだ染色として7-AAD。
- 上記のように染色した細胞を洗浄して固定する(オプション)(手順4.3-4.6)。
- フローサイトメトリーバッファーの500 μLで細胞を再中断し、フローサイトメーターで分析します。
6. 細胞形態の評価
- エタノールを噴霧し、きしむまで拭くことによってきれいな顕微鏡スライド。
- RTで5分間ポリL-リジン溶液にきれいなスライドを浸し、RTで1時間乾燥させます。
- ステップ 3.14 から HSPC を再中断し、フロー サイトメトリー バッファーの 10 μL でステップ 5.13 から分化したセルを再中断します。
- セルサスペンションをコーティングされたスライドに移し、エアドライのままにしておきます。
注:1日目と21日目のスライドはRTで保存し、同時に染色することができます。 - スライドにライトギムサ染色の0.5 mLを注ぎ、RTで3分間立たせてください。
- 同じ量の脱イオン水を加え、RTでさらに10分間立たせてください。
- スライドを脱イオン水で洗います。
- 染色した細胞を顕微鏡で60倍または100倍の倍率で可視化します。
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Representative Results
上記のプロトコルの適用は、〜100 mLの臍帯血単位から5.6(±0.5)x 108 MNCおよび1(±0.3)x 106 CD34+細胞を生み出す。CD34+セルの合計のパーセンテージは、80 ~ 90% の範囲です (図 2A,B)。Manz et al.5で説明したスキームによる免疫発フェノチピック分析は、CD34+細胞が通常、Lin - /CD34+/CD38-およびLin -/CD34+ である約20%のHSCと約72%のPMPで構成されていることを示しています。/CD38+それぞれ (図 1と図 2A)。MPP 母集団では、CmP のパーセンテージ (Lin-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA-) 、GGP (リン-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA+)MEP (Lin-/CD34+/CD38+/CD123-/CD45RA-) はそれぞれ約 25%、15%、56%です (図 1および図2B)。
骨髄分化条件における単離されたHSPCのインキュベーション中に、CD34マーカーの進行性損失がある。免疫フェノタイピングは、CD34+細胞の割合が単離時の約90%から21日目(図3B)に~23%に減少することを示している。CD34の分析-集団は、成熟した骨髄系統マーカーを発現する細胞の割合の付加的な上昇を示す。単球のマーカーを発現する細胞の割合(CD34-/CD14+/CD66b-) 顆粒球 (CD34-/CD14-/CD66b+)の平均 1.7% から 5.3% に増加しています。巨核球 (CD34-/CD41+/CD235a-) 1.8% から 8% まで、赤血球細胞 (CD34-/CD41-/CD235a+) 0.7% から 11% (図 3C)ライトギムサ染色細胞の検査は、1日目と21日目の細胞の形態学的特性が異なっていることを示している。未分化細胞は大きな丸核を有し、細胞質は非常に少ない。一方、分化培養由来の細胞は、成熟単球、顆粒球、赤血球を含む系統細胞の特性を示す(図4)。したがって、このプロトコルに記載の培養条件は、骨髄系統細胞へのUCB CD34+細胞の分化を促進する。
図 1: 平隔分化回路図。多能性造血幹細胞(HSC)は多能性前駆体(MPP)に分化し、一般的な骨髄前駆体(CMP)および一般的なリンパ球前駆体(CLP)細胞を生み出す。CCMは、他の2つの骨髄前駆体、顆粒球単球前駆体(GGP)および巨核球赤血球前駆体(MEP)を生成する。顆粒球と単球はGGPから生じ、赤血球と巨核球はMEPから生じる。CLPは、ナチュラルキラー、B、およびT細胞を生み出します。このプロトコルにおける細胞集団を特徴付けるために使用される細胞表面マーカーが示される。この図はBapatら11から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 造血幹細胞および前駆細胞の免疫発散分析(A) セルを前方および側面散乱にゲートし、単一の細胞集団を選択した。死死および系統陽性細胞は、CD3、CD7、CD10、CD11b、CD19、およびCD235a(すべてのFITC染色)に対する7-AADおよび抗体を用いて染色することによって排除された。Lin-/ライブ細胞をCD34(APC-Cy7)、CD38(PE)、CD123(APC)、およびCD45RA(PE-Cy7)に対する抗体で分析した。前駆体はCD34+/CD38+細胞と区別した。CCMは CD123lo/CD45RA-GGP は CD123lo/CD45RA+ MEP で、MEP は CD123-/CD45RA-です。実験からの代表的な散布図を示す。(B) 臍帯血中の全HSP(合計CD34+細胞)、Cプ、GGP、およびMEPのパーセンテージが表されます。提示されたデータは、少なくとも3つの独立した実験からの標準的な誤差を伴う平均値である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 骨髄系統細胞の免疫性膜分析単一細胞は、前方および側面散乱に基づいてゲートされた。