Summary
Здесь описывается анализ антител без пробирки для прямого анализа активности метилтрансферазы на синтетической или в пробирке транскрибированной РНК.
Abstract
Существует более 100 химически различных модификаций РНК, две трети из которых состоят из метилирования. Интерес к изменениям РНК, и особенно метилирования, вновь появился из-за важной роли, которую играют ферменты, которые пишут и стирают их в биологических процессах, имеющих отношение к болезням и раку. Здесь, чувствительный анализ in vitro для точного анализа деятельности писателя метилирования РНК на синтетических или in vitro транскрибированных РНК предоставляется. В этом ассее используется тритированная форма S-аденосил-метионина, что приводит к прямой маркировке метилированной РНК тритием. Низкая энергия излучения трития делает метод безопасным, а уже существующие методы усиления сигнала трития позволяют количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам. Хотя этот метод написан для РНК метилирования, несколько настроек сделать его применимым к изучению других изменений РНК, которые могут быть радиоактивно помечены, такие как РНК ацетилирование с 14C ацетил кофермент A. В целом, этот вывод позволяет быстро оценить РНК метилирование условия, ингибирование с небольшими ингибиторами молекулы, или эффект РНК или фермента мутантов, и обеспечивает мощный инструмент для проверки и расширения результатов, полученных в клетках.
Introduction
ДНК, РНК и белки подвержены изменениям, которыежестко регулируют экспрессию генов 1. Среди этих модификаций метилирование происходит на всех трех биополимерах. Метилирование ДНК и белка было очень хорошо изучено в течение последних трех десятилетий. В отличие от этого, интерес к метилированию РНК был только недавно возродился в свете важной роли, что белки, которые пишут, стирают или связывают РНК метилациляции играют в развитии и болезни2. В дополнение к более известным функциям в обильных рибосомных и передачи РНК, РНК метилирования пути регулируют конкретные посыльного РНК стабильности3,4, сращивание5 и перевод6,7, miRNA обработки8,9 и транскрипционной паузы и выпуска10,11.
Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в условиях лаборатории молекулярной биологии (обобщено на рисунке 1). Многие исследования оценивают активность РНК метилтрансферазы через точечную подрамность с антителом против изменения интереса РНК. Однако, точка-блот не проверяет целостность РНК при инкубации с метилтрансферазой РНК. Это важно, потому что даже незначительные загрязнения рекомбинантных белков с нуклеазой может привести к частичной деградации РНК и смешанные результаты. Более того, даже высокоспецифические антитела к модификации РНК могут распознавать неизмененные РНК с определенными последовательностями или структурами. In vitro RNA метилтрансферазы анализ сообщил здесь использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть трилциатна на метиловой группы донора (Рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител . Инструкции предусмотрены для экстракорпорной транскрипции и очистки стенограммы интереса и тестирования метилирования указанной транскрипта ферментом интереса. Этот метод является гибким и надежным и может быть скорректирован в соответствии с потребностями того или иного проекта. Например, в пробирке транскрибируются и очищены РНК, химически синтезированные РНК, но и клеточные РНК могут быть использованы. Этот ассси обеспечивает количественную информацию в виде сцинтилляции, а также качественную информацию, показывая, где именно метилированная РНК работает на геле. Это может обеспечить уникальное понимание функции РНК метилтрансферазы, особенно при использовании клеточных РНК в качестве субстрата, так как он обеспечивает метод непосредственного наблюдения размер РНК или РНК, которые предназначены для метилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Транскрипция в пробирке и гель очищение целевой РНК
- Клон последовательность интереса в плазмиды, содержащие T7 и / или SP6 промоутеров с использованием установленных молекулярных методов клонирования12 или комплекты.
- Линейная версия шаблона ДНК для транскрипции in vitro
- Увеличьте последовательность интереса pcR плазмида с грунтовки предназначены для включения T7 промоутер региона через вставку, 20-30 bp вверх по течению и вниз по течению, как ранее описано13.
- Кроме того, дайджест 5 мкг плазмиды с помощью фермента ограничения (RE) сократить сайт доступны вниз по течению вставки в соответствии с инструкциями, предоставляемыми поставщиком RE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте перепроверить, что вставка не вырезана выбранным RE. Выбор RE, используемый в этом шаге, может существенно повлиять на доходность стенограммы. Преференциально, линейно с тупым или 5'-нависающие конца производства RE, чтобы избежать переключения шаблона T7 РНК полимераза на противоположной нити ДНК14. Попробуйте различные RE, если первоначальные урожаи недостаточны.
