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Immunology and Infection

अलगाव, ट्रांसफेक्शन, और प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स की संस्कृति

Published: December 16, 2019 doi: 10.3791/59967
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1, 1,3, 1,2
1Department of Medicine, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Microbiology, Immunology, and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Biomedical and Clinical Sciences L. Sacco, University of Milan

Summary

यहां प्रस्तुत एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों और स्वस्थ नियंत्रणों से मानव प्राथमिक मोनोसाइट्स को अलग करने, संजोने, अलग करने और अंतर करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है।

Abstract

मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) 1990 के दशक के मध्य में संयुक्त एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (cART) की शुरुआत के बावजूद एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता का विषय बना हुआ है । जबकि एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी कुशलता से प्रणालीगत वायरल लोड को कम करती है और सामान्य सीडी 4+ टी सेल की गिनती को पुनर्स्थापित करती है, यह पूरी तरह से कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली का पुनर्गठन नहीं करती है। एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों में एक बेकार प्रतिरक्षा प्रणाली कैआरटी से गुजर रही प्रतिरक्षा सक्रियण, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जल्दी उम्र बढ़ने, या लगातार सूजन की विशेषता हो सकती है। एचआईवी संक्रमण से जुड़े कोमोर्बिड कारकों के साथ-साथ ये स्थितियां इस बीमारी में जटिलता जोड़ती हैं, जिसे सेलुलर और पशु मॉडल में आसानी से पुन: पेश नहीं किया जा सकता है। इन रोगियों में प्रतिरक्षा रोग अंतर्निहित आणविक घटनाओं की जांच करने के लिए, विट्रो में मानव प्राथमिक मोनोसाइट्स को संस्कृति और हेरफेर करने के लिए एक प्रणाली यहां प्रस्तुत की जाती है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों से प्राप्त प्राथमिक CD14+ मोनोसाइट्स की संस्कृति और ट्रांसफेक्शन के साथ-साथ एचआईवी-नकारात्मक नियंत्रणों से अनुमति देता है। विधि में मोनोसाइट्स और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का अलगाव, संस्कृति और ट्रांसफेक्शन शामिल है। जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट और अभिकर्मक ों को नियोजित किया जाता है, प्रोटोकॉल मिरना नकल और अवरोधकों के साथ-साथ सिनाके के साथ मोनोसाइट्स के सफल पालन और ट्रांसफेक्शन के लिए महत्वपूर्ण सुझाव और अनुकूलित स्थितियां प्रदान करता है।

Introduction

ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस-1 (एचआईवी-1) संक्रमण गंभीर प्रतिरक्षा रोग का कारण बनता है, जो अवसरवादी संक्रमण का कारण बन सकता है और इम्यूनोडेफिशिएंसी सिंड्रोम (एड्स) का अधिग्रहण कर सकता है। हालांकि एचआईवी संक्रमित cART के दौर से गुजर रोगियों को कम वायरल भार और सामांय CD4+ टी सेल मायने रखता है की विशेषता है, प्रतिरक्षा प्रणाली के कामकाज इन व्यक्तियों में समझौता किया जा सकता है, एक बेकार प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि कैंसर के विकास के एक बढ़े हुए जोखिम से जोड़ा गया है के लिए अग्रणी1। CART पर एचआईवी रोगियों में प्रतिरक्षा रोग के तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहते हैं । इसलिए, रोगी-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशेषता और उनके जीव विज्ञान और कार्य की जांच वर्तमान एचआईवी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण घटक है।

मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रमुख नियामक हैं और एचआईवी संक्रमण2,3,4,5में मौलिक भूमिका निभाते हैं । विषम और प्रकृति में प्लास्टिक, मैक्रोफेज को मोटे तौर पर शास्त्रीय रूप से सक्रिय (एम 1) या वैकल्पिक रूप से सक्रिय (एम 2) में वर्गीकृत किया जा सकता है। हालांकि प्रायोगिक स्थितियों की स्थापना करते समय यह सामान्य वर्गीकरण आवश्यक है, लेकिन मैक्रोफेज की ध्रुवीकरण की स्थिति को विभिन्न प्रकार के साइटोकिन्स6,7,8,9से उलट दिया जा सकता है। यद्यपि कई अध्ययनों ने मोनोसाइट्स और डेंड्रिटिक कोशिकाओं पर एचआईवी संक्रमण के प्रभावों की जांच की है, लेकिन मोनोसाइट-मध्यस्थता वाली प्रतिक्रियाओं का आणविक विवरण काफी हद तक अज्ञात6,7,10, 11,12,13,14,15,16, 17,18,19है । प्रतिरक्षा सेल विनियमन और कार्य में शामिल कारकों में, माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए), शॉर्ट नॉन-कोडिंग आरएनए जो पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनी जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं, को प्रमुख सेलुलर रास्तों (यानी विकास, भेदभाव, विकास और एपोप्टोसिस)20के संदर्भ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। इन अणुओं को मैक्रोफेज21के कार्यात्मक ध्रुवीकरण को हुक्म देने के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारकों के महत्वपूर्ण नियामक ों के रूप में वर्णित किया गया है । एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों से मोनोसाइट्स में miRNAs की संभावित भूमिका की जांच की गई है,लेकिन इस क्षेत्र में प्रगति के लिए22,23,24,25,26अधिक काम की आवश्यकता है । यह पत्र एचआईवी संक्रमित रोगियों और नियंत्रणों से प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स में मिरना और सिनास को स्थानांतरित करने के लिए एक अनुकूलित विधि पर चर्चा करता है।

यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और किट ों पर निर्भर करता है, क्योंकि तकनीकी प्रक्रिया में निरंतरता नैदानिक नमूनों के साथ काम करते समय अनावश्यक प्रयोगात्मक चर को खत्म करने में मदद करती है। फिर भी, विधि महत्वपूर्ण सुझाव प्रदान करता है (यानी, प्लेट के लिए कोशिकाओं के पालन को बढ़ावा देने के लिए सीरम मुक्त मीडिया के साथ चढ़ाया या संक्षिप्त ऊष्मायन कोशिकाओं की संख्या) । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली ध्रुवीकरण की स्थितियांप्रकाशित कार्य27,28,29से प्राप्त होती हैं।

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Protocol

नीचे वर्णित सभी तरीकों को लुइसियाना स्टेट यूनिवर्सिटी हेल्थ साइंसेज सेंटर न्यू ऑरलियन्स इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड ने मंजूरी दी है । सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद सभी रक्त एकत्र किए गए।

नोट: पूरी प्रक्रिया एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) सुविधा में बाँझ परिस्थितियों के तहत किया जाता है ताकि सावधानी जैविक सामग्री को संभालने के लिए प्रयोग किया जाता है । विशेष रूप से, प्रत्येक चरण एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत बाँझ तकनीकों का उपयोग करके किया जाता है। रक्त, रक्त उत्पादों, कोशिकाओं, या सेल उत्पाद पाइपिंग से जुड़े प्रत्येक चरण के बाद, उचित निपटान से पहले हुड के अंदर एक अपशिष्ट कंटेनर से 10% ब्लीच के साथ सभी प्लास्टिक सामग्री (यानी, सीरोलॉजिकल पिपेट, पिपेट टिप्स और ट्यूब) को कुल्ला करना महत्वपूर्ण है।

1. इम्यूनोमैग्नेटिक निगेटिव सेलेक्शन द्वारा प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स का अलगाव