CD34-細胞をCD34(APC-Cy7)に抗体で染色して選択した。CD34中の骨髄系統-集団をCD14(PE)、CD66b(PE-Cy7)、CD41(PerCP-Cy5.5)、およびCD235a(APC)1日目(A)および21日目(B)に対する抗体で分析した。単球はCD14+/CD66b-、顆粒球はCD14-/CD66b+、巨核球はCD41+/CD235a-および赤血球細胞はCD41-/CD235a+である。実験からの代表的な散布図を示す。CD34における単球細胞、顆粒球球、巨核球細胞、および赤血球細胞の画分-1日目および21日目の集団が表される(C)。提示されたデータは、少なくとも3つの独立した実験からの標準的な誤差を伴う平均値である。この図はBapatら11から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: HSPCと分化細胞の代表的な画像。CD34+HSPC(A)及び21日目(B)における骨髄培養物由来の細胞をライトギムサ染色で染色した。 顆粒球に対応する細胞(黒い矢印)、単球(青い矢印)および赤血球細胞(赤い矢印)が示されている。スケール バーは 10 mm を表します。この図はBapatら11から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、UCB由来CD34+HSPCの4つの骨髄系統の生体分化に適している。SCF、TPO、Flt3LおよびIL3からなるサイトカインミックスを用いた初期インキュベーションは、CD34+細胞を刺激する。その後、SCF、IL3、Flt3L、EPO、およびTPOのカクテルで差別化が達成されます。この組み合わせでは、SCF、IL3、およびFlt3Lは、CD34+HSC.EPOおよびTPOがそれぞれ赤血球および巨核球に対する分化を促進し、IL3は早期顆粒球-単球の分化を促進する。前駆体および成熟細胞13,17,18.この方法の注意点の 1 つは、分化細胞のパーセンテージの変化が観察された点です。これは、血統細胞を生み出すために異なるドナーから単離されたCD34+HSPCの容量の違いが考えられる。
MS-5セルの層は、CD34+ HSPCの効率的な分化に不可欠です。我々の経験では、MS-5細胞はCD34+細胞の播種の少なくとも24時間前にめっくりする必要がある。MS-5細胞の合流を80~90%に維持することが重要です。過剰コンフルエントMS-5細胞は剥離する傾向があり、合流性が低いと分化が低下する。インキュベーション中、CD34+細胞は約50倍拡大する。それらは14日目までにコンフルエントになり、新しいプレート上のMS-5細胞を含む追加の井戸に収穫され、分割される必要があります。
メディアの変化の頻度は、効率的な分化のためにも重要であり、最適なサイトカイン濃度を維持するために3〜4日ごとに実行する必要があります。より少ない培画像変化および低いサイトカイン濃度は、いずれもCD34+HSPCの増殖および分化の減少を引き起こす。大量のサイトカインに対するこの要件は、コストを大幅に増加させることができ、したがって、このプロトコルの制限です。大規模な実験のためのもう一つの制限は、臍帯血の単位から得られるCD34+細胞の数である。典型的には、〜100 mLの新鮮なUCB単位は、約100万のCD34+細胞を得る。24時間を超える単位の貯蔵は著しく収量を減らす。CD34+細胞のさらなる純度の喪失は、任意の標識されていない汚染細胞を除去するために重要であるカラム洗浄ステップ中に発生する可能性があります。洗浄ステップ中にカラムが詰まった場合は、CD34+細胞の純粋な集団を得るために、詰まったカラムからの結合した細胞を新しいカラムにelutedして再ロードすることをお勧めします。
文献では、巨核球、赤血球、または顆粒単球系統19、20、21、22のいずれかに対する分化を促進する異なるサイトカインの組み合わせが報告されている.このプロトコルの利点は、4つの骨髄性集団、すなわち単球細胞、顆粒球細胞、巨核球、赤血球に沿った分化を可能にすることです。したがって、正常な骨髄分化を研究し、骨髄異形成症候群(骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物、および他)関連点変異の影響を調査するために使用することができます。CD34+細胞11、12、23、24、25の増殖および分化中の分子および細胞表現型上の染色体転移。このプロトコルはまた、抗炎症性サイトカイン、および骨髄分化26、27、28に対する潜在的な治療薬の影響を調べるために使用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、ウェンディ・バレット、レイチェル・カバレロ、マリコパ統合医療システムのガブリエラ・ルイスに対して、コード血液ユニットの識別と寄付を行った、Mrinalini Kalaのフローサイトメトリーの支援、ゲイ・クルックスとクリストファー・シートに感謝したいと思います。ex vivo骨髄分化に関するアドバイス。この研究は、国立衛生研究所(R21CA170786およびR01GM127464)と米国癌学会(機関研究助成金74-001-34-IRG)からのS.S.への資金によって支援されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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