Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד, culturing, העברה, וההבחנה העיקרי האנושי מונוציטים מאנשים נגועים בריאים ושליטה בריאה.
Abstract
נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נותר חשש בריאותי גדול למרות המבוא של טיפול תרופתי משולב (עגלה) באמצע שנות ה-90. בעוד טיפול תרופתי ביעילות מורידה עומס נגיפי מערכתית ומשחזר רגיל CD4+ T ספירות תאים, זה לא מהווה מחדש מערכת חיסונית תפקודית לחלוטין. מערכת חיסונית לקוי באנשים שנדבקו ב-HIV שעברו עגלה עשוי להיות מאופיין על ידי הפעלה חיסונית, הזדקנות מוקדמת של תאים חיסוניים, או דלקת מתמשכת. תנאים אלה, יחד עם גורמי הצעת מחלה הקשורים לזיהום HIV, להוסיף מורכבות למחלה, אשר לא ניתן לשכפל בקלות במודלים סלולריים ובעלי חיים. כדי לחקור את האירועים המולקולריים בבסיס תפקוד המערכת החיסונית של חולים אלה, מערכת לתרבות ולתמרן מונוציטים הראשי האנושי בתוך מבחנה מוצג כאן. באופן ספציפי, הפרוטוקול מאפשר את התרבות ואת העיבוד של הראשי CD14+ מונוציטים שהתקבלו מאנשים נגועים ב-hiv שעברו עגלה, כמו גם מפקדים hiv-שלילי. השיטה כרוכה בבידוד, תרבות והעברה של מקרופאגים מונוציטים ובעלי בייט. בעוד קיטים הזמינים מסחרית וריאגנטים מועסקים, הפרוטוקול מספק עצות חשובות ותנאים ממוטבים לדבקות מוצלחת והעברה של מונוציטים עם מדבקות miRNA ו מעכבי כמו גם עם siRNAs.
Introduction
נגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1) זיהום גורם לתפקוד המערכת החיסונית חמורה, אשר יכול להוביל לזיהומים אופורטוניסטים ולרכוש תסמונת הכשל החיסוני (איידס). למרות חולי איידס שעברו עגלה מאופיינים העומסים ויראלי נמוך CD4+ T תא ספירות, תפקוד של המערכת החיסונית ניתן להתפשר על אנשים אלה, המוביל לתגובה חיסונית לקוי כי כבר קשור לסיכון מוגבר לפתח סרטן1. המנגנונים של תפקוד המערכת החיסונית בחולים HIV על עגלת להישאר במידה רבה לא ידוע. לכן, אפיון תאים חיסוניים שמקורם בחולים וחקירת הביולוגיה והתפקוד שלהם הוא מרכיב קריטי של מחקר האיידס הנוכחי.
מונוציטים ו מקרופאגים הם הרגולטורים המפתח של תגובות החיסון ולשחק תפקידים בסיסיים בזיהום HIV2,3,4,5. הטרוגנית ופלסטיק בטבע, מקרופאגים ניתן לסווג באופן נרחב להפעלה קלאסי (M1) או מופעל לחילופין (M2). בעוד סיווג כללי זה הכרחי בעת הגדרת תנאים ניסיוניים, הסטטוס הפולריזציה של מקרופאגים ניתן להפוך על ידי מגוון של ציטוקינים6,7,8,9. למרות מספר מחקרים חקרו את ההשפעות של זיהום האיידס על התאים המונולוציטים והדנדריטים, פרטים מולקולריים של תגובות מונוציט מתווכת הם בעיקר לא ידוע6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. בין הגורמים המעורבים ברגולציה ותפקוד התא החיסונית, microRNAs (miRNAs), קצר שאינו קידוד RNAs שלאחר ההמרה לווסת ביטוי גנים, הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהקשר של מסלולים סלולריים עיקריים (כלומר, צמיחה, בידול, פיתוח, ו אפופטוזיס)20. מולקולות אלה תוארו כרגולטורים חשובים של שעתוק גורמים חיוניים להכתיב את הקיטוב הפונקציונלי של מקרופאגים21. התפקיד הפוטנציאלי של mirnas במונציטים מאנשים נגועים באיידס שעברו עגלה נחקר, אבל ההתקדמות בתחום דורש עבודה הרבה יותר22,23,24,25,26. נייר זה דן שיטה ממוטבת כדי transfect miRNAs ו siRNAs לתוך מונוציטים האנושי העיקרי של חולי איידס ופקדים.
