Summary
Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.
Abstract
RNA 'da 100 ' den fazla kimyasal olarak farklı değişiklikler vardır, üçte ikisi metilasyonlardan oluşur. RNA modifikasyonları ve özellikle metilasyonlar ile ilgili ilgi, hastalık ve kanserle ilgili biyolojik süreçlerde bunları yazarak ve silen enzimlerin oynadığı önemli roller nedeniyle yeniden ortaya çıkmıştır. Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNAs üzerinde RNA metilasyon yazar aktivitesinin doğru analizi için hassas bir in vitro tahlil sağlanır. Bu tahlil S-adenosyl-metiyonin bir tritiated formu kullanır, tritium ile metilated RNA doğrudan etiketleme sonucu. Trityum radyasyon düşük enerji yöntemi güvenli hale getirir, ve önceden mevcut trityum sinyal amplifikasyon yöntemleri, ölçmek için mümkün kılmak ve antikorlar kullanmadan metylated RNA görselleştirmek için, genellikle eserler eğilimli olan. Bu yöntem RNA metilasyonu için yazılırken, birkaç tweaks radyoaktif olarak etiketlenmiş olabilir diğer RNA modifikasyonları çalışma için geçerli hale, 14C Asetil koenzim A ile RNA asetilasyon gibi. genel olarak, bu TAHLIL hızlı RNA değerlendirmek için izin verir metilasyon koşulları, küçük molekül inhibitörleri ile inhibisyonu veya RNA veya enzim mutantlarının etkisi, hücrelerde elde edilen sonuçları doğrulamak ve genişletmek için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
DNA, RNA ve proteinler gen ifadesi1 'i sıkıca düzenleyen değişikliklere tabidir. Bu değişiklikler arasında, üç biopolymers üzerinde metilasyonlar ortaya çıkar. DNA ve protein metilasyonları son üç yılda çok iyi incelenmiştir. Buna karşılık, RNA metilasyonlarının ilgi alanı sadece son zamanlarda, RNA metilasyonları yazma, silme veya bağlama proteinlerinin geliştirme ve hastalık2' de oynacağı önemli rollerin ışığında reignited olmuştur. Bol ribozomal ve transfer Rnas 'da daha iyi bilinen fonksiyonlara ek olarak, RNA metilasyon yolları özel haberci RNA stabilitesi3,4, yapıştırma5 ve Translation6,7, Mirna işleme8,9 ve transkripsiyonel duraklatma ve sürüm10,11.
Burada, moleküler biyoloji laboratuarında RNA metiltransferaz aktivitesinin in vitro olarak doğrulanması için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir ( Şekil 1' de özetlenmiştir). Birçok çalışmada RNA 'nın metiltransferaz aktivitesini dot-blot ile bir antikor ile bir antikorla karşılaştırın. Ancak, dot-blot RNA metiltransferaz ile kuluçka üzerine RNA bütünlüğünü doğrulamaz. Bu önemlidir, çünkü nükller ile rekombinant proteinlerin bile küçük kontaminasyonları kısmi RNA bozulması ve şok edici sonuçlara yol açabilir. Dahası, yüksek spesifik RNA Modifikasyon antikorları bile değiştirilmiş RNAs 'ı belirli diziler veya yapılarla tanıyabilir. Burada bildirilen in vitro RNA metiltransferaz tahlil S-adenöl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeği yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin . Talimatları in vitro transkripsiyon ve faiz ve metilasyon test bir transkript arıtılması için verilir, ilgi enzim tarafından transkript söyledi. Bu yöntem esnek ve sağlamdır ve belirli bir projenin ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Örneğin, in vitro transkripsiyonu ve saflaştırılmış RNAs, kimyasal olarak sentezlenmiş RNAs, aynı zamanda hücresel RNAs kullanılabilir. Bu tahlil, tam olarak metilated RNA 'nın bir jel üzerinde çalıştığı yeri göstererek nitel bilgilerin yanı sıra scintite sayar formunda niceliksel bilgiler sağlar. Bu, özellikle metilasyon için hedeflenen RNA veya RNAs boyutunu doğrudan gözlemlemek için bir yöntem sağladığı için, bir RNA metiltransferaz fonksiyonuna benzersiz bir anlayış sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro transkripsiyon ve hedef RNA jel arıtma
- Kurulan moleküler klonlama teknikleri12 veya Kits kullanarak T7 ve/veya SP6 Rehberleri içeren plazmids ilgi dizisini klonlayın.
