Summary
Her presenterer vi en protokoll for immunophenotypic karakterisering og cytokin indusert differensiering av ledningen blod avledet CD34+ blodkreft stem og stamceller til de fire myelogen linjene. Anvendelser av denne protokollen inkluderer undersøkelser om effekten av myelogen sykdom mutasjoner eller små molekyler på myelogen differensiering av CD34+ celler.
Abstract
Ex vivo differensiering av menneskelig blodkreft stamceller er en mye brukt modell for å studere hematopoiesen. Protokollen som er beskrevet her er for cytokin indusert differensiering av CD34+ blodkreft stem og stamceller til de fire myelogen avstamning celler. CD34+ celler er isolert fra menneskelige navlestreng blod og co-KULTIVERT med MS-5 stromal celler i nærvær av cytokiner. Immunophenotypic karakterisering av stammen og stamceller, og de differensiert myelogen avstamning celler er beskrevet. Ved hjelp av denne protokollen, CD34+ celler kan være inkubert med små molekyler eller transduced med lentiviruses å uttrykke myelogen sykdom mutasjoner å undersøke deres innvirkning på myelogen differensiering.
Introduction
Normal differensiering av blodkreft stamceller (HSCs) er avgjørende for vedlikehold av fysiologiske nivåer av alle blodlegemer linjene. Under differensiering, i en koordinert reaksjon på ekstracellulære stikkord inkludert vekstfaktorer og cytokiner, HSCs første gi opphav til Multipotent stamfar (MPP) celler som har lymfe-myelogen potensial1,2,3 ,4 (figur 1). MPPs gi opphav til felles myelogen forfedre (CMPs) og felles lymfoide forfedre (CLPs) som er avstamning-begrenset. CLPs differensiere til lymfoide linjene består av B, T, og naturlig killer celler. CMPs genererer myelogen linjene gjennom to mer begrensede Stam populasjoner, megakaryocyte erytroide forfedre (MEPs) og granulocytt monocytt forfedre (GMP). MEPs gi opphav til megakaryocytter og erytrocytter, mens GMP gi opphav til granulocytter og monocytter. I tillegg til å oppstå gjennom CMPs, har megakaryocytter også blitt rapportert direkte fra HSCs eller tidlig MPPs via ikke-kanoniske trasé5,6.
Blodkreft stilk og stamceller (HSPCs) er preget av overflaten markør CD34 og mangelen på avstamning spesifikke markører (Lin-). Andre overflate markører som vanligvis brukes til å skille HSCs og myelogen Stam populasjoner inkluderer CD38, CD45RA og CD1232 (figur 1). HSCs og MPPs er henholdsvis Lin-/CD34+/CD38- og Lin-/CD34+/CD38+. Myelogen begått Stam populasjoner er preget av tilstedeværelse eller fravær av CD45RA og CD123. CMPs er Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, GMP er Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, og MEPs er Lin-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.
Den totale befolkning på CD34+ Stem og stamceller kan fås fra humant navlestreng blod (UCB), benmarg, og perifert blod. CD34+ celler utgjør 0,02% til 1,46% av totale mononukleære celler (MNCs) i humant UCB, mens deres prosentandel varierer mellom 0,5% og 5,3% i benmargen og er mye lavere på ~ 0,01% i perifert blod7,8,9 . Proliferativ kapasitet og differensiering potensialet i UCB avledet CD34+ celler er betydelig høyere enn benmarg eller perifere blodlegemer1,10, og dermed gir en klar fordel for å oppnå tilstrekkelig materiale for molekylær analyser i kombinasjon med å utføre immunophenotypic og morfologiske karakterisering av cellene under differensiering.