פרוטוקול זה מסתמך על ריאגנטים וערכות זמינים מסחרית, כמו המשכיות בהליך הטכני מסייע למנוע משתנים ניסיוניים מיותרים כאשר עובדים עם דגימות קליניות. עם זאת, השיטה מספקת טיפים חשובים (כלומר, מספר התאים מצופה או הדגירה קצר עם מדיה ללא סרום כדי לקדם את הדבקות של תאים לצלחת). בנוסף, התנאים הפולריזציה המשמשים בפרוטוקול זה נגזרים מהעבודה שפורסמה27,28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות להלן אושרו על ידי מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת לואיזיאנה המרכז הרפואי של ניו אורלינס המועצה לסקירה מוסדית. כל הדם נאסף לאחר קבלת הסכמה מושכלת.
הערה: ההליך כולו מבוצע בתנאים סטריליים במתקן ביולוגי ברמת בטיחות 2 (BSL2) כך שזהירות משמשת לטיפול בחומרים ביולוגיים. בפרט, כל שלב מבוצע תוך שימוש בטכניקות סטריליות תחת ארון בטיחות ביולוגי. לאחר כל שלב הכולל דם, מוצרי דם, תאים, או תא מוצר מלטף, חשוב לשטוף את כל חומר הפלסטיק (כלומר, בדיקות סרולוגית, פיפטה טיפים, וצינורות) עם 10% אקונומיקה ממיכל פסולת בתוך המכסה לפני סילוק נאות.
1. בידוד של מונוציטים אנושיים ראשוניים על ידי בחירה שלילית מגנטית
- לאסוף 40 mL של טרי, כל הדם האנושי (מ או HIV+ חולה או שליטה בריאה) ב 4 10 mL שפופרות ואקום (10 מ"ל של דם לצינור). שימוש בטכניקות סטרילי תחת ארון בטיחות ביולוגי, להעביר את כל 40 mL של דם לתוך 1 50 mL פרופילן tube.
- בעקבות פרוטוקול היצרן של ערכת הבידוד האנושית הנבחרת (טבלת חומרים), הוסיפו 2 מ ל של קוקטייל בידוד מונולי, המסופק בערכה, לצינור הדם. חרוזים מגנטיים מערבולת, גם סיפק את הערכה, עבור 30 s, ולהוסיף 2 מ ל לצינור של דם.
- אם פחות מ-40 mL של דם זמין, לשנות את היקף הריאגנטים הוסיף. כדי לערבב את הפתרון, פיפטה למעלה ולמטה עם פלסטיק 25 מ ל צנרת סרולוגית ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הפרד את תערובת הדם באופן שווה לתוך 4 50 מ ל צינורות ולהוסיף 30 מ ל של מלוחים סטרילית באגירה פוספט (PBS) המכיל 1 מ"מ EDTA לצינור כל. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם מפלסטיק 25 מ ל צנרת סרוולוגית.
- המקום צינורות בעלי מגנט עבור 10 דקות כדי להסיר את הנוגדן מעלה חרוזים מגנטיים. השתמש בארבעה מחזיקי מגנט בו זמנית, אחד לכל צינור, כדי לאפשר זמני דגירה ובידוד עקביים עבור כל דגימת דם.
- לשרטט את התוכן מהמרכז של כל צינור, באמצעות פיפטה, בעוד הם עדיין במחזיקי מגנט. להיזהר לא לצייר את כדוריות הדם האדומות (לא יותר מ 10% של 10 mL הפעלת נפח), ולמקם את התוכן לתוך אחד ארבעה 50 mL חדש צינורות.
- הוסף 500 μL של חרוזים מגנטיים מעורבבים על כל שפופרת 50 mL. פיפטה מעלה ומטה בתוספת של 25 מ ל ו-מודטה ב-RT למשך 5 דקות. ואז, מניחים את הצינורות לתוך מחזיקי מגנט 5 דקות.