- Очистите полученную ДНК с помощью комплекта для экстракции и очистки геля агарозы. Выясните ДНК с 30 л воды.
- Хорошо перемешайте путем вихря, пайпета 1,5 л и измерить концентрацию ДНК с помощью микротомного спектрофотометра.
- Используйте 250 нг ДНК, чтобы проверить качество и размер очищенной ДНК на 1% агарозного геля электрофореза в 1x буфере TBE мигрировали в течение 1 ч при 4 V/cm.
- Оттепель замороженных реагентов комплекта транскрипции in vitro. Поместите T7 РНК Полимераза Mix на льду, а другие реагенты на nutator при комнатной температуре. Сразу же после полного оттаивания, быстро спина rNTP труб в течение 5 с, чтобы собрать раствор на дне труб и место на льду. Держите 10x Реакции буфера при комнатной температуре, чтобы избежать осадков.
- Труба в трубку 1,5 мл следующие компоненты реакции транскрипции 20 л при комнатной температуре в указанном порядке: 6 л воды, 2 л (0,1 - 1 мкг) линейного шаблона ДНК, 2 л раствора АТФ, 2 л раствора GTP 75 мМ , 2 л из 75 мм CTP раствора, 2 л из 75 мМ UTP раствор, 2 зл и 10x реакции буфера и 2 Зл T7 РНКА-микс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шаблона ДНК, генерируемого ПЦР, используйте 100 - 200 нг ДНК; для шаблона ДНК, генерируемого ферментным дайджестом ограничения плазмиды,используйте 1 мкг. Активный рекомбинантный Его 6-тегами T7 РНК Полимераза может быть очищена в E. coli15. - Тщательно перемешайте трубку. Быстрый спин в течение 5 с, чтобы собрать раствор реакции в нижней части трубки, а затем инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 2-4 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая стенограмма будет вести себя по-разному в зависимости от шаблона ДНК, его длины, последовательности или структуры. Оптимизируйте условия транскрипции in vitro путем тестирования различных периодов инкубации до 6 ч; различные концентрации шаблона ДНК, T7 РНК Полимераза, или NTP; или добавление дополнительного MgCl2 к тому, что присутствует в T7 РНК Полимераза Mix. - В конце инкубационного периода добавьте 1 qL DNase I на реакцию 20 л и инкубируют при 37 градусах По цельсии в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция транскрипции может быть временно сохранена на льду до тех пор, пока полиакриламид гель не будет готов. - Продолжить очистку полиакриламидным гелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку РНК чувствительна к рН и загрязнению RNase, используйте СПЕЦИАЛЬНОе оборудование РНК и реагенты без RNase. - Определить процент полиакриламид для геля в зависимости от размера стенограммы процентов: 3,5% за 100-2000 nt (XC: 460 nt; BB: 100 nt), 5% за 80-500 nt (XC: 260 nt; BB: 65 nt), 8% за 60-400 nt (XC: 160 nt; BB: 45 nt), 12% за 40-200 nt (XC: 70 nt; BB: 20 nt), 15% за 25-150 nt (XC: 60 nt; BB: 15 nt), и 20% для 6-100 nt (XC: 45 nt; BB: 12 nt).
- Подготовка мочевины denaturing полиакриламид гель путем объединения следующих реагентов в 50 мл конической трубки: 9,6 г молекулярного класса мочевины, 2 мл 10x TBE, х мл 40% акриламид:bis-acrylamide смесь (29:1) и воды до 20 мл знака на трубе , где х 20 мл/(40%/процент геля %).
ВНИМАНИЕ: Полякриламид гели часто содержат ООН-полимеризованный акриламид, который является токсичным материалом, который может производить опасность при введении в окружающую среду. Утилизация гелей полиакриламидов в рамках программы по химическим отходам учреждения. - Микроволновая печь для 15 с при 30% мощности. Поставить на nutator в течение 10 минут при комнатной температуре или до полного растворения мочевины.
- В то время как гель смесь вращается, получить гель кассеты (18-ну, 1 мм толщиной; 13,3 х 8,7 см (W х L)), удалить гребень и положение кассеты для гель литья.
- Быстрый спин 50 мл трубки для 5 с, чтобы собрать гель раствор в нижней части трубки. Добавьте 125 л 10% раствора персульфата аммония (APS). Место на nutator в течение 1 мин. Быстрый спин снова в течение 5 с.