Ex vivo differensiering av navlestreng blod avledet CD34+ HSPCs er en mye brukt modell for å undersøke normal hematopoiesen og blodkreft sykdom mekanismer. Når kultivert med de riktige cytokiner, kan UCB CD34+ HSPCs bli overtalt til å differensiere langs myelogen eller lymfoide linjene11,12,13,14,15 , 16. her beskriver vi protokoller for isolering og immunophenotypic KARAKTERISERING av CD34+ HSPCs fra Human UCB, og for deres differensiering til myelogen avstamning celler. Dette kultur systemet er basert på cytokin-indusert differensiering av HSPCs i nærvær av MS-5 stromal celler for å etterligne mikromiljøet i benmargen. Kulturen forholdene føre til en første utvidelse av CD34+ celler, etterfulgt av deres differensiering til celler som uttrykker markører for de fire myelogen avstamning celler, nemlig granulocytter (CD66b), MONOCYTTER (CD14), MEGAKARYOCYTTER (CD41), og erytrocytter (CD235a). Anvendelser av CD34+ celle differensiering protokollen inkluderer studier på molekylære mekanismer som regulerer hematopoiesen, og undersøkelser av virkningen av myelogen sykdom knyttet mutasjoner og små molekyler på selv-fornyelse og differensiering av HSPCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human navlestreng blod for eksperimentering ble donert av friske individer etter informert samtykke til Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. De deidentified enhetene ble innhentet gjennom en Material overføringsavtale mellom MIHS og University of Arizona.
1. reagenser og buffere
Merk: Klargjør alle reagenser og buffere under sterile forhold i et biologisk sikkerhetskabinett.
- Forbered steril PBS-BSA-EDTA (PBE) buffer ved å legge 7,2 mL sterilt 35% storfe serum albumin (BSA; bruk steril vevs kultur grad 35% BSA) og 5 mL steril 0,5 M etylen diamin Tetra eddiksyre (EDTA) til 487,8 mL sterilt Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann (DPBS). Filter sterilisere og de-gass bufferen ved å la filteret festet til vakuum i et biologisk sikkerhetskabinett for minst 2 h. Alikvot buffer i mindre volumer (250 mL) og oppbevares ved 4 ° c.
- Forbered 1x Hanks balansert saltløsning (1x HBSS). Fortynne 100 mL av 10x HBSS lager inne 900 mL av sterilt destillert vann å lage 1 L av 1x HBSS og innstille pH å 7,2. Filteret sterilisere 1x HBSS før bruk.
- Forbered 2% eddiksyreløsning ved å tilsette 2 mL av isbre eddiksyre til 98 mL destillert vann.
- Forbered 20 ng/mL rekombinant humant fibronektin fragment løsning i 1x PBS. Lag 10 mL per 48 brønn plate.
- Forbered 2% BSA. Til 100 mL 1x PBS, tilsett 2 gram BSA fraksjon V. filter sterilisering før bruk.
- Gjør komplett Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) ved å legge til DMEM pulver, 3,7 GM natrium bikarbonat, 100 mL fosterets storfe serum (FBS) og 5 mL penicillin-Streptomycin (PS) til 800 mL sterilt destillert vann. Bland og gjør opp volumet til 1 L, og Filtrer sterilisering før bruk.
- Forbered frysing medium ved å blande 90 mL FBS og 10 mL sterilt dimethyl sulfoxide (DMSO).
- Forbered stimulering medium. Til serum fritt medium, tilsett L-glutamin til 2 mM, og cytokiner til en endelig konsentrasjon av 50 ng/mL for stilk cellen faktoren (SCF), thrombopoietin (TPO), og FMS-lignende tyrosin kinase 3 ligand (Flt3L), og 20 ng/mL for interleukin-3 (IL3) (se tabell over materialer for fremstilling av cytokin lager løsninger). Lag 5 mL per 48-brønn plate.
- Forbered 1x myelogen differensiering medium. For å fullføre DMEM legger du til cytokiner i en endelig konsentrasjon på 5 ng/mL for SCF, Flt3L og IL3, 50 ng/mL for TPO og 4 enheter/mL for erytropoietin (EPO). Lag 5 mL per 48-brønn plate.
