Summary
生物信息学管道，即miRDeep-P2（简称miRDP2），具有更新的植物miRNA标准和经过全面检查的算法，可以准确有效地分析植物中的微RNA转录，特别是对于具有复杂和大型基因组的物种。
Abstract
微RNA （miRNA） 是 20- 24 核苷酸 （nt） 内源性小RNA （sRNA）， 广泛存在于植物和动物中，在转录后水平上调节基因表达起着有效作用。过去十年中，用新一代测序 （NGS） 方法测序 sRNA 库被广泛用于识别和分析 miRNA 转录体，从而迅速增加了 miRNA 发现。然而，由于测序sRNA库的深度增加以及植物基因组的大小和复杂性，植物miRNA注释中出现了两个主要挑战。首先，许多其他类型的sRNA，特别是来自sRNA库的短干扰RNA（siRNA），被许多计算工具错误地批号为miRNA。其次，在具有庞大和复杂基因组的植物物种中分析miRNA转录体，这成为一个极其耗时的过程。为了克服这些挑战，我们最近通过采用新的过滤策略、彻底检查评分算法和合并新更新的植物 miRNA，将 miRDeep-P（miRNA 转录组分析的常用工具）升级到 miRDeep-P2（简称 miRDP2）注释条件。我们在基因组复杂性增加的五种代表性植物（包括阿拉伯拟南芥、水稻、番茄、玉米和小麦）中针对测序sRNA种群测试了miRDP2。结果表明，miRDP2处理这些任务的效率非常高。此外，miRDP2 在灵敏度和准确性方面优于其他预测工具。综合起来，我们的研究结果证明miRDP2是分析植物miRNA转录酶的快速和准确的工具，因此是帮助社区更好地在植物中对miRNA进行分文的有用工具。
Introduction
过去二十年来生物学中最令人兴奋的发现之一是sRNA物种在调节基因组1的不同功能中的增殖作用。特别是，miRNA在真核生物中构成20-24ntsRNA的重要类别，主要在转录后水平上作为重要的基因调控器，在整个生命周期发育阶段以及刺激和应激反应2、3中发挥作用。在植物中，miRNA产生于称为pri-miRNA的主要转录本，通常由RNA聚合酶II转录为单个转录单元4、5。由进化保存的细胞机械（动物中的Drosha RNase III，植物中的DICER样）处理，pri-miRNA被切除到直接的miRNA前体，前miRNA，其中包含形成分子内茎环结构的序列6，7。然后，将预miRNA加工成双链中间体，即miRNA双工，由功能链、成熟miRNA和功能性较低的伙伴miRNA®2、8组成。在加载到RNA诱导沉默复合物（RISC）后，成熟的miRNA可以基于序列互补性识别其mRNA靶点，导致负调节功能2，8。miRNA要么破坏目标成绩单，要么阻止目标翻译，但前者在植物8，9中占主导地位。
自从偶然发现线虫10、11号线虫中第一个miRNA以来，许多研究都致力于miRNA鉴定及其功能分析，特别是在NGS方法的提供之后。NGS方法的广泛应用极大地促进了计算工具的利用，这些工具旨在捕捉miRNA的独特特性，如前体的干环结构及其在成熟miRNA和miRNA®上序列读取的优先积累。因此，研究人员在识别不同物种的miRNA方面取得了显著成功。基于先前描述的概率模型12，我们开发了miRDeep-P13，这是从NGS数据中发现植物miRNA的第一个计算工具。miRDeep-P是专门旨在征服解码植物miRNA的挑战，具有更多的可变前体长度和大型的副体家族13，14，15。发布后，这个程序已被下载数千次，并用于在40多个植物物种16中对miRNA转录子进行批过。在基于NGS的工具（如miRDeep-P）的推动下，公共miRNA存储库miRBase17中注册的miRNA数量急剧增加，目前托管的miRNA项目超过38，000个（版本22.1），而2008年仅为500个miRNA项目（版本2.0）。