- İn vitro transkripsiyon için DNA şablonunun doğranallaştıran
- Daha önce13' ü açıklandığı gibi, + 20-30 BP upstream ve downstream ile T7 Organizatör bölgesini eklemek üzere tasarlanan astar ile Plasmid 'in PCR tarafından ilgi sırasını arttırın.
- Alternatif olarak, RE 'nin tedarikçisi tarafından sağlanan yönergelere göre, bir kısıtlama enzimi (RE) kesim sitesi kullanılarak Plasmid 5 μg ' ye kadar elde edilebilir.
Not: eklemin seçili RE tarafından kesildiğini iki kez kontrol etmeyi unutmayın. Bu adımda kullanılan RE seçimi, transkript verimini önemli ölçüde etkileyebilir. Tercihen, ters DNA Strand14üzerinde T7 RNA polimeraz şablonu geçiş önlemek için Re üreten bir künt veya 5 '-overhanging uç ile gerilim 'ını doğrusallaştırma. Başlangıç verimleri yetersiz ise farklı RE deneyin.
- DNA agaroz jel ekstraksiyon ve temizlik için Kit kullanarak ortaya çıkan DNA arındırın. DNA 'Yı 30 μL su ile elute.
- Bir mikrohacim spektrofotometresi ile miksleme, pipet 1,5 μL ve ölçüm DNA konsantrasyonu ile iyi karıştırın.
- 4 V/cm 'de 1 saat boyunca taşınan 1x TBE tamponunda% 1 agaroz jel elektroforezi üzerinde saf DNA 'nın kalitesini ve boyutunu kontrol etmek için DNA 250 ng kullanın.
- İn vitro transkripsiyon kitinin dondurulmuş reaktifini çözün. T7 RNA Polymerase Mix 'i buzun üzerine ve diğer Reaktifleri oda sıcaklığında bir çatlak üzerine yerleştirin. Tam Çözüleme işleminden hemen sonra, 5 s için rNTP tüplerini, tüplerin alt kısmında ve buzda yer alan bir çözüm toplamak için hızlı döndürün. Yağış önlemek için oda sıcaklığında 10X reaksiyon tampon tutun.
- Bir 1,5 mL tüp içine pipet belirtilen sırada oda sıcaklığında 20 μL transkripsiyon reaksiyonu aşağıdaki bileşenleri: 6 μL su, 2 μL (0,1-1 μg) doğrusal DNA şablonu, 2 μL 75 mM ATP çözeltisi, 2 μL 75 mM GTP çözümü , 2 μL 75 mM CTP çözeltisi, 2 μL 75 mM UTP çözeltisi, 2 μL 10X reaksiyon tamponu ve 2 μL, T7 RNA polimeraz karışımı.
Not: PCR tarafından oluşturulan DNA şablonu Için 100-200 ng DNA 'yı kullanın; bir plazmid kısıtlama enzim sindirimi tarafından oluşturulan DNA şablonu için, ~ 1 μg kullanın. aktif rekombinant onun6ETIKETLI T7 RNA polimeraz E. coli15' te arındırılabilir. - Tüpü iyice karıştırın. 5 s için hızlı spin, tüpün alt kısmında reaksiyon çözeltisi toplamak için 2-4 h 37 °C ' de inkük edin.