- Forbered 2x myelogen differensiering medium. For å fullføre DMEM legger du til cytokiner i en endelig konsentrasjon 10 ng/mL for SCF, Flt3L og IL3, 100 ng/mL for TPO og 8 enheter/mL for EPO. Lag 5 mL per 48-brønn plate.
- Klargjør flyt flowcytometri buffer. Til 1 L av 1x PBS, tilsett 10 g BSA brøkdel V.
- Forbered 1% paraformaldehyde i 1x PBS (se tabell over materialer for detaljer).
- Forbered Poly-L-lysin-løsning ved å tilsette 500 μL av 10 mg/mL Poly-L-lysin til 49,5 mL 1x PBS.
2. isolering av mononukleære celler fra navlestreng Blood
Merk: For protokollen beskrevet nedenfor, ble ledningen blod volumer på 90 til 100 mL brukt. Isolasjonen av CD34+ celler må utføres under sterile forhold i et biologisk sikkerhetskabinett.
- Spray posen som inneholder UCB med 70% etanol å sterilisere den ytre overflaten før innføre det i den biologiske sikkerhetskabinett. Overfør UCB til en steril 250 mL plastflaske og fortynne den 1:1 ved å tilsette et likt volum av romtemperatur (RT) 1x HBSS.
- Dispensere 15 mL av MNC fraksjonering medium (MFM; se tabell materiale) per rør i omtrent seks sterile 50 ml koniske rør. Vipp røret med MFM, og forsiktig helle 30 mL fortynnet UCB på MFM laget uten å forstyrre den.
- Sentrifuger rørene ved 400 x g i 30 min på RT med langsom akselerasjon og ingen brems.
- Etter sentrifugering, aspirer mellom 15-20 mL av plasma over MNC laget. Samle MNCs med en pipette og Overfør til en ny 50 mL konisk slange.
Merk: MNCs innskudd som en hvit Buffy lag i grensesnittet av plasma og MFM, og de røde blodcellene (RBC) sediment på bunnen av den koniske røret. - Pool MNCs samlet inn fra 2-3 rør sammen. Utgjør volumet av hvert rør til 50 mL med kaldt PBE buffer.
- Sentrifuger rørene ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c, med bremsen på lavt.
- Aspirer supernatanten og trykkrøret forsiktig for å løsne celle pellet.
- Re-suspendere pelleted celler i 5 mL iskald PBE buffer. Bruk de samme 5 mL av re-suspenderte celler for å samle celler fra andre rør. Kombiner celler fra 3 til 4 rør sammen i 1 50 mL konisk rør.
- For å samle eventuelle gjenværende celler, vaske alle rørene med 5 mL kaldt PBE buffer og legge til 50 mL konisk rør.
- Tell MNCs ved å fortynne 10 μL av celle fjæring i 490 μL eddiksyre oppløsning.
Merk: Eddiksyre analyser noen forurensende RBC å tillate enklere telling av MNCs. - Utgjør volumet av celle suspensjonen til 50 mL med iskald PBE buffer. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c, med brems på lav.
Merk: Den MNC suspensjonen kan behandles umiddelbart for isolering av CD34+ celler eller frosset for senere applikasjoner. - For å fryse MNCs, Fjern supernatanten og re-suspendere ved en tetthet på 2 x 107 celler/ml i frysing medium ved RT.
- Frys cellene ved-80 ° c over natten i en celle fryse beholder og Overfør dem deretter til flytende nitrogen.
3. isolering av CD34+ celler fra mononukleære Cells
- Hvis du bruker nylig isolerte MNCs gå direkte til trinn 3,3.
- Hvis du bruker frosne MNCs, raskt tine de frosne cellene i en 37 ° c vannbad og overføre til en 50 mL konisk rør. Samle eventuelle gjenværende celler i hetteglassene med 1 mL iskald PBE-buffer og Overfør til 50 mL konisk rør.