  1. चार 10 मिलील एथिलीनडायमिनेटेटेसेटिक एसिड (EDTA) वैक्यूम ट्यूब (प्रति ट्यूब रक्त का 10 मिलील) में ताजा, मानव पूरे रक्त (या तो एक एचआईवी+ रोगी या स्वस्थ नियंत्रण से) के 40 मिलील लीजिए। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत बाँझ तकनीकों का उपयोग करना, एक 50 मीटर शंकुपलीन ट्यूब में रक्त के सभी 40 mL हस्तांतरण।
  2. चयनित मानव मोनोसाइट आइसोलेशन किट(सामग्री की तालिका)के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, किट में प्रदान किए गए मोनोसाइट आइसोलेशन कॉकटेल के 2 मिलील को रक्त की ट्यूब में जोड़ें। भंवर चुंबकीय मोती, किट में भी प्रदान की गई, 30 एस के लिए, और रक्त की ट्यूब में 2 mL जोड़ें।
    1. यदि 40 मिलीसे कम रक्त उपलब्ध है, तो अभिकर्मकों को नीचे ले जाएं। समाधान को मिलाने के लिए, एक प्लास्टिक 25 मिलीस सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पिपेट करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. रक्त मिश्रण को समान रूप से चार 50 मिलील ट्यूबों में अलग करें और प्रत्येक ट्यूब में 1 मीटर ईटीए युक्त बाँझ फास्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) के 30 मिलील जोड़ें। प्लास्टिक 25 मिलीसले सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
  4. ट्यूबों को एंटीबॉडी-कंजुगेड चुंबकीय मोतियों को हटाने के लिए 10 मिन के लिए चुंबक धारकों में रखें। प्रत्येक रक्त नमूने के लिए लगातार ऊष्मायन और अलगाव के समय की अनुमति देने के लिए, प्रत्येक ट्यूब के लिए एक साथ चार चुंबक धारकों का उपयोग करें।
  5. प्रत्येक ट्यूब के केंद्र से सामग्री को खींचें, एक पिपेट का उपयोग करके, जबकि वे अभी भी चुंबक धारकों में हैं। सावधान रहें कि लाल रक्त कोशिकाओं (10 मीटर शुरू मात्रा का 10% से अधिक नहीं) को आकर्षित न करें, और सामग्री को चार नए 50 एमसीएल ट्यूबों में से एक में रखें।
  6. प्रत्येक 50 मीटर ट्यूब में भंवर चुंबकीय मोतियों के 500 माइक्रोन जोड़ें। एक 25 mL पिपेट और 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट के साथ ऊपर और नीचे पिपेट । इसके बाद ट्यूबों को 5 मिन के लिए चुंबक धारकों में रखें।
  7. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब के केंद्र से सामग्री हस्तांतरण, जबकि अभी भी चुंबक धारकों में चार नए ५० mL ट्यूबों में से एक में । चुंबक धारकों में प्रत्येक नए 50 एमएएल ट्यूब को सीधे 5 मिन के लिए रखें।
  8. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब के केंद्र से चार नए 50 मिलील ट्यूबों में से एक में सामग्री स्थानांतरित करें। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सभी नए 50 मीटर ट्यूबों को स्पिन करें। एस्पिरेट द सुपरनेटेंट और बाँझ पीबीएस के कुल 10 मीटर में सभी चार सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  9. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन द्वारा कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: 8-20 x 106 कोशिकाओं को आम तौर पर पूरे रक्त के 40 मिलीएल से प्राप्त कर रहे हैं।

2. प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स की संस्कृति

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान का उपयोग करना, गर्म सीरम-मुक्त आरपीएमआई 1640 मीडिया 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप) के साथ पूरक है, और (बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत बाँझ तकनीकों का उपयोग जारी रखते हुए) 1 x 106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर इस मीडिया में अलग मोनोसाइट्स को फिर से निलंबित करें।
  2. 6 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में या 35 मिमी पकवान में पुनर्निलंबित कोशिकाओं का 1 किलोल जोड़ें (कोशिकाओं की अंतिम संख्या 1 x 106 कोशिकाएं/प्लेट होनी चाहिए), और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं का पालन करने के लिए 0.5-1.0 घंटे रुको।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान का उपयोग करना, गर्म गर्मी-निष्क्रिय (एचआई) भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस)। प्रत्येक प्लेट में एफबीएस के 100 माइक्रोन (10% अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। मैक्रोफेज भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए कोशिकाओं में विकास कारक जोड़ें।
    1. मीडिया में ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के 25 एनजी/एमएल जोड़कर एम1 जैसे फेनोटाइप के लिए प्राइम मैक्रोफेज । मीडिया28में मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के ५० एनजी/एमएल जोड़कर एम2 जैसे फेनोटाइप के लिए प्राइम मैक्रोफेज ।
      नोट: जीएम-सीएसएफ और एम-सीएसएफ दोनों ही एम 1 या एम 2 के लिए कोशिकाओं को क्रमशः7,28,30के लिए कोशिकाओं को भड़काते हुए सामान्य मैक्रोफेज फेनोटाइप (एम0) में मोनोसाइट भेदभाव की अनुमति देते हैं।

3. संस्कृति में प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स का ट्रांसफेक्शन