Not: her transkript farklı DNA şablonu, uzunluğu, onun sırası veya yapısı bağlı olarak davranacaktır. 6 saate kadar farklı kuluçk süreleri test ederek in vitro transkripsiyon koşullarını optimize edin; farklı miktarda DNA şablonu, T7 RNA Polymerase veya NTP; veya ek MgCl2 ' nın T7 RNA polimeraz karışımı 'nda mevcut olan şey için eklenmesi. - Kuluçdak döneminin sonunda, 20 μL reaksiyon başına 1 μL DNase ı ekleyin ve 37 °C ' de 15 dakika boyunca inkübasyon yapın.
Not: polyacrylamid jel hazır olana kadar transkripsiyon reaksiyonu geçici olarak buzda tutulabilir. - Poliakrilamid jel ile arıtma ile devam edin.
Not: RNA pH ve RNase kontaminasyonuna duyarlı olduğundan, RNA adanmış ekipman ve RNase-Free reaktifler kullanın. - Faiz transkript boyutuna bağlı olarak jel için Poliakrilamid yüzdesini belirlemek: 100-2000 NT için 3,5% (XC: 460 NT; BB: 100 NT), 80-500 NT için% 5 (XC: 260 NT; BB: 65 NT), 60-400 NT için% 8 (XC: 160 NT; BB: 45 NT),% 12 için 40-200 NT (XC: 70 NT; BB: 20 NT),% 15 için 25-150 NT (XC: 60 NT; BB: 15 NT), ve% 20 için 6-100 NT (XC: 45 NT; BB: 12 NT).
- 50 ml konik tüpte aşağıdaki reaktifleri birleştirerek üre denatüre Poliakrilamid jel hazırlayın: 9,6 g moleküler sınıf üre, 2 ml 10X TBE, x ml% 40 akrilamid: bis-Acrylamid Mix (29:1) ve su kadar 20 ml Mark tüp üzerinde , burada x = 20 mL/(40%/jel yüzdesi%).
DIKKAT: Poliakrilamid jelleri genellikle çevreye tanıtılan bir tehlike üretebilen toksik bir malzeme olan un-polimerize edilmiş akrilamid içerir. Polikakrilide jelleri kurumun kimyasal atık programına atın. - % 30 güç olarak 15 s için mikrodalga. 10 dakika oda sıcaklığında veya üre tamamen çözünmüş kadar nutator üzerine yerleştirin.
- Jel karışımı döner iken, bir jel kaseti almak (18-iyi, 1 mm kalınlığında; 13,3 x 8,7 cm (g x L)), tarak çıkarın ve jel döküm için kaseti konumlandırın.
- Hızlı spin 50 mL tüp için 5 s tüp altında jel solüsyonu toplamak için. 125% 10 amonyum Persülfat çözeltisi (APS) ekleyin. ~ 1 dakika için nutator üzerine yerleştirin 5 s için tekrar hızlı spin.
- 25 μL tetramethylethylenediamine (TEMED) ekleyin ve 25 mL 'Lik pipet baloncukları kaçınarak 5 kez pipetleme ile dikkatle karıştırın.
- Jel döküm içine pipet ve dikkatle jel tarak kaçınarak kabarcıkları takın.
- Kasetin üst kısmına büyük bir bağlayıcı klip ekleyerek mührü sıkın.
- Jel için polimerize izin 1 h.
- Jel katılaşmış sonra, Binder klip çıkarın. Kaseti Elektroforez kutusuna takın. Üst ve alt rezervuar içine 1x TBE tampon ekleyin.
- Transkripsiyon reaksiyonu al. 100 μL 'ye kadar su ekleyin, sonra 100 μL 2x jel yükleme tamponu ekleyin. Önerilen miktarı su ile 10 μL ve 10 μL 2x jel yükleme tamponunu ayrı bir 1,5 mL tüpüne karıştırarak merdiveni hazırlayın.
- 70 °C ' de 15 dakika boyunca termomixer 'de merdiven ve in vitro transkripsiyon reaksiyonu inküye.