- בזהירות להעביר את התוכן מהמרכז של כל צינור בעוד מחזיקי מגנט לתוך אחד ארבעה 50 mL חדש צינורות. ישירות המקום כל 50 mL חדש במחזיקי מגנט עבור 5 דקות.
- העבר בזהירות את התוכן מהמרכז של כל צינור לתוך אחד ארבעה 50 mL חדש צינורות. ספין כל חדש 50 mL צינורות ב 300 x g עבור 5 דקות. ומריפות את supernatant ולהשעות את כל ארבע כדורי התא בסך הכל 10 מ ל של הערוץ הסטרילי.
- ספירת תאים על-ידי טרי, הדרה כחולה באמצעות הומוציטומטר.
הערה: 8-20 x 106 תאים מתקבלים בדרך כלל מ 40 מ ל של דם שלם.
2. מונוציטים של האדם הראשי
- באמצעות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס, חם סרום חינם RPMI 1640 מדיה בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת), ו (תוך המשך להשתמש בטכניקות סטרילי תחת ארון בטיחות ביולוגי) להשעות את המונציטים מבודדים במדיה זו בריכוז של 1 x 106 תאים/mL.
- הוסף 1 מ ל של התאים מחדש על כל טוב של 6 צלחת הבאר או לתוך צלחת 35 מ"מ (המספר הסופי של תאים צריך להיות 1 x 106 תאים/צלחת), ומקום בחממה 37 ° c עם 5% CO2. המתן 0.5-1.0 h עבור תאים לדבוק.
- באמצעות מקלחת מים 37 ° c, חם מופעל בחום (HI) סרום פרה העובר (FBS). הוסף 100 μL (10% ריכוז סופי) של FBS לכל צלחת. הוסף גורמי גדילה לתאים כדי לקדם בידול מקרופאג.
- מקרופאגים ראשוניים לפניטיפ מדומה M1 על ידי הוספת 25 ng/mL של מקרופאג-המושבה-מגרה גורם ממריץ (GM-שדרתי) לתקשורת. מקרופאגים ראשוניים ל-M2 כמו פניטיפ על-ידי הוספת 50 ng/mL של גורם מקרופאג המושבה-מגרה (M-שדרתי) למדיה28.
הערה: שני GM-שדרתי ו-M-שדרתי לאפשר בידול מונוציט מקרופאג פניטיפ כללי (M0) בעוד תאים לקרקע עבור M1 או M2, בהתאמה7,28,30.
- מקרופאגים ראשוניים לפניטיפ מדומה M1 על ידי הוספת 25 ng/mL של מקרופאג-המושבה-מגרה גורם ממריץ (GM-שדרתי) לתקשורת. מקרופאגים ראשוניים ל-M2 כמו פניטיפ על-ידי הוספת 50 ng/mL של גורם מקרופאג המושבה-מגרה (M-שדרתי) למדיה28.
3. שינוי מונוציטים האדם העיקרי בתרבות
- Transfect מונוציטים עם מחקה ומעכבי miRNA או siRNA באמצעות ערכת הכוללת מגיב מבוסס פולימר הזיהום (טבלת חומרים).
- בעקבות הפרוטוקול של היצרן עבור ערכת החצייה (והמשך השימוש של טכניקות סטרילי תחת הקבינט אבטחה טיחות), לדלל תחילה את הגרסה הנבחרת מחקה/מעכבי או sirnas במאגר לריכוז הסופי של 1.83 μm. להכין 10 μl של מדולל לחקות/מעכב להעברה של 1 x 106 תאים.
- הכינו את הזיהום על ידי הוספת 1 μL של הפולימר שסופקו לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי 1.5 mL, ואחריו מיד על ידי הוספת 90 μL של מאגר סיפק (עבור סך של 91 μL של מגיב לתרגום). . מערבולת עבור 3-5 ס
- הפיפטה 90 μL של פתרון החצייה לתוך הצינור המכיל 10 μL של מדולל miRNA לחקות/מעכב או siRNA. מערבבים על ידי ליטוף עדין, הדגירה עבור 15 דקות ב RT.