  1. मिरना नकल या अवरोधक या सिरना के साथ ट्रांसफेक्ट मोनोसाइट्स एक किट का उपयोग करके पॉलीमर-आधारित ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान(सामग्री की तालिका)युक्त एक किट का उपयोग करते हैं।
    1. ट्रांसफेक्शन किट के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करना (और बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत बाँझ तकनीकों का उपयोग जारी रखना), पहले बफर में चयनित मिरना नकल/अवरोधक या siRNAs को 1.83 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें। 1 x 106 कोशिकाओं के प्रति ट्रांसफेक्शन पतला नकल/अवरोधक के 10 माइक्रोन तैयार करें।
  2. प्रदान की गई बहुलक के 1 माइक्रोनकोल को ताजा 1.5 मीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जोड़कर ट्रांसफेक्शन रिएजेंट तैयार करें, इसके तुरंत बाद प्रदान किए गए बफर के 90 माइक्रोन (प्रति ट्रांसएजेंट प्रति रिएजेंट के कुल 91 μL के लिए)। 3-5 एस के लिए भंवर ।
  3. ट्यूब में ट्रांसफेक्शन समाधान का पिपेट 90 माइक्रोन जिसमें पतला मिरना नकल/अवरोधक या सिआरएनए के 10 माइक्रोन शामिल हैं। आरटी में 15 मिन के लिए कोमल पाइपटिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिलाएं।
  4. 1 x 106 चढ़ाया मोनोसाइट्स के एक अच्छी तरह से (या पकवान) के लिए ट्रांसफेक्शन कॉम्प्लेक्स के 100 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं, तो पूरा मीडिया के 3 mL के साथ माध्यम की जगह (RPMI 1640 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ पूरक) या तो जीएम-सीएसएफ या एम सीएसएफ युक्त।

4. M1/M2 भेदभाव और सक्रियण

  1. मोनोसाइट्स तुरंत संस्कृति में चढ़ाना पर व्यापक M0 मैक्रोफेज में अंतर शुरू करते हैं। चढ़ाना के बाद तीसरे दिन, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत बाँझ तकनीकों का उपयोग जारी रखें और ताजा RMPI १६४० मीडिया के 3 mL के साथ मीडिया की जगह (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, 10% गर्मी निष्क्रिय FBS, और या तो 25 एनजी/mL जीएम-सीएसएफ M1 को बढ़ावा देने के लिए ध्रुवीकरण या ५० एनजी/एमएल एम-सीएसएफ की तरह ध्रुवीकरण की तरह) । 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर एक इनक्यूबेटर में प्रारंभिक चढ़ाना से कुल 6 दिनों के लिए इन स्थितियों में कोशिकाओं को संस्कृति।
  2. M1-मैक्रोफेज फेनोटाइप के लिए प्राइमेड कोशिकाओं के ध्रुवीकरण को आगे बढ़ाने के लिए, 5% गर्मी निष्क्रिय एफबीएस, 1% पेन/स्ट्रीप, १०० एनजी/एमएल ई. कोलाई-व्युत्पन्नलिपोपोलिसाहरिडे (एलपीएस), और 20 एनजी/एमएल इंटरफेरॉन गामा (IFN--)) युक्त नए मीडिया के साथ सेल मीडिया की जगह से ऊष्मायन के 6 दिन पर कोशिकाओं को सक्रिय करें ।
  3. M2-मैक्रोफेज फेनोटाइप के लिए प्राइमेड कोशिकाओं के ध्रुवीकरण को आगे बढ़ाने के लिए, 5% गर्मी निष्क्रिय एफबीएस, 1% पेन/स्ट्रीप, 10 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ, और 20 एनजी/एमएल इंटरल्यूकिन 4 (आईएल-4) युक्त नए मीडिया के साथ सेल मीडिया की जगह से ऊष्मायन के 6 दिन पर कोशिकाओं को सक्रिय करें ।
  4. 24 घंटे के बाद, आरएनए, प्रोटीन, या प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को फसल।
    1. जब कोशिकाएं संग्रह के लिए तैयार होती हैं, तो पीबीएस के साथ डिश 2x में कोशिकाओं को धोएं (आरएनए निष्कर्षण के लिए आरटी पर या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए बर्फ पर ठंडा)। क्योंकि विभेदित मैक्रोफेज अब दृढ़ता से प्लेटों से जुड़े हुए हैं, आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए सामग्री प्राप्त करने के लिए सीधे प्लेटों में कोशिकाओं को लाइसे।
    2. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए सामग्री के संग्रह के लिए, डिश में 2 एमएम ईटीए युक्त पीबीएस जोड़ें, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 किमी के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, धीरे-धीरे पकवान से कोशिकाओं को कुरेदलें, और मानक प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले 1.5 मिलीएम माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में सामग्री एकत्र करें।

5. फ्लो साइटोमेट्री

  1. पुलिया माध्यम को हटाने के लिए पीबीएस में कोशिकाओं को कुल्ला। 100,000 कोशिकाओं (प्रत्येक प्रवाह साइटोमेट्री स्थिति के अनुसार) को स्पिन करें और एचएफसीआर बाध्यकारी अवरोधक के 2 माइक्रोन युक्त पीबीएस के 100 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। 15 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  2. अनुशंसित मात्रा में धुंधला बफर और वांछित एंटीबॉडी (यहां, सीडी80, सीडी83, सीडी 163 और सीडी 209) के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  3. 30 मिन के लिए अंधेरे में धीरे-धीरे मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट लें।
  4. पीबीएस के साथ 2x धोएं और साइटोफ्लोरीमीटर पर नमूना चलाने से पहले पीबीएस के 150 माइक्रोन में दाग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।