然而，植物miRNA注释带来了两个新的挑战。首先，高误报率严重影响了植物miRNA注释16、19的质量，原因如下：1）由于缺乏严格的miRNA注释标准，NGS sRNA库中的内源性短干扰RNA（siRNA）被错误地注释为miRNA;2） 对于没有先验miRNA信息的物种，根据NGS数据预测的假阳性很难消除。以miRBase为例，Taylor等人20号在公共存储库21（第21版）中发现了三分之一的植物miRNA条目，缺乏令人信服的支持证据，甚至四分之三的植物miRNA家族也值得怀疑。其次，它成为一个极其耗时的过程，预测植物miRNA与大和复杂的基因组16。为了克服这些挑战，我们更新了 miRDeep-P，增加了新的过滤策略，彻底修改了评分算法，集成了植物 miRNA 注释的新标准，并发布了新版本 miRDP2。此外，我们使用 NGS sRNA 数据集测试了 miRDP2，其基因组大小逐渐增大：阿拉伯拉多普西、大米、番茄、玉米和小麦。与其他五种广泛使用的工具及其旧版本相比，miRDP2 分析了这些 sRNA 数据，并更快地分析 miRNA 转录，提高了准确性和灵敏度。
miRDP2 封装的内容
miRDP2 包由六个文档化的 Perl 脚本组成，这些脚本应由准备好的 bash 脚本按顺序运行。在六个脚本中，三个（convert_bowtie_to_blastpl、filter_alignments.pl和excise_candidate.pl）是从miRDeep-P继承的。 其他脚本是从原始版本修改的。六个脚本的函数如下所述：
preprocess_reads.pl筛选输入读取，包括太长或太短的读取（<19 nt 或 >25 nt），读取与 Rfam ncRNA 序列相关，以及读取的 RPM（读取百万）小于 5。然后，该脚本检索与已知 miRNA 成熟序列相关的读取。输入文件是 FASTA/FASTQ 格式的原始读取和 bowtie2 输出的读取映射到 miRNA 和 ncRNA 序列。
计算 RPM 的公式如下：
convert_bowtie_to_blast.pl将蝴蝶结格式更改为 BLAST 解析格式。BLAST 解析格式是从标准 NCBI BLAST 输出格式派生的自定义表格分隔格式。
filter_alignments.pl过滤深度测序读取到基因组的对齐方式。它过滤部分对齐以及多对线读取（用户指定的频率截止）。基本输入是 BLAST 解析格式的文件。
excise_candidate.pl使用对齐的读取作为指南，从参考序列中剪切出潜在的前体序列。基本输入是 BLAST 解析格式的文件和 FASTA 文件。输出是 FASTA 格式的所有潜在前体序列。
mod-miRDP.pl需要两个输入文件，签名文件和结构文件，通过改变评分系统与植物特定参数从核心miRDeep-P算法修改。输入文件是点括号前体结构文件和读取分发签名文件。
mod-rm_redundant_meet_plant.pl需要三个输入文件：mod-miRDP.pl生成的chromosome_length、前体和original_prediction。它生成两个输出文件，非冗余预测文件和预测文件筛选新更新的工厂 miRNA 标准。有关输出文件格式的详细信息，请见第 1.4 节。
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Protocol
1. 安装和测试
- 下载所需的依赖项：鲍蒂222和RNAfold23。建议使用已编译的包。
- 下载Bowtie2，一个读取映射工具，从它的家庭网站（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）。
- 下载RNAfold，维也纳包的工具，用于预测RNA二次结构，从http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/。
- 在安装 miRDP2 之前，请确保正确安装这两个依赖项，并自定义 bash 环境文件（例如 .bashrc）以为这两个依赖项设置正确的 PATH。
注：其他映射工具，如鲍蒂24也适合miRDP2;鲍蒂或鲍蒂2可在1.1.3版后使用。
- 要下载 miRDP2 包，请转到https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/latest_version/并获取 tarball 文件。
- 在安装 miRDP2 之前，请确保 Perl 位于 PATH 中。要安装 miRDP2，请将下载的 tarball 文件的所有内容提取到一个文件夹中（命令行，如 1.4.2 中），然后将文件夹路径设置为 PATH。
注： 建议使用至少 8 GB RAM 和 100 GB 存储的计算机或计算节点运行 miRDP2。 - 测试 MiRDP2 管道。