- Добавьте 25 л тетраметилэтиленэдиамиамин (TEMED) и тщательно перемешайте, прокладывая вверх и вниз 5 раз с помощью 25 мл пипетки, избегающей пузырьков.
- Пипетка в гель литые и тщательно вставить гель гребень избегая пузырьков.
- Затяните печать, добавив большой зажим связующего поверх кассеты.
- Разрешить гель полимеризации в течение 1 ч.
- После того, как гель затвердел, удалите связующего клипа. Вставьте кассету в коробку электрофореза. Добавьте буфер 1x TBE в верхние и нижние резервуары.
- Извлекаем реакцию транскрипции. Добавьте воду до 100 л, затем добавьте 100 зл 2x Гель Загрузка буфера. Подготовьте лестницу, смешивая рекомендуемое количество с водой до 10 л и 10 л 2x gel Загрузка буфера в отдельной трубке 1,5 мл.
- Инкубировать как лестницу и в пробирке транскрипции реакции в термомиксер на 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
- В то время как образцы денатурируются при 70 градусах Цельсия, тщательно удалите гребень, очистите колодцы, прокладывая вверх и вниз каждый колодец с пипеткой P1000, и сразу же предварительно запустить в течение 10 мин при 100 В.
- После того, как образцы завершили их 15 мин денатурации при 70 градусов по Цельсию, удалить трубки из термомиксера и сразу же поместите на лед.
- Очистите каждый колодец геля снова с пипеткой P1000. Загрузите 20 зл лестницы на первой скважине влево, 20 зл и л образца РНК на 10 отдельных скважинах и 20 Зл 1x гель-загрузочный буфер на неиспользованные скважины.
- Выполнить гель при 100 В в течение 60 -240 мин, в зависимости от % полиакриламид геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: красители в гель Загрузка Буфер будет отделяться на две полосы, как они пересекают гель, медленно мигрирующих Bromophenol Blue (BB) синяя полоса, и быстро мигрирующих Xylene Cyanol (XC) голубой группы. Приблизительная миграция этих полос в различных полякриламидных гелях хорошо известна (см. шаг 1.11) и может быть использована для оценки миграции РНК в геле. - После того, как гель был остановлен, тщательно удалить гель из кассеты.
- Поместите гель в чистую коробку, содержащую раствор 50 мл 1x буфера TBE с 50 злящееся нуклеиновой кислоты геля и инкубировать в течение 5 минут на рокер, чтобы испачкать РНК.
- Возьмите до и после группы иссечения изображение геля на гель изображений системы, предпочтительно с помощью синего света вместо УФ-трансиллюмина.
- Акциз каждой группы интересов с помощью nuclease-бесплатно одноразовый гель резки отзыв. После каждого хорошо, передача наконечник, содержащий гель ломтик 1,5 мл трубки и кратко спина, чтобы собрать ломтик геля. Повторяйте до тех пор, пока все полосы не будут собраны в ту же трубку 1,5 мл.
- После того, как все ломтики геля были собраны, добавьте 100 л безнулевой воды или TE буфера в трубку 1,5 мл. Хранить при 4-C для 48 ч. Это позволяет РНК выйти из геля ломтики в раствор.
- После 48 ч, pipet воды или TE буфера для свежей трубки 1,5 мл. Удалите оставшиеся ломтики геля. Очистите РНК с помощью комплекта очистки следующим образом.
- Равновесие спиновой колонки при комнатной температуре не менее 30 мин.
- К 100 л раствора РНК в новой трубке 1,5 мл со ступени 1,32, добавьте 350 л буфера RLT и хорошо перемешайте в течение 2 мин на nutator. Спин для 1 с при 200 х г, чтобы собрать раствор в нижней части трубки.
- Добавьте 675 кл. 100% EtOH и хорошо перемешайте в течение 2 мин на nutator. Спин для 1 с при 200 х г и сразу же перейти к следующему шагу.
- Передача 565 л смеси на спин-колонку и вращаться в течение 1 мин при 15000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
- Повторите предыдущий шаг со второй половиной выборки.
- Добавьте 500 кЛ буфера RPE к столбце и закрутите в течение 1 мин при 15 000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
- Добавьте 750 л 80% этанола в колонку и закрутите в течение 1 мин при 15 000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
- Поместите колонку в новую трубку коллекции 2 мл с открытой крышкой и вращаться при 15 000 х г в течение 5 минут.
- Перенесите колонну на новую трубку 1,5 мл.