- Utgjør volumet av MNC suspensjonen til 50 mL med kald PBE buffer og sentrifuge ved 600 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Fjern supernatanten og trykkrøret forsiktig for å løsne celle pellet. Re-suspendere MNCs til 1 x 108 celler i 300 μL av iskald PBE buffer.
- Tilsett 100 μL av FcR som blokkerer reagens fra den magnetiske-aktiverte celle sorteringen (MACS) menneskelige CD34 microbead sett per 1 x 108 MNCs og bland forsiktig.
Merk: Dette blokkerer ikke-spesifikk binding til CD34-mikroperler. - Tilsett 100 μL av CD34 mikroperler per 1 x 108 celler. Bland forsiktig og ruge ved 4 ° c i 30 minutter i kjøleskap. Ikke ruge på is.
- Mens cellene er incubating, plasserer en LS kolonne og pre-separasjon filter i MACS separator magnetfelt. Likevekt kolonnen med iskald PBE buffer ved å legge 2 mL direkte i kolonne og 1 mL i pre-separasjon filter. La kolonnen tømmes i et 15 mL konisk rør og kast flyten gjennom.
- Fjern MNCs fra 4 ° c, Legg iskald PBE buffer for å gjøre opp volumet til 15 mL, og sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c, med brems på lav.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 1 mL iskald PBE buffer.
- Legg til celle fjæringen til forhånds skille filteret som er plassert på LS-kolonnen.
Merk: Forhånds skille filteret fjerner store celle aggregater som kan blokkere kolonnen. - Skyll røret med 3 mL iskald PBE buffer og legg den til pre-separasjon filter plassert på LS kolonne. Etter dette, kast pre-separasjon filter.
- Vask LS-kolonnen fire ganger ved å legge til 3 mL iskald PBE-buffer, slik at kolonnen kan tømmes hver gang.
Merk: CD34+ -cellene vil forbli bundet til kolonnen, og de umerkede cellene vil flyte gjennom kolonnen. - Etter siste vask, fjerne kolonnen fra MACS separator magnetfelt og plassere den i en ny 15 mL konisk rør, vekk fra magneten.
- Tilsett 5 mL iskald PBE buffer til kolonnen og utvise den bundne CD34+ celler ved fast skyve i stempelet.
- Du kan eventuelt sende CD34+ celler som er isolert fra den første kolonnen over en annen ls-kolonne med forhånds skille filteret, som beskrevet ovenfor (trinn 3.10 − 3.13).
- Tell de isolerte CD34+ cellene med trypan blå (10 μL av celler og 10 μL av trypan blå) for å bestemme det totale antallet aktive celler.
Merk: På dette stadiet, kan de isolerte CD34+ celler fryses for senere bruk eller kan behandles direkte for analyse av HSPCs ved flyt flowcytometri (del 4) eller for differensiering til myelogen avstamning celler (§ 5). - Sentrifuger cellen suspensjon på 600 x g i 5 min ved RT, med brems på lav.
- Å fryse det CD34+ celler, aspirer det supernatanten og re-suspendere til 5 x 106 celler inne 1 ml av fryser medium og fryse idet beskrevet over (steg 2,13). Hvis ikke, går du videre til avsnitt 4 eller 5.
4. bestemmelse av Stem og Stam populasjoner av Flow flowcytometri
- For å bestemme fraksjoner av stammen og Stam populasjoner i den ferske isolerte CD34+ HSPCs, sentrifuger dem på 600 x g for 5 min og re-suspendere 1 x 106 celler i 50 μL av Flow flowcytometri buffer.
- Til 1 x 106 CD34+ celler, tilsett antistoffer (se tabell over materialer for FORTYNNINGER) til slekts MARKØRER (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 og CD235a — alle FITC merket), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) og 7- aminoactinomycin D (7-AAD; som en levende/død flekk) og utgjør det totale volumet til 100 μL. ruge på isen i mørket i 20 min.