- הוסף 100 μL של מורכבות העברה לאחד היטב (או מנה) של 1 x 106 מונוציטים מצופה. התאים דגירה עבור 4 h ב 37 ° צ', ולאחר מכן להחליף את המדיום עם 3 מ ל של מדיה מלאה (RPMI 1640 שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 10% חום מופעל FBS) המכיל או GM-שדרתי או M-שדרתי.
4. M1/M2 בידול והפעלה
- המונולוציטים מתחילות מיד להבדיל אל מקרופאגים רחבים M0 על ציפוי בתרבות. , ביום השלישי שלאחר הציפוי להמשיך את השימוש בטכניקות סטרילי תחת ארון בטיחות ביולוגי ולהחליף מדיה עם 3 מ ל של מדיה RMPI טריים 1640 (שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% חום מופעל FBS, ו 25 ng/mL GM-שדרתי לקדם את הקיטוב של M1 או 50 ng/mL M-שדרתי כדי לקדם את הקיטוב תרבות התאים בתנאים אלה למשך כולל של 6 ימים מציפוי ראשוני בחממה ב 37 ° c, 5% CO2.
- כדי לקדם את הקיטוב של התאים החדשים M1-מקרופאג פניטיפ, להפעיל תאים ביום 6 של דגירה על ידי החלפת מדיה תא עם מדיה חדשה המכילה 5% חום הפעלה FBS, 1% עט/דלקת, 100 ng/mL E. coliליפופוליד (lps), ו 20 Ng/ml אינטרפרון גמא (ifn-γ
- כדי לקדם את הקיטוב של התאים מקרופאג-M2, הפעל תאים ביום 6 של דגירה על ידי החלפת מדיה תא עם מדיה חדשה המכילה 5% חום הפעלה fbs, 1% עט/דלקת, 10 ng/ml M-שדרתי, ו 20 ng/ml אינטרלויקין 4 (IL-4).
- לאחר 24 שעות, לקצור את התאים עבור RNA, חלבון, או הזרמת cy, לנסות ניתוחים.
- כאשר התאים מוכנים לאיסוף, לשטוף תאים בצלחת 2x עם PBS (ב RT עבור חילוץ RNA או מקורר על הקרח להפקת חלבון). בגלל מקרופאגים הבדיל הם כעת מחוברים היטב ללוחות, lyse התאים בצלחות ישירות כדי להשיג חומר לניתוח RNA וחלבונים.
- עבור אוסף של חומר עבור cy, להוסיף מכיל את ה-PBS המכיל 2 מ"מ EDTA לצלחת, מודקת את התאים עבור 10 דקות ב 37 ° c, בעדינות לגרד את התאים מן התבשיל, ולאסוף את התוכן בשפופרת 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה לפני שתמשיך עם פרוטוקולים סטנדרטיים.
5. הזרמה הסיטרין
- לשטוף את התאים ב-PBS כדי להסיר את המדיום culturing. ספין למטה 100,000 תאים (לכל זרם cy, לנסות כל המצב) ולהשעות מחדש את הגלולה ב 100 μL של PBS המכיל 2 μL של המעכב איגוד HuFcR. מודקון בשעה RT עבור 15 דקות.
- הוסף 50 μL של מאגר הצביעת והנוגדנים הרצויים (כאן, CD80, CD83, CD163 ו-CD209 שימשו) בכמויות המומלצות.
- מערבבים בעדינות ומודגרות ב -4 ° c בחשכה במשך 30 דקות.
- לשטוף 2x עם PBS ולהשעות מחדש את התאים המוכתמת ב-150 μL של PBS לפני הפעלת המדגם על ציטופלוורימטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המתואר, מונוציטים האדם העיקרי מאנשים נגועים באיידס ותורמים בריאים היו מבודדים. כל הנתונים המוצגים כאן התקבלו מ-HIV+ נושאים שעברו עגלה עם נמוך (< 20 עותקים/mL) או העומסים ויראלי מגילוי ורגיל CD4+ T תאים ספירות. מיד לאחר בידוד, התאים היו מוכתמים, והזרימה cy, בוצע כדי לאשר את הטוהר של אוכלוסיות תאים. תוצאות המחקר הראו כי > 97% של תאים ויטראז ' חיובי עבור CD14 (נתונים לא מוצגים). לקיטוב של מקרופאגים, פרוטוקול שפורסם שימש28. מונוציטים אנושיים ראשוניים היו מתורבתים בנוכחות GM-שדרתי או M-שדרתי במשך 6 ימים. ביום השישי, תאים הופעלו לעבר מקרופאגים M1 או M2. עשרים וארבע שעות לאחר ההפעלה, תאים נקצרו והוכתם לצורך זרימה cy, try ניתוח של סמנים תא מקרופאג.
