Summary
Her beskrives et antistoffri in vitro-assay til direkte analyse af methyltransferase-aktivitet på syntetisk eller in vitro transkriberet RNA.
Abstract
Der er mere end 100 kemisk adskilte modifikationer af RNA, hvoraf to tredjedele består af methyleringer. Interessen for RNA-modifikationer, og især methyleringer, er dukket op igen på grund af de vigtige roller, som de enzymer, der skriver og sletter dem i biologiske processer, som er relevante for sygdom og kræft, har spillet. Her er der en følsom in vitro-analyse til præcise analyser af RNA-methylerings skribent aktivitet på syntetisk eller in vitro transkriberet RNAs. Denne analyse bruger en i form af S-adenosyl-methionin, hvilket resulterer i direkte mærkning af methyleret RNA med tritium. Den lave energi af tritium stråling gør metoden sikker, og præ-eksisterende metoder til tritium signal forstærkning, gør det muligt at kvantificere og visualisere det methylerede RNA uden brug af antistoffer, som er almindeligt tilbøjelige til artefakter. Mens denne metode er skrevet til RNA methylering, få tweaks gøre det gældende for studiet af andre RNA modifikationer, der kan radioaktivt mærket, såsom RNA acetylering med 14C acetyl coenzym A. samlet, denne analyse gør det muligt hurtigt at vurdere RNA methylering betingelser, hæmning med små molekyle hæmmere, eller virkningen af RNA eller enzym mutanter, og giver et kraftfuldt værktøj til at validere og udvide resultater opnået i cellerne.
Introduction
DNA, RNA og proteiner er genstand for ændringer, der stramt regulerer genekspression1. Blandt disse modifikationer forekommer methyleringer på alle tre biopolymere. DNA og protein methyleringer har været meget godt undersøgt i de sidste tre årtier. I modsætning hertil er interessen for RNA-methylering først for nylig blevet opildnet i lyset af de vigtige roller, som proteiner, der skriver, sletter eller binder RNA-methyleringer, spiller i udvikling og sygdom2. Ud over bedre kendte funktioner i rigelige ribosomale og overføre RNAs, RNA methylering veje regulerer specifikke Messenger RNA stabilitet3,4, splejsning5 og oversættelse6,7, Mirna behandler8,9 og transkriptional pauser og frigiver10,11.
Her rapporteres en enkel og robust metode til in vitro-verifikation af RNA-methyltransferase-aktiviteten ved fastsættelsen af et molekylær biologi laboratorium (opsummeret i figur 1). Mange undersøgelser vurderer aktiviteten af en RNA-methyltransferase gennem dot-blot med et antistof mod RNA-ændringen af interesse. Dot-blot verificerer dog ikke RNA-integriteten ved inkubation med RNA-methyltransferase. Dette er vigtigt, fordi selv mindre forureninger af rekombinante proteiner med nukleaser kan føre til delvis RNA nedbrydning og forstyrrende resultater. Desuden kan selv meget specifikke RNA modifikation antistoffer genkende umodificerede RNAs med specifikke sekvenser eller strukturer. Den in vitro-RNA-methyltransferase-analyse, der rapporteres her, udnytter det faktum, at S-adenosyl methionin kan tritieres på methylgruppe donor (figur 1), hvilket gør det muligt at registrere det methylerede RNA nøjagtigt uden brug af antistoffer . Instruktioner er fastsat til in vitro transskription og rensning af en udskrift af interesse og afprøvning af methylering af nævnte afskrift af enzymet af interesse. Denne metode er fleksibel og robust, og kan justeres i henhold til behovene i et givet projekt. For eksempel, in vitro transkriberet og renset RNAs, kemisk syntetiseret RNAs, men også cellulære RNAs kan anvendes. Denne analyse giver kvantitative oplysninger i form af scintillationstal, samt kvalitative oplysninger ved at vise, hvor præcis det methylerede RNA kører på en gel. Dette kan give unik indsigt i funktionen af en RNA-methyltransferase, især når du bruger cellulære RNAs som et substrat, da det giver en metode til direkte at observere størrelsen af RNA eller RNAs, der er målrettet til methylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. in vitro transkription og gel rensning af Target RNA
- Klon rækkefølgen af interesse i plasmider indeholdende T7 og/eller SP6 promotorer ved hjælp af etablerede molekylære kloningsteknikker12 eller kits.