Merk: Færre enn 1 x 106 CD34+ celler kan være ansatt for analyse. Hvis farging av færre celler, bør det totale volumet og volumet av antistoffer reduseres i henhold til dette. For Flow flowcytometri analyse, unstained og enkelt farget MNCs bør brukes som kontroller for å sette positive og negative porter for hver fluoroforen. - Etter inkubasjons, vask cellene med 1 mL Flow flowcytometri buffer og sentrifuge ved 600 x g i 5 min.
- Alternativt, fikse farget cellene i 0,5 mL 1% paraformaldehyde løsning for 10 min i mørket på RT.
- Sentrifuger på 600 x g i 5 min og aspirer supernatanten.
- Vask fast/farget celler med 1 mL Flow flowcytometri buffer og sentrifuge ved 600 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Aspirer supernatanten, re-suspendere cellene i 500 μL av Flow flowcytometri buffer, og analysere av en flyt flowcytometer (tabell av materialer).
5. myelogen differensiering av CD34+ blodkreft stem og stamceller
Merk: For å differensiere CD34+ HSPCs til myelogen avstamning celler, de er først stimulert i rekombinant humant fibronektin fragment belagt plater og deretter seeded på et lag av MS-5 stromal celler i myelogen differensiering medium. Differensiering kan overvåkes hver uke i 3 uker basert på uttrykk for celle overflate markører som er spesifikke for de fire myelogen linjene. Under stimulering og differensiering utføres alle incubations ved 37 ° c og 5% CO2 i et fuktet kammer. Alle trinn bør utføres i et biologisk sikkerhetskabinett.
- Coat brønnene av en steril, ikke-48 brønn plate ved å tilsette 200 μL/brønn av rekombinant humant fibronektin løsning i 1x PBS for 2 timer ved RT.
- Etter 2 h, Fjern forsiktig rekombinant humant fibronektin løsning og kast.
- Blokker brønnene med 200 μL/brønn på 2% BSA i 30 minutter ved RT.
- Aspirer BSA-løsningen og vask brønnene to ganger med 500 μL av steril 1x PBS.
Merk: Fibronektin fragment belagte plater kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 uker. - For å stimulere CD34+ HSPCs, re-suspendere de ferske isolerte celler (fra trinn 3,17) i en tetthet på 1 x 105 celler/200 μL eller 5 x 105 celler/ml varm 1x stimulering medium.
- Hvis du bruker frosne CD34+ celler, raskt tine og overføre cellene til en 15 ml konisk rør som inneholder varm komplett DMEM. Sentrifuger på 600 x g for 5 min og re-suspendere cellene som beskrevet i trinn 5,5.
- Plate 200 μL av CD34+ celle fjæring per brønn av fibronektin fragment belagt 48-brønn plate og ruge for 48 h.
- På neste dag, frø 15 000 MS-5 stromal celler i 200 μL av komplett DMEM per brønn av en 48-brønn vev kultur behandlet plate og ruge ved 37 ° c for 24 h.
- Etter 48 h av stimulering, samle CD34+ celler ved milde pipettering. Vask brønnene med 500 μL av varm DMEM og basseng med celle fjæringen.
- Tell cellene med trypan blå. Sentrifuger suspensjonen på 600 x g i 5 min og re-suspendere ved en tetthet av 5 000 celler/200 μL av 1x myelogen differensiering medium.
- Fra 48-brønn vev kultur plate seeded med MS-5 stromal celler, forsiktig aspirer mediet uten å forstyrre cellene. Layer 200 μL (5 000 celler) av CD34+ celle fjæring per brønn av platen og ruge ved 37 ° c.