- Добавьте 17 кл воды в центре колонны и вращайтесь при 15 000 х г в течение 1 мин. Elute снова с помощью еще 17 л воды. Общий объем извлеченных должен составят 32 л.
- Хорошо перемешайте путем вихря, пайпета 1,5 зл и измерить концентрацию РНК с помощью микротома спектрофотометра.
- Проверьте качество очистки РНК с помощью геля полиакриламидного полиакриламида, так как в шагах 1.11-1.29.
2. In vitro РНК метилтрансферазы анализ
- Настройка 100 Л РНК метилтрансферазы асссе в 1,5 мл трубки на льду следующим образом: 23 л воды, 10 мЛ 10x TBS (500 мм Tris-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl), 2 л 0,05 М EDTA, 5 мЛ 100 мМ DT , 40 зл 50% глицерола, 4 Зл из 58 ММ 3H-SAM, 5 Зл 20x Протеазы Ингибитор Коктейль, 1 Зл RNaseOUT (по желанию), 5 Л РНК и 5 Л метилтрансферазы.
ВНИМАНИЕ: Радиоактивные трииатированные материалы опасны и должны обрабатываться только во время ношения перчаток, лабораторного пальто и любого другого необходимого СИЗ. Все наконечники пипетки и трубки, контактные с радиоактивным материалом, считаются твердыми радиоактивными отходами. Утилизировать все твердые и жидкие радиоактивные отходы в соответствии с утвержденным лабораторией протоколом радиоактивных отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включите контрольные образцы без метилтрансферазы и без РНК. Концентрации реагентов могут потребовать оптимизации и/или включения растворимых солей катионов, таких как MgCl2, или немаркированных SAM. Оптимальный диапазон конечной концентрации РНК составляет от 50 нм до 1 ММ, в то время как концентрация метилтрансферазы составляет от 25 нм до 300 нм. - Тщательно перемешайте, аккуратно завихряя трубку. Спин 5 с на 200 х г, чтобы собрать раствор в нижней части трубки. Инкубировать трубку (ы) при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
- Очистка реакции с помощью очистки столбца, как в шаге 1.32.
ВНИМАНИЕ: Будьте очень осторожны, чтобы правильно утилизировать любые радиоактивные материалы, особенно во время колонны моет (пипетка из вместо аспирации отходов из коллекторских труб). - Выполните количество жидких мерцаний
- Настроили стойку сцинтилляции с одним флаконом на образец, один флакон для измерения фона и один флакон для теста салфетки. Заполните флаконы 5 мл раствора сцинтилляции.
- Добавьте 10 кл/л каждого электорарадиового образца РНК в 1 флакон, затяните крышку и аккуратно перемешайте.
- Подготовьте флаконы теста салфетки. Тщательно руб ватные тампоны на всех поверхностях и оборудования, используемых во время протокола. Добавьте тампоны в флаконы, наполненные 5 мл раствора сцинтилляции, и затяните крышку.
- Запустите образцы на счетчике сцинтилляции следующим образом. Откройте капот, вставьте стойку в машину и закройте капот. Выберите граф ат-тач. Выберите пользовательскую программу. Выберите или создайте программу, которая измеряет тритий (3H) для 60 s. Hit Count Rack. Повторите сцинтилляцию рассчитывать три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование будет измерять количество сцинтилляции каждого образца и выход как на экране, так и на распечатку. Протокол можно приложить здесь при желании. Оставшиеся образцы РНК со ступени 2.3 должны быть заморожены при -80 градусов по Цельсию для последующего использования.
- Продолжить с авторадиограммы
- Подготовка и предварительно запустить мочевины денатурируя полиакриламид гель, как в шагах 1.11-1.20.
- Пипетка 20 л радиоактивного РНК-материала в новую трубку 1,5 мл, содержащую 20 л 2x гель-загрузочный буфер. Хорошо перемешать. Подготовьте лестницу как в шаге 1.21. Инкубировать образцы при 70 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
- Вымойте скважины геля еще раз непосредственно перед загрузкой образца. Нагрузка 20 зл и лестницы, 20 зл и 20 зл 1x Гель Загрузка буфера на оставшихся полосах. Выполнить гель при 100 В в течение 60-180 мин, в зависимости от процента полиакриламид.
- Как только гель заканчивает работу, удалите гель из кассеты и поместите его в коробку, содержащую 50 мл 1x буфера TBE с 5 Зл ультрачувствительных нуклеиновой кислоты гель пятно.