- Numuneler 70 °C ' de denatleme yaparken, tarağı dikkatlice çıkarın, bir P1000 pipet ile her bir kuyudan yukarı ve aşağı pipetleyerek kuyuları temizleyin ve 100 V 'de 10 dakika boyunca hemen önceden çalıştırın.
- Numuneler 70 °C ' de 15 dk denatürasyonu tamamladıktan sonra, tüpleri thermomixer 'den çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
- Her iyi jeli, P1000 pipet ile tekrar temizleyin. İlk kuyudan sola 20 μL, 10 ayrı kuyularda RNA numunesi 20 μl ve yok edilmiş kuyularda 20 μL 1x jel yükleme tamponu yükleyin.
- Jel% Poliakrilamid bağlı olarak, 60-240 dk için 100 V 'de jel çalıştırın.
Not: jel yükleme tamponunun içindeki boyalar, jel, yavaş göç eden Bromophenol mavi (BB) mavi bant ve hızlı göç edilen Xylene Cyanol (XC) Camgöbeği bandı ile iki bandın içine ayrılır. Bu bantların% farklı Poliakrilamid jelinde yaklaşık göç iyi bilinmektedir (bkz. Adım 1,11) ve jel RNA göç tahmin etmek için kullanılabilir. - Jel durdurulduktan sonra, dikkatle kasetten jel çıkarın.
- Jeli, 50 μL nüklik asit jel lekesi ile 50 mL 1x TBE tamponu içeren temiz bir kutuya yerleştirin ve RNA 'nın Lekelenmek için bir rocker üzerinde 5 dakika boyunca inküye yapın.
- Jel görüntüleme sisteminde, tercihen UV transaydınlatma yerine mavi ışığı kullanarak, jelin önce ve sonra bant eksizyonu resmini çekin.
- Her bir grup faiz, bir çekirdeksiz tek kullanımlık jel kesme ucu kullanarak tüketim. Her iyi sonra, bir 1,5 mL tüp jel dilim içeren ucu transfer ve kısaca jel dilim toplamak için spin. Tüm bantlar aynı 1,5 mL tüpünde toplanıncaya kadar tekrarlayın.
- Tüm jel dilimleri toplandıktan sonra, 1,5 mL tüpüne 100 μL nuclease içermeyen su veya TE tampon ekleyin. ~ 48 h için 4 °C ' de saklayın. Bu, RNA 'nın jel dilimlerinden çözüme çıkmasına olanak sağlar.
- Sonra 48 h, pipet su veya TE tampon taze 1,5 mL tüp. Kalan jel dilimleri atın. RNA 'yi Temizleme Kiti ile aşağıdaki şekilde arındırın.
- Döndürme sütununu oda sıcaklığında en az 30 dakika dengelentir.
- Adım 1,32 ' den yeni 1,5 mL tüpünde 100 μL RNA çözeltisi için, bir nutator üzerinde 2 dakika için iyi bir RLT tampon ve mix 350 μL ekleyin. Spin 1 s at 200 x g tüp altında çözüm toplamak için.
- Eklemek 675 μL-in 100% EtOH ve mix iyi 2 dakika nutator üzerinde. Spin 1 s 200 x g at ve hemen sonraki adıma geçin.
- 565 μL 'i spin sütununa aktarın ve 15.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün. Toplama tüpünü aspirasyon ile boşaltın.
- Önceki adımı örnek ikinci yarısında yineleyin.
- 15.000 x g'de 1 dakika için sütuna 500 ΜL RPE tampon ekleyin ve döndürün. Toplama tüpünü aspirasyon ile boşaltın.
- Ekle 750 μL 80% etanol sütun ve spin 1 dakika içinde 15.000 x g. Toplama tüpünü aspirasyon ile boşaltın.
- Kapağı açık olan yeni 2 mL 'Lik bir toplama tüpüne yerleştirin ve 5 dakika boyunca 15.000 x g 'de döndürün.
- Sütunu yeni bir 1,5 mL tüpüne aktarın.