Merk: Kultur av MS-5 celler kan opprettholdes i komplett DMEM. På dagen CD34+ celler er sådd, må MS-5-cellene være i et ensartet lag (80-90% samløpet). Det anbefales at MS-5 cellene er belagt minst 24 timer før seeding i CD34+ celler. Hvis MS-5 celler skal være belagt 48 h eller 72 h før SEEDING i CD34+ celler, bør celle tettheten justeres tilsvarende. Det anbefales også at de perifere brønnene på 48-brønnen blir stående tomme eller fylt med 200 μL sterilt vann for å unngå kanteffekter. - Utfør halv middels endring hver 3 − 4 dager ved å forsiktig fjerne 100 μL av mediet fra toppen av hver brønn og erstatte den med 100 μL av 2x myelogen differensiering medium per brønn.
- På dag 21, høste cellene for analyse av myelogen avstamning markør uttrykk ved flyt flowcytometri. Uten å forstyrre MS-5 lag, forsiktig pipette mediet og overføre celler til en 5 mL tube.
Merk: For farging og Flow flowcytometri analyse, celler fra 1-2 brønner er tilstrekkelig. Differensiering kan også overvåkes på dag 1, 7 og 14. Hvis du utfører immunfenotyping på flere dager, bør antall brønner som trengs for analyse beregnes tilsvarende. - Stain 5 x 105 celler med ANTISTOFFER mot CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-CY 5.5), og CD235A (APC) i et total volum på 50 ΜL. ruge på is i mørket i 20 min. Inkluder unstained og enkelt flekket MNCs som kontroller for innstilling positive og negative porter for hver fluoroforen, og 7-AAD som en levende/Dead flekken for å eliminere døde celler fra analysen.
- Vask og Fix (valgfritt) de fargede cellene som beskrevet ovenfor (trinn 4.3-4.6).
- Re-suspendere cellene i 500 μL av Flow flowcytometri buffer og analysere av en flyt flowcytometer.
6. vurdering av cellulær morfologi
- Rengjør objektglass ved å spraye etanol og tørk til det er helt i.
- Dypp rene lysbilder i Poly-L-lysin løsning for 5 min på RT og tørk i 1 time ved RT.
- Resuspend HSPCs fra trinn 3,14 og atskilte celler fra trinn 5,13 i 10 μL strømnings flowcytometri buffer.
- Overfør celle fjæringen til de belagte lysbildene og la dem lufttørke.
Merk: Lysbilder fra dag 1 og dag 21 kan lagres på RT og beiset samtidig. - Hell 0,5 mL av Wright-Giemsa beis på lysbildet og la stå i 3 minutter ved RT.
- Legg like volum av deionisert vann og la stå for ytterligere 10 min ved RT.
- Vask glidebryteren i deionisert vann.
- Visualiser fargede celler med en forstørrelse på 60x eller 100% av et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse av ovennevnte protokoller gir 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs og 1 (± 0,3) x 106 CD34+ celler fra en ledningen blod enhet på ~ 100 ml. Prosentandelen av totalt CD34+ celler varierer mellom 80-90% (figur 2A, B). Immunophenotypic analyse av ordningen beskrevet av Manz et al.5 DEMONSTRERER at CD34+ celler vanligvis består av ~ 20% HSCs og ~ 72% MPPs som er Lin-/CD34+/CD38- og Lin-/CD34+ /CD38+, henholdsvis (figur 1 og figur 2A). I MPP-populasjonen er prosentene av CMPs (Lin-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA-), GMP (Lin-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA+), og MEPs (Lin-/CD34+/CD38+/CD123-/CD45RA-) er omtrent 25%, 15% og 56%, henholdsvis (figur 1 og figur 2b).