- 要测试 miRDP2 是否已正确安装，请使用测试数据和https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/中找到的预期输出。测试数据包含一个格式化的GSM测序文件和一个阿拉伯拉多普西斯塔利亚纳基因组文件。
- 将所有下载的文件移动到当前工作目录：
mv miRDP2-v_.tar.gz TestData.tar.gz ncRNA_rfam.tar.gz
cd - 提取压缩的焦油球文件：
tar _xvzf miRDP2-v_.tar.gz
tar @xvzf 测试数据.tar.gz
塔尔·xvzf ncRNA_rfam.tar.gz - 建立阿拉伯基因组参考索引：
bowtie2-build -f ./测试数据/TAIR10_genome.fa ./测试数据/TAIR10_genome - 构建 ncRNA 参考索引：
bowtie2-build -f ./ncRNA_rfam.fa ./1.1.3/脚本/索引/rfam_index - 运行 miRDP2 管道：
bash ./1.1.3/miRDP2-v1.1.3_pipeline.bash @g /testData/TAIR10_genome.fa -i ./ 测试数据/TAIR 10_genome +f /测试数据/GSM2094927.fa _o .
注： 使用的 Linux 命令采用粗体和斜体字体，命令行选项以斜体显示。*指示 miRDP2 的版本（当前版本为 1.1.3）。bowtie2-build 命令大约需要 10 分钟，miRDP2 管道应在几分钟内完成
- 检查测试输出。
- 请注意，名为"GSM2094927-15-0-10"的文件夹在
中自动生成，其中包含所有中间文件和结果。 - 检查标签分隔输出文件 GSM2094927-15-0-10_filter_P_prediction，预测 miRNA 的最终输出，包含指示染色体 ID、链方向、代表性读取 ID、前体 ID、成熟 miRNA 位置、前体）的列位置、成熟序列和前体序列。请注意从此文件派生的附加床文件，以便进一步分析。
- 检查文件"progress_log"，其中提供有关已完成的步骤的信息，以及包含程序输出和警告的文件"script_log"和"script_err"。
注意：目前，我们已经在两个Linux平台上测试了miRDP2，包括集群服务器上的CentOS版本6.5和PC Windows系统上的Cygwin 2.6.0，miRDP2应该在支持Perl的类似系统上工作。
- 请注意，名为"GSM2094927-15-0-10"的文件夹在
2. 识别新颖的 miRNA
- 在运行管道之前，请确保将输入读取预处理为正确的格式。
注： miRDP2 的新版本 1.1.3 可以接受原始 FASTQ 格式文件作为输入，尽管格式化读取的过程与以前的版本一样执行。- 首先，从深度排序读取的 5' 和 3' 端卸下适配器（如果存在）。
- 其次，将深度排序读取解析为 FASTA 格式。
- 第三，删除冗余，以便使用单个且唯一的 FASTA 条目表示具有相同序列的读取。
- 最后，确保所有 FASTA 标识符都是唯一的。每个序列标识符必须以"_x"和整数结尾，指示在深度排序数据集中检索到的精确序列的副本数。确保唯一 FASTA 标识符的一种方法是在 ID 中包含一个正在运行的数字。有关参考，请参阅测试数据（https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/） 中的文件 GSM2094927.fa。
- 有关正确格式化的读取示例，请参阅以下内容：
>read0_x29909
TTGGGAAGGGGCTCTA
>read1_x36974
TTCCACCTCTCTTTG
>read2_x32635
TTCCACCTCTCTTTTT
- 生成参考索引。
- 对于基因组参考，为了节省时间，从iGenomes网站（https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html）下载Bowtie2索引文件，如果感兴趣的物种的基因组序列已经编制索引。否则，用户索引引用序列并保留索引文件一段时间，直到项目完成，因为基因组序列可能需要重新编制索引。有关如何索引基因组参考的详细信息包含在 bowtie2 手册 （http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml） 中。