איור 1 מראההיסטגרמות מייצגים של שליטה M1-מופעל-(איור 1א) והמטופל נגזר (איור 1B) תאים עם רמות גבוהות של CD80 ו CD83 וירידה רמות של CD163 בהשוואה תאים T0 שאינם מופעלים, כמו גם תאים M2 המופעל עם רמות גבוהות של CD163 ו CD209. לוח C ב מראה ביטוי של CD80, CD83, CD163, ו CD209 בתאים מקוטב M1 ו-M2. הגרף מייצג את הנתונים הממוצעים שהושגו משלוש ערכות של תאים שמקורם בבקרת שליטה ושלוש. כצפוי, רמות הביטוי של CD80 ו-CD83 גדלו ב-M1 בהשוואה לתאי מקוטב M2, בעוד CD209 ו CD163 היו מאוד מבוטא ב-M2 לעומת תאים מקוטב M1. מעניין, CD80 ו CD83 נראו מאוד מבוטא בתאים שמקורם בשליטה בהשוואה לתאים הנגזרים מאיידס. עם זאת, הבדלים פוטנציאליים ביכולת הקיטוב ו/או רמות הביטוי של סמנים פולריזציה בתאים הנגזרים מאיידס לעומת הפקדים דורש חקירה נוספת. למרות GM-שדרתי, M-שדרתי, LPS, ו IFN-γ נבחרו כטיפולים, שילובים אחרים של גורמי גדילה, ציטוקינים, או גירוי ניתן להשתמש עם פרוטוקול זה28.
לאחר ניסויים ראשוניים הראו כי הליך הבידוד היה מוצלח, המונציטים הטריים שנאספו היו מצופים ב 6 צלחות היטב ו מעורבב עם מקושקשות, כמעט אינפרא אדום התווית miRNA כדי לקבוע את יעילות הזיהום. התאים התעברו 24 שעות לאחר ההעברה על ידי מיקרוסקופ קונפנט פלורסנט. בשיטה זו הושגה > 90% יעילות החצייה, כפי שנקבע על-ידי הזרימה של cy, (איור 2א) ומיקרוסקופית הקונטרקלית (איור 2ב').
הבא, הכדאיות של התאים לאחר הזיהום נקבע. איור 3 מראה את הכדאיות של תאים, נקבע באמצעות שיטה מטרית צביעה כממוצע של תאים הנגזרים משני חולים (איור 3א) ושני פקדים (איור 3ב) מנוכר ביום 1 (איור 3א) או יום 4 (איור 3ב) ונקצרו ביום 7. עבור ניסוי זה, 50,000 תאים היו מצופים על צלחת מרובת היטב 96 ומנוכר בעקבות הפרוטוקול. באופן כללי, העברה לא הפחיתה באופן משמעותי את הכדאיות של התאים, ללא קשר לשלב ההבשלה של התאים ותנאי החצייה (כלומר, ללעוג, מקושקשות siRNA/miRNA, או siRNA/miRNA). יש לציין כי איור 3 מייצג נתונים המתקבלים מתאים שנגזר מהמטופל (לוח A) ומתאים הנגזרים מהבקרה (לוח ב'). זה היה הכרחי, כיוון שאין מספיק תאים כדי לבצע את הניסוי המלא (הן הכדאיות והכתם המערבי ליום 1 ויום 4 הפעולות השונות, בשישה תנאים שונים לאחר החצייה) עם מדגם אחד הצליחו להתקבל. עם זאת, הדמות מספקת תוצאות מייצגים השגה עם או שליטה או תאים נגזר החולה.