- Linearizing DNA-skabelon til in vitro transkription
- Amplificere sekvensen af interesse ved PCR af plasmid med primere designet til at omfatte T7 Promoter region gennem indsatsen, + 20-30 BP upstream og downstream som tidligere beskrevet13.
- Alternativt fordøje 5 μg plasmid ved hjælp af et Begrænsnings enzym (RE) cut site til rådighed nedstrøms INSERT i henhold til instruktionerne fra leverandøren af RE.
Bemærk: Husk at dobbelttjekke, at skæret ikke skæres af den valgte RE. Udvælgelse af RE bruges i dette trin kan dramatisk påvirke udbyttet af udskriften. Fortrinsvis linearisér med en stump eller 5 '-overhængende end producerer re for at undgå skabelon skift af T7 RNA polymerase på den modsatte DNA-streng14. Prøv forskellige RE, hvis de oprindelige udbytter er utilstrækkelige.
- Rense den resulterende DNA ved hjælp af kit til DNA agopstået gel ekstraktion og oprydning. Elute DNA'ET med 30 μL vand.
- Bland godt ved vortexing, pipet 1,5 μL og mål DNA-koncentration med et mikrovolumen Spektrofotometer.
- Brug 250 ng af DNA til at kontrollere kvaliteten og størrelsen af det rensede DNA på en 1% agopstået gel elektroforese i 1x TBE-buffer migreret i 1 h ved 4 V/cm.
- Tø de frosne reagenser af in vitro transkriptionssæt. T7 RNA polymerase blandingen placeres på is og de øvrige reagenser på en nutator ved stuetemperatur. Umiddelbart efter komplet optøning, Quick spin rNTP rør til 5 s at indsamle opløsning i bunden af rørene og sted på is. Opbevar 10 x reaktions bufferen ved stuetemperatur for at undgå udfældning.
- Pipet i et 1,5 mL rør følgende komponenter af den 20 μL transkriptionsreaktion ved stuetemperatur i den angivne rækkefølge: 6 μL vand, 2 μL (0,1-1 μg) lineær DNA-skabelon, 2 μL 75 mM ATP-opløsning, 2 μL 75 mM GTP-opløsning , 2 μL 75 mM CTP-opløsning, 2 μL 75 mM UTP-opløsning, 2 μL 10x-reaktions buffer og 2 μL T7 RNA-polymerase-mix.
Bemærk: for DNA-skabelon genereret af PCR, brug 100-200 ng DNA; for DNA-skabelon genereret af restriktion enzym Digest af en plasmid, brug ~ 1 μg. aktiv rekombinant hans6-MÆRKEDE T7 RNA-polymerase kan renses i E. coli15. - Bland røret grundigt. Quick spin for 5 s at indsamle reaktions opløsning i bunden af røret, derefter inkubere ved 37 °C for 2-4 h.
Bemærk: alle udskrifter vil opføre sig forskelligt afhængigt af DNA-skabelonen, dens længde, dens sekvens eller struktur. Optimer in vitro transkriptionsforhold ved at afprøve forskellige inkubationstider op til 6 timer; forskellige koncentrationer af DNA-skabelon, T7 RNA-polymerase eller NTP; eller tilsætning af supplerende MgCl2 til det, der er til stede i T7 RNA-polymerase-blandingen. - Ved slutningen af inkubationstiden tilsættes 1 μL DNase I pr. 20 μL reaktion og Inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
Bemærk: transkriptionsreaktionen kan midlertidigt holdes på isen, indtil polyacrylamid-gelen er klar. - Fortsæt med rensning af polyacrylamid gel.