- 还需要另一个非miRNA ncRNA索引来过滤其他非编码RNA片段中的噪声序列。该文件是来自Rfam的主要ncRNA序列的集合，包括rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA。要构建此索引，请参阅第 1.4 部分，因为索引应正确放置和命名，即
/脚本/索引/rfam_index。
- 运行 miRDP2。
- 要使用 miRDP2 从深度测序数据中检测新的 miRNA，请使用包中的 bash 脚本启动分析管道（可以在步骤 1.4 中找到示例）：
//////////_pipeline-o > -f
其中 * 指示管道 bash 脚本的版本。有三个参数可以修改：1） 读取可以映射到的不同位置的数量，2） 运行 bowtie2 的不匹配数，3） RPM 阈值（每百万读取）。分别使用 +L、-M 和 +R 选项修改这些选项。第 3.1 节对此作了详细说明。
- 要使用 miRDP2 从深度测序数据中检测新的 miRNA，请使用包中的 bash 脚本启动分析管道（可以在步骤 1.4 中找到示例）：
- 检查 miRDP2 输出。
- 请注意，输出文件夹将在
下自动生成，并命名为" -15-0-10";最后 3 个数字分别指示参数 1、2 和 3 的值（本例中为默认值）。文件 _filter_P_prediction包含满足新更新的植物 miRNA 注释标准的最终预测 miRNA 的信息。有关输出文件格式的详细信息，请放在第 1.4 部分中。
- 请注意，输出文件夹将在
3. 使用 miRDP2 进行修改和警告
- 可修改的参数
- 使用"-L"选项设置读取可映射到多少位置的限制（参数 1）。读取映射到太多站点可能与重复序列相关联，并且不太可能与 miRNA 相关联。默认设置为 15。对于特定物种，如果有具有许多成员的miRNA家族，第一个参数可以手动增加以适应基因组景观。
- 使用"-M"选项设置弓形（参数 2）允许的不匹配。默认设置为 0。
- 使用"-R"选项设置可能与成熟 miRNA 相对应的读取阈值（参数 3）。为了减少时间消耗和误报，请按 RPM 筛选读取。只有超过一定 RPM 阈值的读取才能表示 miRNA 的成熟序列，而不是背景噪声，并将保留以进行进一步分析。默认设置为 10 RPM。
- 请注意，更改这些参数可能会影响性能和时间消耗。通常，增加参数 1 和参数 2 以及减少参数 3 将生成不太严格的结果和更长的运行时间，反之亦然。
- 冗余和 miRNA*
- 请注意，miRDP2 的输出 miRNA 可能与已知的 miRNA 不同。我们发现，这主要是由于两个原因之一：成熟miRNA的异质性或miRNA和miRNA®的相对丰度。我们发现，这不会影响前体的最佳长度选择和已知miRNA基因的轮廓。
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Representative Results
本文描述的miRNA注释管道miRDP2适用于5个基因组长度逐渐增加的植物物种的10个公共sRNA-seq库，包括阿拉伯拟南芥、Oryza sativa（大米）、索兰姆碱化（番茄）、Zea Mays（玉米）和三联体（小麦）（图1A）。总体而言，对于每个物种，来自不同组织的2个代表性sRNA库（折叠成唯一的读取，协议部分的细节）及其索引基因组序列作为两个输入处理（表1）。五个miRNA计算预测工具（miRDeep-P 13、miRPlant25、miR-PREFeR26、miRA27、miReNA28）被选中进行比较。
运行时间测试
为了比较 miRDP2 和其他五种工具的运行时和性能，我们在具有 Cent OS 版本 6.5 系统的群集服务器中安装了五个工具（miRDP2、miRDeep-P、miR-PREFeR、miRA 和 miReNA）。这些程序使用相同的输入文件、硬件和资源运行（补充文件 1中的详细信息）。特别是，miRPlant 由使用 Java 编写的 GUI 控制，无法在服务器上运行。相反，我们在使用 Windows 10 的 PC 上测试了 miRPlant，同时我们还在此 PC 上测试了 miRDP2 和 miRDeep-P（补充文件 1中的详细信息）。