אז, את האפקטיביות של מעבר siRNA על mRNA היעד הוערך על ידי הערכת הביטוי חלבון. תוצאות באיור 4 להראות יעיל downregulation של EIF4EBP1, מווסת translational בשפע בתאים אלה, על החצייה עם sirna ספציפית בשני היום 1 (איור 4a) ויום 4 (איור 4ג). אותו מווסת גם שמר על ביטוי תחת תנאי שליטה שונים (כלומר, מנוכר, ללעוג, siRNA מעורבל, ו EIF4EBP1 siRNA ללא הסרת הזיהום: סר *). בדיקת כימות של ניסויים כתמי מערבי ליום 1 ויום 4 החצייה מוצגים באיור 4B ואיור 4ד, בהתאמה. בנוסף, רמות הביטוי של מיר-146a-5p בעקבות הזיהום ביום 1 או יום 4 על ידי RT-qPCR של תאים הנגזרים מאיידס נקבע (איור 4E). תאים שעברו עם מחקים miRNA הראו עלייה להגדיל 48-to 72 לקפל ביטוי miRNA על התאים מנוכר, בעוד כל שולטת התרגום להראות שום שינויים ניכרת.
איור 1: המקפאגים הנגזרים מונוציט מקוטב בהצלחה ומופעלים לכיוון M1 או M2 מקרופאג הפנוטיפים. הזרימה cy, try תוצאות הניתוח של תאים נגזר שליטה בריאה אחת (א) ואחד מדגם התאים הנגזר של HIV (ב) להראות רמות של CD80, CD83, CD163, ו CD209. הניסוי חזר על עצמו עם שני בקרים נוספים ושניים נוספים דגימות HIV-חיוביות עם תוצאות דומות. אוכלוסיית העניין הסלולרית הייתה מגודרת על בסיס פרמטרי פיזור של הפנים והצד, ולאחריה הפליה בספקנות. (C) גרף בר המציג CD80, CD83, CD163 וCD209 בתאים מקוטי M1 ו-M2. הגרף מייצג את הנתונים הממוצעים ואת הסטיות הסטנדרטיות שהתקבלו משלושה פקדים-(Ctrl) ושלושה ערכות של תאים הנגזרים מאיידס (Pts). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: CD14 האנושי העיקרי+ תאים הם ביעילות מפותחת עם mirnas. (א) זרימה cy, ניתוח של מונוציטים הראשי נגזר בקרות בריאות, 24 h לאחר ההעברה, מראה > 90% התייעלות. (ב) הנציגה הייצוגית שצולמה 24 שעות לאחר ההעברה מראה כי כל התאים בשדה לבטא את mirna מצומדת עם צבע כמעט אינפרא אדום (לבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכדאיות של תאים מזוהמים. פסים גרף מייצגים הכדאיות הממוצעת של התאים של שני HIV+ חולים (A) ושני בקרים בריאים (ב) נקבע באמצעות שיטה מטרית צביעה, לאחר התפשטות עם מיר-146A-5p או sirna כדי EIF4EBP1 (sirna) ואת הפקדים המתאימים ביום 1 (א) או יום 4 (ב), כל נבדק ב אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בידוד יעיל של רמות החלבון על ידי siRNA/miRNA לאחר הבידוד של CD14+ מונוציטים. בקרה ו-HIV נגזר מונוציטים (1 x 106 תאים) היו מזוהמים ביום 1 (א) או יום 4 (ג) לאחר בידוד באמצעות sirna נגד EIF4EBP1 mrna. חלוניות (ב) ו -(ד) מייצגות את כימות הביטוי EIF4EBP1 בהשוואה ל-' העברה ', והיא מבוטאת כאחוז מעל המודל עבור המטופל (Pt) או הפקד (Ctrl) (A) או מנוכר לחולה או לפקד (B). (ה) מייצג את הגרף בר של שני ניסויים המראים מיר-146a-5p ביטוי בתאים הנגזרים מזוהמים ביום 4 (ברים 1-4) או יום 1 (בסרגל הימני) וקצרו ביום 7. שינוי הקיפול מחושב על המדגם הבלתי מבוקר (סר = siRNA). סר * או מיר-145a-5p * לציין דגירה של התאים עם siRNA או