Bemærk: da RNA er følsom over for pH-og rnasekontaminering, skal du bruge RNA-dedikeret udstyr og RNase-frie reagenser. - Bestem procentdelen af polyacrylamid for gelen afhængigt af størrelsen af udskriften af interesse: 3,5% for 100-2000 NT (XC: 460 NT; BB: 100 NT), 5% for 80-500 NT (XC: 260 NT; BB: 65 NT), 8% for 60-400 NT (XC: 160 NT; BB: 45 NT), 12% for 40-200 NT (XC: 70 NT; BB: 20 NT), 15% for 25-150 NT (XC: 60 NT; BB: 15 NT) og 20% for 6-100 NT (XC: 45 NT; BB: 12 NT).
- Den polyacrylamidgel, der denaturerer urinstof, forberedes ved at kombinere følgende reagenser i et 50 mL konisk rør: 9,6 g urinstof af Molekylær kvalitet, 2 mL 10 x TBE, x mL 40% acrylamid: bis-acrylamid mix (29:1) og vand op til 20 mL mærket på røret , hvor x = 20 mL/(40%/gel procent%).
Forsigtig: polyacrylamid geler indeholder ofte un-polymeriseret acrylamid, som er et giftigt materiale, der kan frembringe en fare, når det introduceres til miljøet. Kassér polyacrylamid geler gennem instituttets kemikalie affalds program. - Mikroovn til 15 s ved 30% strøm. Placer på nutator i 10 minutter ved stuetemperatur, eller indtil urinstof er helt opløst.
- Mens gel blandingen roterer, hente en gel kassette (18-brønd, 1 mm tyk; 13,3 x 8,7 cm (b x L)), fjerne kam og placere kassetten til gel støbning.
- Quick spin 50 mL røret for 5 s at indsamle gel opløsning i bunden af røret. Tilsæt 125 μL 10% ammoniumpersulfat opløsning (APS). Placer på nutator for ~ 1 min. Quick spin igen for 5 s.
- Tilsæt 25 μL tetramethylethylenediamin (TEMED) og bland forsigtigt ved pipettering op og ned 5 gange med en 25 mL pipette, der undgår bobler.
- Pipetten ind i gel-støbt, og sæt forsigtigt gelkammen ud for at undgå bobler.
- Stram tætningen ved at tilføje et stort bindebånd over toppen af kassetten.
- Lad gelen polymerisere i 1 time.
- Når gelen er solidificeret, skal du fjerne binde clipsen. Sæt kassetten i elektroforese kassen. Tilsæt 1x TBE-buffer i de øverste og nederste reservoirer.
- Hent transkriptionsreaktion. Tilsæt vand op til 100 μL, og tilsæt 100 μL 2x gel-læsse buffer. Forbered stigen ved at blande den anbefalede mængde med vand til 10 μL og 10 μL 2x gel-læsse buffer til et separat 1,5 mL rør.
- Inkubere både stigen og in vitro transkriptionsreaktionen i thermomixer ved 70 °C i 15 minutter.
- Mens prøverne denatureret ved 70 °C, skal du forsigtigt fjerne kammen, rengøre brøndene ved pipettering op og ned hver brønd med en P1000 pipette, og umiddelbart pre-Run i 10 min ved 100 V.
- Når prøverne har gennemført deres 15 min denaturering ved 70 °C, skal rørene fjernes fra termo ixeren og straks placeres på isen.
- Rengør hver brønd af gelen igen med P1000-pipetten. Læg 20 μL af stigen på den første brønd til venstre, 20 μL RNA-prøven på 10 separate brønde og 20 μL 1x gel-læsse buffer på de uudnyttede brønde.
- Kør gelen ved 100 V for 60-240 min, afhængigt af gelen% polyacrylamid.
Bemærk: farvestofferne i gel-læsse bufferen vil adskille sig i to bånd, når de krydser gelen, et langsomt migrerende Bromophenol blåt (BB) blåt bånd og et hurtigt migrerende xylen Cyanol (XC) cyan bånd. Den omtrentlige migration af disse bands i forskellige% polyacrylamid geler er velkendt (Se trin 1,11) og kan bruges til at estimere migrationen af RNA i gelen. - Når gelen er stoppet, skal du forsigtigt fjerne gelen fra kassetten.