- Sütun merkezine 17 μL su ekleyin ve 15.000 x g 'ye 1 dakika boyunca döndürün. Elute bir kez daha 17 μL su kullanıyor. Toplam kurtarılan hacim 32 μL olmalıdır.
- Vortexing tarafından iyi karıştırın, pipet 1,5 μL ve RNA konsantrasyonunu bir mikrohacim spektrofotometre kullanarak ölçmek.
- , 1.11-1.29 adımlarında olduğu gibi üre denatüre Poliakrilamid jel ile RNA arıtmanın kalitesini kontrol edin.
2. In vitro RNA metiltransferaz tahlil
- 100 μL RNA metiltransferaz tahlili ile buz üzerinde 1,5 mL 'Lik bir tüpte aşağıdaki gibi ayarlayın: 23 μL su, 10 μL 10X TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL, 0,05 M EDTA, 5 μL, 100 mM DTT , 40 μL 50% gliserol, 4 μL 58 μM 3H-Sam, 5 μL 20X proteaz Inhibitörü kokteyli, 1 μL RNaseOUT (opsiyonel), 5 ΜL RNA ve 5 μL metiltransferaz.
DIKKAT: radyoaktif tritiated malzeme tehlikeli ve sadece eldiven, bir laboratuar ceket ve diğer gerekli PPE giyirken ele alınması gerekir. Radyoaktif malzemeyle temas eden tüm pipet uçları ve tüpleri katı radyoaktif atık olarak kabul edilir. Laboratuvarın onaylı radyoaktif atık protokolüne göre tüm katı ve sıvı radyoaktif atıkların bertaraf edilmesi.
Not: metiltransferaz ve RNA olmadan kontrol örneklerini dahil edın. Reaktif konsantrasyonları, MgCl2 veya ETIKETLENMEMIŞ Sam gibi divalent Kif tuzlarının optimizasyonu ve/veya eklenmesi gerektirebilir. Son RNA konsantrasyonunun optimum aralığı 50 nM 'den 1 μM ' ye kadar, metiltransferaz konsantrasyonu 25 nM-300 nM arasındadır. - Hafifçe boru vortekslenir tarafından iyice karıştırın. Spin 5 s at 200 x g tüp altında çözüm toplamak için. 37 °C ' de Tüp (lar) ı 2 saat boyunca inkulat.
- Adım 1,32 olarak sütun arıtma kullanarak reaksiyon temizleyin.
DIKKAT: özellikle sütun yıkasları sırasında herhangi bir radyoaktif malzemeyi düzgün bir şekilde bertaraf etmek için çok dikkatli olun (toplama tüplerinden atıklar yerine pipet çıkarın). - Sıvı scintbrilasyon sayımı gerçekleştirin
- Örnek başına bir şişe, arka plan ölçümü için bir şişe ve tokatlamak testi için bir şişe ile scintilasyon sayımı raf ayarlayın. 5 mL scintilasyon sayma çözeltisi ile şişeleri doldurun.
- 1 şişeye her bir elüe radyoaktif RNA örneğinin 10 μL ekleyin ve kapağı sıkın ve hafifçe karıştırın.
- Tokatlamak test şişeleri hazırlayın. Protokol sırasında kullanılan tüm yüzeyler ve ekipmanlar üzerinde iyice pamuk bezlerden RUB. 5 ml scintilasyon çözeltisi ile dolu şişeleri için bezlerden ekleyin ve kapağı sıkın.
- Örnekleri scintilasyon sayacı aşağıdaki gibi çalıştırın. Tezgah Kaputu açın, raf makineye takın ve kaputu kapatın. Tek rafa say 'ı seçin. Kullanıcı programını Seç 'i seçin. 60 s. hit Count rafiçin trityum (3H) ölçer bir program seçin veya oluşturun. Scintilasyon sayısını üç kez tekrarlayın.
Not: ekipman her örnekteki scintbrilasyon sayısını ve çıktıyı hem ekrana hem de çıktıya ölçecektir. İstenirse burada protokol duraklatılır. 2,3 adımda kalan RNA örnekleri daha sonra kullanılmak üzere-80 °C ' de dondurulmuş olmalıdır.