对于小基因组物种，如阿拉伯大分体、奥里萨萨和索兰姆，所有程序运行正常。然而，对于大型基因组物种，如Zea Mays和Triticumaestivum（包括用于miRA的索兰氏碱化铀），一些程序耗尽了所有计算资源，中途崩溃。例如，miReNA、miRA 和 miR-PREFeR 未能生成结果，可能是由于在处理大型 sam 文件或中间文件时内存不足。特别是，miRPlant临时文件消耗了太多的空间，结果在处理大型基因组物种时无法在 PC 上运行。miRDP2 在很短的时间内完成了这些预测过程，从分钟到小时（图1B）。因此，与旧版本和其他工具相比，miRDP2的运行时间明显缩短。
灵敏度和精度测试
由于对阿拉伯经中的miRNA进行了深入的研究，我们利用在拉米波迪斯21（第22.1版）中已知的miRNA来评估miRDP2，并与其他工具进行了比较。如先前报告19、26，采用以下公式计算灵敏度和准确性：
已知的miRNA是在miRBase中带分的那些。如果成熟序列的转速超过 5 RPM，则指定 miRNA 表示，并且对映射到成熟和星 miRNA 序列的前体读取 ±75%。使用来自阿拉伯的两个序列sRNA库（表1）进行测试。miRDP2 （图 1C，D） 比其他工具在灵敏度和准确性上表现更好.
综合起来，这些结果表明miRDP2是分析植物miRNA转录组的快速和准确的工具。
图 1：miRDP2 的性能。（A） 基因组大小 （以 Gb）的阿拉伯拉多普西斯塔利亚纳（Ath），奥里萨萨蒂瓦（奥萨），索兰努姆莱科普西库姆（斯利）， Zea Mays （兹马），特里蒂库姆 aestivum （泰）。（B-D）miRDP2等五种工具的运行时、灵敏度和精度的比较。与每个工具对应的两个点表示每个工具进行了两个测试。这个数字是从Kuang等人16号改编的。请点击此处查看此图的较大版本。
| 物种（缩写） | 基因组版本 | sRNA 库 | ||||
| 库 ID | 文件大小 | 读取总数 | 唯一读取 | 组织 | ||
| 阿比多普斯·塔利亚纳（阿泰） | 版本 10 | GSM2094927 | 24.9 Mb | 40.5中号 | 9.7中号 | 成人叶 |
| GSM2412287 | 29.5 Mb | 45.1中号 | 11.1中号 | 叶 | ||
| 奥里萨·萨蒂瓦（奥萨） | 版本 7 | GSM2883136 | 44.2 Mb | 54.9中号 | 16.3中号 | 幼苗 |
| GSM3030848 | 34.7 Mb | 49.1中号 | 13.0中号 | 弗拉格利夫 | ||
| 索兰姆·莱科普斯库姆（斯莱） | 版本 3 | GSM1213985 | 205.4 Mb | 161.5中号 | 58.0中号 | 叶 |
| GSM1976413 | 118.5 Mb | 139.3中号 | 46.2中号 | 根 | ||
| 泽·梅斯（兹马） | 版本 4 | GSM1277437 | 158.4 Mb | 266.1中号 | 60.5中号 | 幼苗 |
| GSM1428531 | 144.1 Mb | 172.5中号 | 56.3中号 | 种子 | ||
| 特里图姆·阿斯蒂夫姆（泰） | iwgsc 1 | GSM1294660 | 76.1 Mb | 59.2中号 | 29.6中号 | 开枪 |
| GSM1294661 | 113.6 Mb | 84.0中号 | 44.0中号 | 叶 | ||
表1：用于测试miRDP2和其他工具的基因组和sRNA库。这张表是改编自Kuang等人16。
补充文件1：miRDP2和其他五种工具的运行时、灵敏度和精度的比较。请点击此处下载此文件。
补充文件2：在循环中具有分叉结构的真实miRNA的示例。请点击此处下载此文件。
补充文件3：植物miRNA注释的更新标准和23nt和24ntmiRNA的标准。请点击此处下载此文件。
补充文件4：miRDP2工作流程图。请点击此处下载此文件。
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Discussion