מיר-146a-5p ללא הזיהום מגיב. הניסוי חזר על 2x עם תאים שמקורם בשליטה והפיק ביסודו את אותן תוצאות (נתונים לא מוצגים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג ממחיש את השימוש בתאים הראשוניים של הנושאים נגועים HIV כמודל לחקר מונוציטים מקרופאגים. HIV+ חולים שעברו עגלה לחיות עם זיהום במשך שנים מרובות יכול להיות גם שיתוף זיהומים אחרים הקשורים מערכת חיסונית פרוצים. כדי ללמוד האימונומודולזילציה בנוכחות של זיהום HIV כרונית, תאים נקצרו מחולים ישירות. כמו miRNAs הוכחו לשחק תפקידים מרכזיים בפיתוח התא בידול, הפרוטוקול מתמקד ביכולת לתמרן ביטוי Mirnas בתאים ראשוניים אלה (איור 2, איור 3, איור 4). באמצעות אותו הנוהל, פרוטוקול זה גם עובד היטב עבור siRNAs (איור 3, איור 4). בשל הפעילות הפוטנציאלית phagocytic של מקרופאגים בוגרים, בנוסף ללעוג השליטה siRNA, בקרה משמש (מצוין סר * או מיר * באיור 3 ואיור 4), שבו מגיב הזיהום מושמט. נתונים לאשר כי הזרע מגיב נדרש עבור משלוח הנכון siRNA/miRNA לתוך התאים, כמו ללא מגיב, התאים לא לספיגת באופן ספונטני miRNA או siRNA, גם כאשר הם כבר הבדיל לתוך מקרופאגים (יום 4 לאחר ציפוי וקיטוב, איור 3 ואיור 4).
בעוד שימוש בקיטים הזמינים מסחרית לבידוד והעברה של הCD14 העיקרי של האדם+ מונוציטים, ישנם שלבי מפתח המותאמים להפוך את ההליך לניתן לקריאה ולהצלחה. במיוחד, 1) מספר התאים מצופה קריטי עבור ההישרדות שלהם בידול, ו 1 x 106 תאים/35 מ"מ הצלחת נמצא לעבוד הטוב ביותר. 2) מבודדים טריים CD14+ תאים לא אחיד לצרף את התבשיל תרבות אם נזרע בנוכחות של fbs. כתוצאה מכך, בעת החלפת המדיום 4 h לאחר הפיכת החוצה, כל התאים שאינם מצורפים יוסרו, מה שהופך את לוחית לוחית משתנה מאוד. 3) התגלה כי החלפת הגוף בינוני 4 h לאחר החצייה, מפחיתה את הרעילות בשל ריאגנטים להפחתת שעות ההעברה בזמן שאינם משפיעים על היעילות של הזיהום. 4) תנאי העברה ממוטבים כדי לדרוש פחות siRNA או miRNA (15 ננומטר) מאשר ריכוזים המומלצים על ידי היצרן (25 ננומטר). 5) בשל האופי החסיד של התאים, הוספת מאגר הליזה ישירות לצלחת משפרת מאוד את הריכוז של חלבונים או RNA שנקטפו. עם זאת, אם יש צורך להסיר את התאים מהצלחת (כלומר, עבור ניתוח cy, הזרמת הזרימה), מוטב להשתמש ב-PBS עם EDTA ולגרד בעדינות את התאים. שיטה זו מקטינה את מספר התאים שנאספו בכ-20%-30%, לכן חשוב לתכנן ניסויים בהתאם להשגת מספרי תאים מספיקים לצורך ניתוח נוסף.
כאשר מעקב כראוי, הליך זה מדגים את השגת CD14 טהור מאוד+ אוכלוסיה של מונוציטים, העברה של Sirnas ו rnas קטנים כגון mirnas, התרבות תנאים, בידול לתוך M1 או M2 מקרופאגים. שיטה זו עשויה להיות מיושמת כדי לחקור מחלות מורכבות או זיהומים שאינם HIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות ליבה של HIV קליני/הגידול Biore, הליבה למתן דגימות החולה והליבה מטבוליזם של הסלולר לאספקת זרימה cy, לנסות ניתוח. פרויקט זה מומן על ידי NIH P20GM121288 ו-P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