- Autoradiogram ile devam edin
- 1.11-1.20 basamakları gibi üre denatüre Poliakrilamid jel hazırlayın ve önceden çalıştırın.
- 20 μl radyoaktif RNA malzemesi, 20 μL 2x jel yükleme tampon içeren yeni bir 1,5 mL tüp içine pipet. İyi karıştırın. Adım 1,21 olarak merdiven hazırlayın. Numuneleri 70 °C ' de 15 dakika süreyle inküyin.
- Örnek yüklemeden hemen önce jel kuyularını bir kez daha yıkayın. Hazır merdiven 20 μL, numune 20 μl ve kalan şeritlere 20 μL 1x jel yükleme tamponu yükleyin. Poliakrilamid yüzdesi bağlı olarak 60-180 dk için 100 V 'de jel çalıştırın.
- Jel çalıştırıldıktan sonra, jeli kasetten çıkarın ve 5 μL NEMS nüklik asit jel lekesi ile 50 ml 1x TBE tamponu içeren bir kutuya yerleştirin.
- RNA leke için rocker 5 dk için inküye.
- Dikkatlice kutunun dışında jel almak ve kuyu yukarı ve soldaki merdiven ile jel görüntüleme sisteminin UV transaydınlatıcı üzerine yerleştirin.
- Kamerayı jel üzerine odaklanın, UV ışığını açın ve ardından 50 MS 'den 1 sn 'ye kadar sinyal yoğunluğuna bağlı olarak jel görüntüsünü alın.
- UV pozlama kapatın ve tiff dosyası olarak görüntü kaydedin.
- Jeli kutuya geri yerleştirin. TBE kaldırın. Bir rocker oda sıcaklığında 30 dakika sabitleme çözeltisi (50% metanol,% 10 asetik asit,% 40 ultra-saf su) 50 mL ile jel düzeltin.
- Jel otomatik olarak 25 ml otoradyografi tekniklerinde artırma çözeltisi içeren taze bir siyah kutuya tekrar taşıyın. Siyah bir kutu yokluğunda, ışık solüsyonu korumak için alüminyum folyo ile kutuyu kapak.
- Rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dk için inkübe.
- Yavaşça jel kaldırın ve yüz-aşağı kuyular ve sağ taraftaki merdiven ile plastik wrap bir sac üzerine yerleştirin. Jelin arkasına iki yaprak Kromatografi kağıdı yerleştirin. Tüm yığını hafifçe çevirin.
- Jel kurutma makinesini 80 °C ' ye önceden ısıtın. Jel kurutucuda plastik kapağı geri taşıyın. Plastik kapağın altında sarma, jel ve Kromatografi kağıt yığını yerleştirin ve bir mühür oluşturmak için plastik kapağı geri aşağı taşıyın.
- Jel kurutucuda 80 °C ' de 1 saat kuru.
- Jel kurutucu kapatın ve yavaşça yığını çıkarın. Sarma ve ikinci Kromatografi kağıdını çıkarın. Bir autoradiogram kasetinde kurutulmuş jel ile kalan Kromatografi kağıdını bantla.
- Karanlık odaya 1 sayfa otoradyografi tekniklerinde film ekleyin.
- Kaset at-80 ° c ve film geliştirmek 1 saat-4 hafta sonra sinyal yoğunluğuna bağlı olarak, hangi daha önce ölçülen scintilasyon sayar dayalı değerlendirilebilir: 1-4 hafta için 250-1000 CPM, 24 h için 1 hafta için 1000-10000 CPM ve 1 h için 24 h > 10000 CP M.
- Film geliştirildikten sonra, filmi kasetin üstüne yerleştirin ve bir laboratuvar işaretleyicisinin 4 kenarı jel, her iyi ve XC ve BB boyalarının pozisyonu ile dikkatle işaretleyin.