随着NGS的出现，从越来越多的sRNA测序数据中发现了大量的miRNA位点，这些物种的数量不断增加，不同的物种29，30。在集中式社区数据库miRBase21中，沉积的miRNA项目在过去十年中增加了近100倍。然而，与动物中的miRNA相比，植物miRNA具有许多独特的特征，使得识别/注释更加复杂13，14。
首先，植物miRNA的前体在长度和结构上更具可变性（补充文件2）16。不像动物miRNA前体相对均匀的长度在70-90nt左右，植物前体的长度变化几倍，可以达到几百nts 13，31。这种差异在预测miRNA前体的二次结构时带来了很多不确定性，即使前体长度的截止通常任意设定，如不超过300 nt19（此参数嵌入在miRDP2中，miRDP2有经验的用户可以自行调整）。此外，保存植物miRNA家族往往有更多的成员，这些成员的长度变化也往往是显着的13。这就是为什么miRDP2具有参数=L，它指示成员大小中潜在的最大miRNA族。总之，植物miRNA前体的异质性给它们的准确注释带来了许多困难。
其次，siRNA引入的噪音或误报很难消除。除了miRNA，NGS方法还在序列的sRNA库中产生大量的siRNA。尽管siRNA可以通过其生物发生和功能32、33与miRNA分离，但很难根据测序数据和采矿工具来区分它们。许多研究人员认为，miRBase等公共数据库由于大量误报siRNA而急剧恶化，这些误报被错误地批号为miRNA20，31。因此，在 miRNA 注释管道/流程中非常需要具有一套新的严格植物 miRNA 注释标准（如新更新的标准25（补充文件 3）的精制工具。
最后但并非最不重要的一点，当同一方法从小尺寸基因组物种移植到大尺寸的基因组物种时，解析sRNA库的计算时间呈指数级增长。miRDeep-P13和miR-PREFeR26等计算工具，通过捕获和量化sRNA读取沿miRNA前体的特征分布，已成为两种常用方法，并被广泛用于对miRNA进行批注。映射策略、前体候选体的挖掘过程以及随后的二级结构预测需要大量的计算时间16。当这些工具被用来分析数据从小尺寸基因组，如阿拉伯比多西斯到大基因组，如玉米，数据处理时间从几小时到几天甚至几个星期（图1B），导致过程频繁崩溃。因此，迫切需要对上述限制进行创新。
我们新的 miRDP216程序，从 miRDeep-P13更新，旨在克服上述挑战 （补充文件 4）。在此程序中，我们采用了新的过滤策略，优化了评分算法，并纳入了新更新的植物 miRNA 注释标准。由于这些新功能，使用来自5个植物物种的10个sRNA库进行测试时，运行时间明显缩短，这些植物的基因组大小不断增加。此外，与其他工具相比，miRDP2在灵敏度和精度方面均表现出卓越的性能（图1）。综合起来，这些结果表明miRDP2是分析植物中miRNA转录体的快速而准确的工具。
需要注意的是，目前对miRNA特性的理解可能会限制任何计算工具的性能。即使是新更新的miRNA注释标准也基于一组有限的精心研究的例子。因此，推导的信息只是经验性的。事实上，miRNA的独特特征已被证明存在于不同的植物物种或谱系3。此外，miRNA/miRNA®双工的上游和下游区域结构等特性在miRNA生物发生34、35中也起着关键作用，在目前的注释工具中没有考虑到这些特性。随着更多植物物种中经过大量研究的例子的积累，将来可能会开发出更先进的注释工具，以比现有方法更精确地捕获更细微的区别和分类 miRNA。一个有前途的新的miRNA注释方向是结合机器学习方法36，因为训练数据集和注释标准的质量不断提高。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了北京农林科学院（KJCX201917、KJCX20180425和KJCX20180204）对XY和中国国家自然科学基金（31621001）的LL支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer/computing node | N/A | N/A | Perl is required; at least 8 GB RAM and 100 GB storage are recommended |
References
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