Under inkubasjons av den isolerte HSPCs i myelogen differensiering forhold, er det progressive tap av CD34 markør. Immunfenotyping viser at prosentandelen av CD34+ celler reduserer fra ~ 90% ved isolering (figur 2A) til ~ 23% på dag 21 (Figur 3B). Analyse av CD34- befolkningen demonstrerer en samtidig økning i prosentandelen av celler som uttrykker modne myelogen avstamning markører. Det er en økning i prosentandelen av celler som uttrykker markører for monocytter (CD34-/CD14+/CD66b-) fra et gjennomsnitt på 1,7% til 12%, for granulocytter (CD34-/CD14-/CD66b+) fra 1,3% til 5,3%, for megakaryocytter (CD34-/CD41+/CD235a-) fra 1,8% til 8%, og for erytroide celler (CD34-/CD41-/CD235a+) fra 0,7% til 11% (Figur 3C). Undersøkelse av Wright-Giemsa fargede celler viser at de morfologiske egenskapene til cellene på dag 1 og dag 21 er distinkte. De udifferensierte cellene har store runde kjerner, og svært lite cytoplasma. På den annen side, celler fra differensiert kulturer utstillingen kjennetegner avstamning celler inkludert modne monocytter, granulocytter, og erytroblaster (Figur 4). Således, kulturen forholdene beskrevet i denne protokollen fremme differensiering av UCB CD34+ celler til myelogen avstamning celler.
Figur 1 : Blodkreft differensiering skjematisk. Den pluripotent blodkreft Stamcelle (HSC) skiller seg inn i Multipotent stamfar (MPP), som gir opphav til den felles myelogen stamfar (CMP) og den felles lymfoide stamfar (CLP) celler. CMPs genererer to andre myelogen forfedre, granulocytt monocytt forfedre (GMP) og megakaryocyte erytrocytt forfedre (MEPs). Granulocytter og monocytter oppstår fra GMP, og erytrocytter og megakaryocytter oppstår fra MEPs. CLPs gi opphav til naturlige killer, B og T-celler. Celle overflate markørene som brukes til å karakterisere celle populasjoner i denne protokollen, er angitt. Dette tallet har blitt modifisert fra Bapat et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Immunophenotypic analyse av blodkreft stammen og stamceller. (A) celler var gated på fremover og side scatter å velge en enkelt celle befolkning. Døde og avstamning positive celler ble eliminert ved farging med 7-AAD og antistoffer mot CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19, og CD235a (alle FITC beiset). Lin-/Live celler ble analysert med ANTISTOFFER mot CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD123 (APC), og CD45RA (PE-Cy7). Forfedre ble skilt fra CD34+/CD38+ celler. CMPs er CD123lo/CD45RA-, GMP er CD123lo/CD45RA+ og MEPs er CD123-/CD45RA-. Representative scatter plott fra et eksperiment vises. (B) prosenter av totalt HSPCs (totalt CD34+ celler), CMPs, GMP, og MEPs i ledningen blod er representert. Data som presenteres er gjennomsnitt med standard feil fra minst tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Immunophenotypic analyse av myelogen slekts celler. Enkeltceller var gated basert på fremover og side Scatter. CD34- celler ble valgt ved farging med ANTISTOFF mot CD34 (APC-Cy7). Myelogen linjene i CD34- populasjonen ble analysert med ANTISTOFFER mot CD14 (PE), CD66B (PE-Cy7), CD41 (PerCP-CY 5.5) og CD235A (APC) på dag 1 (A) og dag 21 (B). Monocytter er CD14+/CD66b-, granulocytter er CD14-/CD66b+, megakaryocytter er CD41+/CD235a- og erytroide celler er CD41-/CD235a+. Representative scatter plott fra et eksperiment vises. Brøkdeler av monocytter, granulocytter, megakaryocytter, og erytroide celler i CD34- populasjonen på dag 1 og dag 21 er representert (C). Data som presenteres er gjennomsnitt med standard feil fra minst tre uavhengige eksperimenter. Dette tallet har blitt modifisert fra Bapat et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representative bilder av HSPCs og differensiert celler. CD34+ HSPCs (A) og celler fra myelogen kulturer på dag 21 (B) ble farget med Wright-Giemsa flekken. Celler som tilsvarer granulocytter (svarte piler), monocytter (blå piler) og erytroide celler (røde piler) vises. Skala linjer representerer 10 mm. Dette tallet har blitt modifisert fra Bapat et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er egnet for ex vivo differensiering av UCB avledet CD34+ HSPCs til de fire myelogen linjene. Initial inkubasjons med en cytokin blanding bestående av SCF, TPO, Flt3L og IL3 stimulerer CD34+ celler. Deretter er differensiering oppnås med en cocktail av SCF, IL3, Flt3L, EPO, og TPO. I denne blandingen, SCF, IL3, og Flt3L er viktig for overlevelse og spredning av CD34+ HSCS. EPO og TPO fremme differensiering mot erytrocytter og megakaryocytter, henholdsvis, og IL3 fremmer differensiering av tidlig granulocytt-monocytt forløpere og modne celler13,17,18. En påminnelse til denne metoden er observert variasjon i prosenter av differensiert celler. Dette kan være på grunn av forskjeller i kapasiteter av CD34+ HSPCs isolert fra ulike givere for å gi opphav til avstamning celler.