- Gelen placeres i en ren æske, der indeholder en opløsning på 50 mL 1x TBE-buffer med 50 μL nukleinsyre gel bejdsning og Inkuber i 5 minutter på en rocker for at plette RNA.
- Tag en før og efter band excision billede af gelen på gel Imaging system, helst ved hjælp af blåt lys i stedet for UV transillumination.
- Punktafgiftspligtige hvert bånd af interesse ved hjælp af en nuklease-fri engangs gel skæring spids. Efter hver brønd, overføre spidsen indeholdende gel skive til en 1,5 mL rør og kort spin for at indsamle gel skive. Gentag, indtil alle båndene er blevet samlet i det samme 1,5 mL rør.
- Når alle gel skiver er blevet indsamlet, tilsættes 100 μL nuklease frit vand eller TE buffer til 1,5 mL røret. Opbevares ved 4 °C i ~ 48 h. Dette gør det muligt for RNA at forlade gel skiver i opløsningen.
- Efter 48 h, pipet vand eller TE buffer til en frisk 1,5 mL rør. Kassér de resterende gel skiver. Du renser RNA via Clean-up Kit på følgende måde.
- Drej kolonnen ved stuetemperatur i mindst 30 minutter.
- Til 100 μL RNA-opløsning i det nye 1,5 mL rør fra trin 1,32 tilsættes 350 μL RLT-buffer og blandes godt i 2 minutter på en nutator. Spin for 1 s ved 200 x g for at samle opløsningen i bunden af røret.
- Tilsæt 675 μL 100% EtOH og bland godt i 2 minutter på nutator. Spin for 1 s ved 200 x g og Fortsæt straks til næste trin.
- Overfør 565 μL af blandingen til spin søjlen og drej i 1 min ved 15.000 x g. Tøm opsamlingsrøret ved aspiration.
- Gentag forrige trin med den anden halvdel af prøven.
- Tilsæt 500 μL RPE-buffer til kolonnen, og drej den i 1 min. ved 15.000 x g. Tøm opsamlingsrøret ved aspiration.
- Tilsæt 750 μL 80% ethanol til søjlen og spin i 1 min ved 15.000 x g. Tøm opsamlingsrøret ved aspiration.
- Placer søjlen i et nyt 2 mL opsamlings glas med låget åbent og drej ved 15.000 x g i 5 min.
- Kolonnen overføres til et nyt 1,5 mL rør.
- Tilsæt 17 μL vand i midten af søjlen og drej på 15.000 x g i 1 min for at eluere. Elute igen med yderligere 17 μL vand. Den samlede genvundne volumen skal være 32 μL.
- Bland godt ved vortexing, pipet 1,5 μL og mål koncentrationen af RNA ved hjælp af et mikrovolumen Spektrofotometer.
- Kontrollér kvaliteten af RNA-oprensningen med urea-denaturering af polyacrylamid-gel som i trin 1.11-1.29.
2. in vitro-RNA-methyltransferase-analyse
- Der opsættes 100 μL RNA-methyltransferase-assay i et 1,5 mL rør på is som følger: 23 μL vand, 10 μL 10x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL 0,05 M EDTA, 5 μL 100 mM DTT , 40 μL 50% glycerol, 4 μL 58 μM 3H-Sam, 5 μl 20X proteasehæmmer cocktail, 1 μl RNaseOUT (valgfri), 5 μl RNA og 5 μl methyltransferase.
Forsigtig: radioaktivt i materiale er farligt og bør kun håndteres, mens iført handsker, en lab coat og alle andre nødvendige PV. Alle pipettespidser og rør, der er i kontakt med radioaktivt materiale, betragtes som fast radioaktivt affald. Bortskaf alt fast og flydende radioaktivt affald i henhold til laboratoriets godkendte protokol for radioaktivt affald.