- Инкубировать в течение 5 минут на рокер, чтобы испачкать РНК.
- Аккуратно возьмите гель из коробки и поместите его на УФ-трансиллюнтор системы гель изображений с колодцами вверх и лестницей слева.
- Сосредоточьте камеру на гель, включите ультрафиолетовый свет, а затем принять изображение геля, подвергая от 50 мс до 1 с в зависимости от интенсивности сигнала.
- Выключите УФ-экспозицию и сохраните изображение в виде файла Tiff.
- Поместите гель обратно в коробку. Удалить TBE. Закрепите гель с 50 мл крепячего раствора (50% метанола, 10% уксусной кислоты, 40% ультра-чистой воды) в течение 30 минут при комнатной температуре на рокере.
- Аккуратно переместите гель снова в свежий черный ящик, содержащий 25 мл саморапривающего раствора. При отсутствии черного ящика накройте коробку алюминиевой фольгой, чтобы защитить раствор от света.
- Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре на рокере.
- Аккуратно поднимите гель и поместите его лицом вниз на лист полиэтиленовой пленки с колодцами вверх и лестницей на правой стороне. Поместите два листа хроматографической бумаги на заднюю часть геля. Аккуратно переверните весь стек.
- Предварительно разогреть гель сушилку до 80 градусов по Цельсию. Отодвите пластиковую крышку на сушилке для геля. Вставьте пленку, гель и хроматографию бумаги стек под пластиковой крышкой и переместить пластиковую крышку обратно вниз, чтобы создать печать.
- Высушите 1 ч при 80 градусах По Цельсия в сушилке для геля.
- Выключите гель сушилку и аккуратно снимите стек. Удалите пленку и вторую хроматографической бумагу. Лента оставшихся хроматографии бумаги с высушенным гелем в авторадиограмме кассеты.
- Добавьте 1 лист ауторадиграфической пленки в темной комнате.
- Поместите кассету при -80 градусов по Цельсию и разработайте пленку через 1 ч до 4 недель в зависимости от интенсивности сигнала, о чем можно судить по ранее измеренным подсчетам мерцания: 1-4 недели для 250-1000 cpm, 24 ч до 1 недели для 1000-10000 cpm и 1 h до 24 h для М.
- После того, как фильм разработан, поместите пленку на верхней части кассеты и тщательно отметьте лабораторным маркером 4 края геля, каждый хорошо, и положение красителей XC и BB.
- Сканирование пленки на 300 или 600 пикселей на дюйм разрешение и сохранить изображение как файл Tiff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Реакция транскрипции в пробирке
Рисунок 2 A представляет собой типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой РНК T7 7SK snRNA, которая является относительно короткой (331 nt) и высоко структурированной РНК. Как показано на этом исходном изображении, есть несколько нежелательных полос, как короче, так и дольше, чем 7SK, вероятно, в результате случайных транскрипционных событий инициации или прекращения. Из-за этого, очистка геля после реакции транскрипции in vitro имеет важное значение для получения чистой РНК-образца, как показано на рисунке 2B. На данный момент, РНК интерес может быть определена по его расположению по отношению к лестнице и очищены путем очистки геля.
Как упоминалось ранее, это может быть необходимо для оптимизации длины транскрипции реакции до шага очистки геля. Транскрипционные реакции, которые работают слишком долго, могут привести к чрезвычайно высокому количеству РНК-продукции, что затрудняет идентификацию правильной транскрипта ниже по течению. Важно также проверить личность очищенной транскрипта по обратной транскрипции и количественной PCR (RTqPCR) с помощью конкретных грунтовок.
Анализ метилтрансферазы в пробирке РНК
На рисунке 3 показан репрезентативный результат анализа метилтрансферазы РНК, описанного в протоколе с использованием нижнего предела рекомендуемой РНК и концентраций белка. Этот асссеможно как для количественных результатов от сцинтилляции, так и качественных результатов авторадиограммы. Здесь, MePCE, РНК метилтрансферазы известно метилата 7SK10, было показано, чтобы быть в состоянии также метилировать U6. Кроме того, как недавно показано для 7SK16, связывание гистона H4 к MePCE также подавляет метилирование U6. Мы смогли наблюдать это как в сцинтилляции кол(Рисунок 3C) и авторадиограммы (Рисунок 3B), показывая надежность этого протокола.