Laget av MS-5-celler er avgjørende for effektiv differensiering av CD34+ HSPCs. I vår erfaring, MS-5-cellene må være belagt minst 24 timer før seeding i CD34+ celler. Det er viktig å opprettholde samløpet av MS-5 celler på 80-90%. Overconfluent MS-5 celler har en tendens til å løsne, og lavere confluency fører til redusert differensiering. Under inkubasjons, CD34+ celler utvides med ~ 50-fold. De blir confluent av dag 14 og må høstes og deles inn i flere brønner som inneholder MS-5 celler på en ny plate.
Hyppigheten av medie endringer er også avgjørende for effektiv differensiering og må utføres hver 3-4 dag for å opprettholde optimale cytokin konsentrasjoner. Færre medie endringer og lavere cytokin konsentrasjoner, både føre til en reduksjon i spredning og differensiering av CD34+ HSPCs. Dette kravet for store mengder cytokiner kan betydelig øke kostnadene og dermed er en begrensning av denne protokollen. En annen begrensning for stor skala eksperimenter er antall CD34+ celler innhentet fra en enhet av ledningen blod. Vanligvis, en frisk UCB enhet av ~ 100 mL gir ca 1 000 000 CD34+ celler. Lagring av enheten utover 24 timer reduserer utbyttet betraktelig. Videre tap av renhet av CD34+ celler kan oppstå under kolonnen vaske trinnene som er viktige for å fjerne eventuelle umerkede forurensende celler. Hvis kolonnen tresko under vasken trinn, anbefales det at de bundne cellene fra tett kolonne være eluert og RELOADED på en ny kolonne for å få en ren befolkning på CD34+ celler.
I litteraturen har ulike cytokin-kombinasjoner blitt rapportert som fremmer differensiering mot enten megakaryocytic, erytroide eller granulo-monocytt linjene19,20,21,22 . En fordel med denne protokollen er at den tillater differensiering langs alle fire myelogen populasjoner, nemlig monocytter, granulocytter, megakaryocytter, og erytrocytter. Således kan det være ansatt for å studere normal myelogen differensiering og for å undersøke effekten av myelogen sykdom (myelodysplastisk syndromer, akutt myelogen leukemi, "myeloproliferative svulster, og andre) knyttet punkt mutasjoner og Kromosom translokasjoner på molekylær og cellulær fenotype under spredning og differensiering av CD34+ celler11,12,23,24,25. Denne protokollen kan også være ansatt for å undersøke virkningen av anti-og Pro-inflammatorisk cytokiner, og av potensielle terapeutiske legemidler på myelogen differensiering26,27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Wendy Barrett, Rachel Caballero, og Gabriella Ruiz av Maricopa integrert Health Systems for de-identifisert og donert ledningen blod enheter, Mrinalini Kala for assistanse med Flow flowcytometri, og Gay crooks og Christopher seet for råd om ex vivo myelogen differensiering. Dette arbeidet ble støttet av midler til S.S. fra National Institutes of Health (R21CA170786 og R01GM127464) og American Cancer Society (den institusjonelle Research Grant 74-001-34-IRG). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