Bemærk: Medtag kontrolprøver uden methyltransferase og uden RNA. Reagens koncentrationerne kan kræve optimering og/eller inklusion af Divalente kation salte, såsom MgCl2, eller ikke mærket Sam. Den optimale række af den endelige RNA-koncentration er fra 50 nM til 1 μM, mens methyltransferase koncentrationen er fra 25 nM til 300 nM. - Bland grundigt ved forsigtigt at vortexning røret. Spin 5 s ved 200 x g for at samle opløsningen i bunden af røret. Slangen (-erne) inkubates ved 37 °C i 2 timer.
- Rengør reaktionen ved hjælp af kolonne rensning som i trin 1,32.
Forsigtig: Vær meget omhyggelig med at bortskaffe radioaktive materialer korrekt, især under vask af søjlen (pipette ud i stedet for at udsugning affald fra opsamlings rørene). - Udfør flydende scintillationstal
- Konfigurer scintillationsgreolen med et hætteglas pr. prøve, et hætteglas til baggrunds måling og et hætteglas til Swipe-testen. Fyld hætteglassene med 5 mL scintillationstællings opløsning.
- Tilsæt 10 μL af hver elueret radioaktivt RNA-prøve i 1 hætteglas, og stram låget og bland forsigtigt.
- Forbered Swipe test hætteglassene. Omhyggeligt gnide vatpinde på alle overflader og udstyr, der anvendes i løbet af protokollen. Tilsæt vatpinde til hætteglassene fyldt med 5 mL scintillationsopløsning, og stram låget.
- Kør prøverne på scintillationstælleren som følger. Åbn Counter Hood, sæt stativet i maskinen og luk hætten. Vælg Tæl enkelt rack. Vælg Vælg bruger program. Vælg eller Opret et program, der måler tritium (3timer) for 60 s. hit Count rack. Gentag scintillationsoptællingen tre gange.
Bemærk: udstyret måler scintillationsoptællingen af hver prøve og udgang til både skærmen og en udskrift. Protokol kan sættes på pause her, hvis det ønskes. Resterende RNA-prøver fra trin 2,3 skal fryses ved-80 °C til senere brug.
- Fortsæt med autoradiogram
- Forbered og pre-Run urea denaturering polyacrylamid gel som i trin 1.11-1.20.
- 20 μL radioaktivt RNA-materiale afpipetteres i et nyt 1,5 mL-rør, der indeholder 20 μL 2x gel-stødpude. Bland godt. Forbered stigen som i trin 1,21. Prøverne inkubates ved 70 °C i 15 minutter.
- Vask brøndene af gelen igen umiddelbart før prøve indlæsning. 20 μl af den forberedte stige, 20 μL af prøverne og 20 μL 1x gel-læsse buffer på de resterende baner. Kør gelen ved 100 V i 60-180 min, afhængigt af polyacrylamid procent.
- Når gelen er færdig, skal du fjerne gelen fra kassetten og anbringe den i en æske, der indeholder 50 mL 1x TBE-buffer med 5 μL ultrasensitiv nukleinsyre gel-bejdsmel.
- Inkuber i 5 minutter på Vippeknappen for at plette RNA.
- Tag forsigtigt gelen ud af æsken og Placer den på UV-transilluminatoren i gel-billed systemet med brøndene opad og stigen til venstre.
- Fokuser kameraet på gelen, Tænd for UV-lyset, og tag derefter et billede af gelen ved at udsætte fra 50 MS til 1 s afhængigt af signal intensiteten.
- Deaktiver UV-eksponering, og Gem billede som TIFF-fil.
- Læg gelen tilbage i æsken. Fjern TBE. Fastgør gelen med 50 mL fikserings opløsning (50% methanol, 10% eddikesyre, 40% ultra-rent vand) i 30 minutter ved stuetemperatur på en rocker.
- Bevæg forsigtigt gelen igen til en frisk sort æske, der indeholder 25 mL af den autoradiografiske forstærkende opløsning. I mangel af en sort boks, dække kassen med aluminiumsfolie for at beskytte opløsningen mod lys.
- Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur på Vippeknappen.
- Løft forsigtigt gelen og Placer den med forsiden nedad på et ark plastfolie med brøndene opad og stigen på højre side. Anbring to ark kromatografi papir på bagsiden af gelen. Vend forsigtigt hele stakken.