- 300 veya 600 piksel çözünürlükte film tarayın ve görüntüyü tiff dosyası olarak kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro transkripsiyon reaksiyonu
Şekil 2 A , bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunun, nispeten kısa (331 NT) ve yüksek yapısal RNA olan 7Sk snRNA 'NıN T7 RNA polimeraz ile tipik bir çalışmasını temsil eder. Bu RAW görüntü üzerinde gösterildiği gibi, birden fazla istenmeyen bantları, hem kısa ve 7SK daha uzun, muhtemelen rasgele transkripsiyon başlatma veya sonlandırma olayları kaynaklanan vardır. Bu nedenle, in vitro transkripsiyon reaksiyonu sonrasında jel arıtma Şekil 2B'de gösterildiği gibi temiz RNA örneği elde etmek için önemlidir. Bu noktada ilgi RNA 'sı, merdiven ile göreli olarak konumu ile tanımlanabilir ve jel arıtma ile temizlenebilir.
Daha önce de belirtildiği gibi, jel arıtma adımına önce transkripsiyon reaksiyonu uzunluğunu optimize etmek için gerekli olabilir. Çok uzun süre çalışan transkripsiyon reaksiyonları, son derece yüksek miktarda RNA üretimine neden olabilir, doğru transkript için akış tanımlaması zor hale gelmiştir. Ayrıca, spesifik astar kullanarak Ters transkripsiyon ve niceliksel PCR (RTqPCR) tarafından arıtılmış dökümün kimliğini doğrulamak önemlidir.
In vitro RNA metiltransferaz tahlil
Şekil 3 , önerilen RNA ve protein konsantrasyonlarımızın alt sınırını kullanarak protokolde açıklanan RNA metiltransferaz testin temsili bir sonucunu gösterir. Bu tahlil scintite sayar hem nicel sonuçlar, hem de autoradiogram niteliksel sonuçlar sağlar. Burada, MePCE, metylate 7SK10Ile bilinen RNA metiltransferaz, U6 metylate de mümkün olduğu gösterilmiştir. Dahası, son olarak 7sk16için gösterildiği gibi, mepce için histon H4 bağlayıcı da U6 metilasyon inhibe. Bu protokolün sağlamlığını gösteren hem scintilasyon sayımına (Şekil 3C) hem de autoradiogram (Şekil 3B) ' de bunu gözlemlemek başardık.
Şekil 1 . Tipik RNA metiltransferaz tahlil iş akışının şematik gösterimi ve beklenen sonuçlar. Sinefungin, rekabetçi bir metiltransferaz inhibitörü. L: merdiven; WT: vahşi tip; M: katalitik mutant; CPM: dakika başına sayar. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2 . (A) ve sonra (B) bir denatüre Urea-Poliakrilamid 8% jel nüklik asit lekesi ile lekelenmiş önce in vitro Transkripsiyon ürünü gösteren temsili deney. Oklar, jel arıtma öncesi ve sonrası 7SK transkript işaret. L: merdiven. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 . In vitro RNA metil-transferaz assay U6 karşı MePCE ile yapılan. İn vitro metiltransferaz tahlil rekombinant GST-MePCE kullanarak (25 Nm), 3H-metil grup donör olarak radyoaktif Sam ve In vitro transkripsiyonu U6 RNA (50 Nm) substrat olarak. Autoradiogram, + Histone H4 örneğindeki kalıntı aktivitesini (250 CPM) algılamak için 2 hafta boyunca maruz kaldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, RNA metiltransferaz aktivitesinin spesifik transkriptlere yönelik in vitro doğrulama için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Tahlil S-adenosyl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeğinden yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin. Ancak, bu tahlil hangi kalıntı veya kimyasal grup enzim tarafından metillenmiş olduğunu göstermez dikkat etmek önemlidir. Belirli bir kalıntı metilasyonlu olduğunu belirlemek veya doğrulamak için, RNA metiltransferaz tahlil ile birlikte kullanılan mutasyonel analiz, Ters transkripsiyon bloğu veya RNA substrat kitle spektrometri analizi gibi diğer yöntemler kullanılabilir.