Рисунок 1 . Схематическое представление типичного рабочего процесса ассеиса по ассеу РНК-метилтрансферазы и ожидаемых результатов. Синефунгин является конкурентоспособным ингибитором метилтрансферазы. L: лестница; WT: дикий тип; M: каталитический мутант; cpm: количество за минуту, пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . Представитель эксперимент, показывающий продукт экстракорпорной транскрипции до (A) и после (B) очистки на денатурации мочевины-полиакриламид 8% гель окрашенных нуклеиновой кислоты пятно. Стрелки указывают на стенограмму 7SK до и после очистки геля. L: лестница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 . In vitro RNA метил-трансферазный анализ выполняется с MePCE против U6. In vitro methyltransferase анализ с использованием рекомбинантных GST-MePCE (25 нм), 3H-радиоактивных SAM в качестве донора метиловой группы и в пробирке транскрибируется U6 РНК (50 нм) в качестве субстрата. Авторадиограмма была выставлена в течение 2 недель для того, чтобы обнаружить остаточную активность (250 cpm) в образце «Histone H4». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в отношении конкретных транскриптов. Ассаи использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть тритиациарет на метилгруппы донора(рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител. Однако, важно отметить, что этот анализ не может указать, какие остатки или химической группы метилируется ферментом. Для выявления или проверки того, что конкретный остаток метилирован, другие методы, такие как мутационный анализ, обратный блок транскрипции или анализ масс-спектрометрии субстрата РНК могут быть использованы в сочетании с анализом метилтрансферазы РНК.
Выбор РНК и их способ синтеза зависит от размера РНК. Специфические РНК размеров от 18 до 120 nt могут быть удобно синтезированы на заказ от многих авторитетных поставщиков нуклеиновой кислоты. Однако, чаще всего, конкретные РНК различных размеров в пробирке транскрибируется. Шаблоны ДНК для транскрипции in vitro могут быть сгенерированы различными способами и требуют расположения последовательности интересов ниже по течению промоутера T7 или SP6. Когда точные концы РНК имеют важное значение, плазмида рРЗ рекомендуется17. Высокая чувствительность асссея(рисунок3) также позволяет заменить очищенную РНК смесью клеточной РНК, то всего или мессенджера РНК, например. Действительно, гель и авторадиограмма обеспечивают способ непосредственного наблюдения размера РНК (ы), предназначенные для метилирования.
Условия, о которых сообщается здесь в шаге 2.1 протокола, являются оптимальными для семейства метилтрансфераз BIN3, которое имеет два омолога у человека, MEPCE10 и BCDIN3D9. Важно подчеркнуть, что условия асссея должны быть адаптированы к специфическому белку и РНК интерес. Например, было показано, что присутствие MgCl2 уменьшает активность BCDIN3D18, однако, MgCl2 может быть важным координатором структуры РНК, и, таким образом, может представлять собой важный компонент асссирования для других РНК метилтрансферазы.
Преимущество использования авторадиограммы, которая может подвергаться в течение длительного периода времени, заключается в том, что она может позволить обнаружить очень слабую активность, которая не обнаруживается в сцинтилляционном асссе. Обычно это указывает на то, что белок является метилтрансферазой, но что один или несколько условий реакции или реагентов должны быть оптимизированы: фермент; субстрат, кофактор, буферные условия и т.д.9. Например, очистка фермента может потребоваться улучшить, чтобы удалить или изменить положение тега. Это также может быть, что РНК, используемая в качестве субстрата должна быть сложена должным образом или взаимодействовать с другим белком или РНК-фактор, который будет метилирован ферментом. Таким образом, уже существующие литературы и / или собственные результаты в клетках должны быть тщательно рассмотрены для создания условий проверки фермента и РНК интерес.
Ассес также чрезвычайно гибок. Например, это может быть шагом-предшественником другого типа анализа, так что радиоактивно метилированная РНК используется в количественных и качественных деметиллазы хассий11, или в РНК связывающих анализов, позволяющих специально визуализировать поведение метилированная РНК по сравнению с неизмененной. Анализ также может быть слегка скорректированы для анализа модификации РНК, которые используют коэнзимы, которые могут быть радиоактивно помечены, такие как ацетил кофермент а для изучения РНК ацетилирование19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Турью Канти Дебнатх за помощь в ChemDraw. Исследования в лаборатории Xhemal'e поддерживается Министерством обороны - Конгресс направлены медицинские исследования программы - Рак молочной железы Прорыв премии (W81XWH-16-1-0352), NIH Грант R01 GM127802 и запуск средств от Института сотовой и Молекулярная биология и Колледж естественных наук техасского университета в Остине, США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