- Forvarm gelen tørretumbler til 80 °C. Flyt plastikdækslet tilbage på geltørreren. Indsæt wrap-, gel-og kromatografi papirstakken under plastikdækslet, og Flyt plastikdækslet ned igen for at oprette en forsegling.
- Tør i 1 time ved 80 °C i geltørre Tumbler.
- Sluk for geltørrer, og fjern forsigtigt stakken. Fjern wrap og anden kromatografi papir. Tape resterende kromatografi papir med den tørrede gel i en auto-adiogram kassette.
- Tilføj 1 ark autoradiography film i det mørke rum.
- Placer kassetten ved-80 °C, og udvikl filmen efter 1 time til 4 uger afhængigt af signal intensiteten, som kan bedømmes ud fra de tidligere målte scintillationstal: 1-4 uger for 250-1000 CPM, 24 timer til 1 uge for 1000-10000 CPM og 1 h til 24 timer for > 10000 CP M.
- Når filmen er udviklet, placere filmen på toppen af kassetten og forsigtigt markere med en lab markør de 4 kanter af gelen, hver brønd, og placeringen af XC og BB farvestoffer.
- Scan filmen ved 300 eller 600 pixels per inch opløsning og gemme billedet som TIFF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro transkriptionsreaktion
Figur 2 A repræsenterer et typisk løb fra en in vitro transkriptionsreaktion med T7 RNA-polymerase af 7Sk snRNA, som er en relativ kort (331 NT) og højt struktureret RNA. Som vist på det rå billede, der er flere uønskede bands, både kortere og længere end 7SK, formentlig som følge af tilfældige transkriptional indledning eller opsigelse begivenheder. På grund af dette er gel rensning efter in vitro transkriptionsreaktionen vigtig for at opnå et rent RNA-prøveeksemplar som vist i figur 2B. På dette tidspunkt, RNA af interesse kan identificeres ved sin placering i forhold til stigen og renset ved gel rensning.
Som tidligere nævnt kan det være nødvendigt at optimere længden af transkriptionsreaktionen før gel rensnings trinnet. Transkriptionsreaktioner, der løber for længe, kan resultere i ekstremt store mængder RNA-produktion, hvilket gør downstream-identifikationen af den korrekte udskrift vanskelig. Det er også vigtigt at verificere identiteten af den rensede udskrift ved revers transskription og kvantitativ PCR (RTqPCR) ved hjælp af specifikke primere.
In vitro-RNA-methyltransferase-analyse
Figur 3 viser et repræsentativt resultat af en RNA-methyltransferase-analyse, der er beskrevet i protokollen, ved hjælp af den nedre grænse for vores anbefalede RNA-og proteinkoncentrationer. Denne analyse giver mulighed for både kvantitative resultater fra de scintillationstal, samt kvalitative resultater fra autoradiogram. Her viste MePCE, en RNA-methyltransferase kendt for methylat 7SK10, at være i stand til også at Methylat U6. Desuden, som for nylig vist for 7sk16, binding af Histon H4 til mepce hæmmer også U6 methylering. Vi var i stand til at observere dette i både scintillationstal (figur 3C) og autoradiogram (figur 3B), der viser robustheden af denne protokol.