RNAs seçimi ve sentezleme modu RNA boyutuna bağlıdır. 18 ile 120 NT arasında belirli RNAs boyutları, birçok tanınmış nüklik asit sağlayıcıdan kolayca özel sentezlenmiş olabilir. Ancak, en sık, çeşitli boyutlarda belirli RNAs in vitro transkripsiyonu vardır. İn vitro transkripsiyon için DNA şablonları çeşitli şekillerde oluşturulabilir ve bir T7 veya SP6 promotör aşağı aşağı yer almak için ilgi dizisi gerektirir. RNAs 'ın kesin uçları önemli olduğunda, pRZ Plasmid17önerilir. Testin yüksek hassasiyeti (Şekil 3) aynı zamanda, örneğin toplam veya haberci Rnas 'ın da hücre RNA 'sı karışımı ile ARıTıLMıŞ RNA 'nın yerine geçmesi için izin verir. Gerçekten de, jel ve autoradiogram doğrudan metilasyon için hedeflenen RNA (s) boyutunu gözlemlemek için bir yöntem sağlar.
Protokol 2,1 adımda burada bildirilen koşullar insanlar, MePCE10 ve BCDIN3D9iki homolog olan METILTRANSFERASES BIN3 ailesi için idealdir. Bu tahlil koşulları belirli protein ve ilgi RNA ayarlanması gerektiğini vurgulamak önemlidir. Örneğin, MgCl2 varlığı BCDIN3D aktivite18azalır gösterildi, ancak, MgCl2 RNA yapısının önemli bir koordınatörü olabilir, ve böylece diğer RNA için tahlil önemli bir bileşeni teşkil edebilir methyltransferases.
Uzun bir süre maruz kalabilen bir autoradiogram kullanmanın avantajı, bu scintilasyon tahlil algılanmaz çok zayıf aktivite algılamak için izin verebilir olmasıdır. Genellikle bu protein bir metiltransferaz olduğunu gösterir, ancak bir veya daha fazla reaksiyon koşulları veya reaktiflerin optimize edilmesi gerekir: enzim; substrat, cofactor, tampon koşulları, vb9. Örneğin, enzim arıtma kaldırmak veya etiketin konumunu değiştirmek için geliştirilmiş olması gerekebilir. Ayrıca, bir substrat olarak kullanılan RNA 'nın düzgün bir şekilde katlanmış olması veya enzim tarafından metillenmiş başka bir protein veya RNA faktörü ile etkileşime ihtiyacı olabilir. Böylece, önceden mevcut literatür ve/veya hücrelerde kendi sonuçları dikkatle enzim ve ilgi RNA için tahlil koşulları kurmak için incelenmelidir gerekir.
Tahlil de son derece esnek. Örneğin, başka türde bir tahlil için bir öncü adım olabilir, radyoaktif metillenmiş RNA nicel ve niteliksel demethylase deneyleri olarak kullanılan11, veya RNA bağlayıcı olarak özellikle davranışını görselleştirmeye izin veren metilasyonlu RNA, değiştirilmemiş birine kıyasla. Tahlil de hafifçe RNA asetilasyonu çalışma için Asetil koenzim A gibi, radyoaktif etiketli olabilir coenzimler kullanan Rnas modifikasyonu analiz etmek için ayarlanabilir19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar ChemDraw ile onun yardımı için Dr turja Kanti Debnath teşekkür etmek istiyorum. Xhemalçe laboratuvarındaki araştırmalar, Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmektedir-Kongre yönettiği tıbbi araştırma programı-meme kanseri atılım Ödülü (W81XWH-16-1-0352), NıH Grant R01 GM127802 ve mobil Enstitüsü 'nden başlangıç fonları ve Moleküler Biyoloji ve College of Doğa Bilimleri Texas Üniversitesi 'nde Austin, ABD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