Figur 1 . Skematisk gengivelse af et typisk RNA-methyltransferase-analyse workflow og forventede resultater. Sinefungin er en konkurrencedygtig methyltransferase-hæmmer. L: stige; WT: vildtype; M: katalytisk mutant; CPM: tæller pr. min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Repræsentativt eksperiment, der viser produktet af in vitro transkription før (A) og efter (B) rensning på en denaturering urea-polyacrylamid 8% gel farvet med nukleinsyre bejdset. Pilene peger på 7SK transskriptionen før og efter gel rensning. L: stigen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . In vitro-RNA-metyl-transferase-analyse udført med MePCE mod U6. In vitro methyltransferase assay ved hjælp af rekombinant GST-MePCE (25 nm), 3H-radioaktivt Sam som methyl-gruppe donor og in vitro transkriberet U6 RNA (50 nm) som substrat. Autoradiogram blev eksponeret i 2 uger for at detektere restaktiviteten (250 CPM) i + Histone H4-prøven. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporteres en enkel og robust metode til in vitro-verifikation af RNA-methyltransferase-aktiviteten i retning af specifikke transskriptioner. Analysen udnytter det faktum, at S-adenosyl methionin kan tritieres på methylgruppe donor (figur 1), hvilket gør det muligt at detekteres det METHYLEREDE RNA nøjagtigt uden brug af antistoffer. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne analyse ikke kan indikere, hvilken restkoncentration eller kemisk gruppe der er methyleret af enzymet. For at identificere eller verificere, at et bestemt restprodukt er methyleret, kan der anvendes andre metoder såsom mutationanalyse, reverse transkriptionsblok eller massespektrometri-analyse af RNA-substratet sammen med RNA-methyltransferase-analysen.
Valget af RNAs og deres form for syntese afhænger af størrelsen af RNA. Specifikke RNAs af størrelser mellem 18 og 120 NT kan bekvemt Custom-syntetiseres fra mange ansedede nukleinsyre udbydere. Men, mest almindeligt, specifikke RNAs af forskellige størrelser er in vitro transkriberet. DNA-skabelonerne til in vitro-transskription kan genereres på forskellige måder og kræver en sekvens af interesse, der skal placeres nedstrøms for en T7-eller SP6-promotor. Når præcise ender af RNAs er vigtige, anbefales pRZ plasmid17. Den høje følsomhed af analysen (figur 3) giver også mulighed for at erstatte en renset RNA med en blanding af cellulære RNA, enten total eller Messenger RNAs for eksempel. Faktisk, gel og autoradiogram giver en metode til direkte at observere størrelsen af RNA (s) målrettet for methylering.
De betingelser, der rapporteres her i trin 2,1 i protokollen, er optimale for BIN3-familien af methyltransferaser, som har to homologer hos mennesker, MePCE10 og BCDIN3D9. Det er vigtigt at understrege, at Analysebetingelserne skal justeres til det specifikke protein og RNA af interesse. For eksempel, det blev påvist, at tilstedeværelsen af MgCl2 falder BCDIN3D aktivitet18, men, mgcl2 kan være en vigtig koordinator af RNA struktur, og kan således udgøre en vigtig bestanddel af analysen for andre RNA hæmmer methyltransferaser.
Fordelen ved at bruge en autoradiogram, som kan blive udsat for en længere periode, er, at det kan gøre det muligt at detektere meget svag aktivitet, der ikke påvises i scintillationsassay. Normalt indikerer dette, at proteinet er en methyltransferase, men at en eller flere af reaktionsbetingelserne eller reagenserne skal optimeres: enzym; substrat, cofactor, buffer betingelser, etc9. For eksempel kan det være nødvendigt at forbedre enzym rensningen for at fjerne eller ændre tagets position. Det kan også være, at RNA, der anvendes som substrat, skal foldes korrekt eller interagere med et andet protein eller RNA-faktor, der skal methyleres af enzymet. Således, præ-eksisterende litteratur og/eller egne resultater i celler skal nøje gennemgået for at etablere de analysebetingelser for enzymet og RNA af interesse.
Analysen er også yderst fleksibel. For eksempel kan det være et forløber trin til en anden type analyse, således at radioaktivt methyleret RNA anvendes i kvantitative og kvalitative demethylase assays11, eller i RNA bindende assays gør det muligt specifikt at visualisere opførsel af methyleret RNA sammenlignet med den uændrede. Analysen kan også let justeres til at analysere modifikation af RNAs, der bruger coenzymer, der kan radioaktivt mærket, såsom acetyl coenzym A for studiet af RNA acetylering19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Turja Kanti Debnath for hans hjælp med ChemDraw. Forskning i Xhemalçe Lab understøttes af Department of Defense-Congressionally instrueret Medical Research program-brystkræft gennembrud Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 og start-up midler fra Institute of Cellular og Molekylær biologi og College of Natural Sciences ved University of Texas i Austin, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