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Representative Results

वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करना, एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों और स्वस्थ दाताओं से प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स अलग थे । यहां प्रस्तुत सभी डेटा एचआईवी+ कम (<20 प्रतियां/mL) या अज्ञेय वायरल लोड और सामांय सीडी 4+ टी सेल मायने रखता है के साथ CART के दौर से गुजर विषयों से प्राप्त किए गए । अलगाव के तुरंत बाद, कोशिकाओं को दाग दिया गया था, और प्रवाह साइटोमेट्री सेल आबादी की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए किया गया था। परिणामों से पता चला है कि और 97% कोशिकाएं सीडी 14 (डेटा नहीं दिखाए गए) के लिए सकारात्मक हैं। मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण के लिए, एक प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग28किया गया था। 6 दिनों तक जीएम-सीएसएफ या एम-सीएसएफ की उपस्थिति में प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स को सुसंस्कृत किया गया था। छठे दिन, कोशिकाओं को या तो M1 या M2 मैक्रोफेज की ओर सक्रिय किया गया । चौबीस घंटे के बाद सक्रियण, कोशिकाओं काटा और मैक्रोफेज सेल मार्कर के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए दाग थे ।

चित्रा 1 M1-सक्रिय नियंत्रण के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम से पता चलता है-(चित्रा 1ए)और रोगी-व्युत्पन्न(चित्रा 1बी)सीडी80 और सीडी83 के बढ़े हुए स्तर ों के साथ कोशिकाओं और सीडी 163 के स्तर में कमी आई जब गैर सक्रिय टी0 कोशिकाओं की तुलना में, साथ ही साथ M2-CD163 और CD209 के स्तर में वृद्धि के साथ सक्रिय कोशिकाओं । पैनल सी में सीडी 80, CD83, CD163, और M1 और M2 ध्रुवीकृत कोशिकाओं में CD209 की अभिव्यक्ति से पता चलता है। ग्राफ तीन नियंत्रण से प्राप्त औसत डेटा का प्रतिनिधित्व करता है-और कोशिकाओं के तीन एचआईवी-व्युत्पन्न सेट । जैसा कि उम्मीद थी, M2 ध्रुवीकृत कोशिकाओं की तुलना में M1 में सीडी80 और सीडी83 की अभिव्यक्ति का स्तर बढ़ा, जबकि सीडी 209 और सीडी 163 एम 1 ध्रुवीकृत कोशिकाओं की तुलना में एम 2 में अधिक व्यक्त किए गए थे। दिलचस्प बात यह है कि सीडी80 और सीडी83 एचआईवी-व्युत्पन्न कोशिकाओं की तुलना में नियंत्रण-व्युत्पन्न कोशिकाओं में अधिक अत्यधिक व्यक्त किए जाते दिखाई दिए। हालांकि, नियंत्रण की तुलना में एचआईवी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में ध्रुवीकरण मार्कर के ध्रुवीकरण और/या अभिव्यक्ति के स्तर में संभावित मतभेदों को आगे की जांच की आवश्यकता है । यद्यपि जीएम-सीएसएफ, एम-सीएसएफ, एलपीएस और आईएफएन-ए-को उपचार के रूप में चुना गया था, लेकिन विकास कारकों, साइटोकिन्स या उत्तेजकों के अन्य संयोजनों का उपयोग इस प्रोटोकॉल28के साथ किया जा सकता है।

प्रारंभिक प्रयोगों के बाद पता चला कि अलगाव प्रक्रिया सफल रहा था, हौसले से एकत्र मोनोसाइट्स 6 अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाया गया और ट्रांसफेक्शन दक्षता निर्धारित करने के लिए एक तले हुए, निकट अवरक्त लेबल मिरना से ट्रांससंक्रमित किया गया । कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 24 घंटे के बाद ट्रांसफेक्शन की छवि दी गई थी। इस विधि के साथ, ट्रांसफेक्शन की 90% दक्षता प्राप्त की गई थी, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 2ए)और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2बी)द्वारा निर्धारित किया गया था।

इसके बाद, ट्रांसफेक्शन के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता निर्धारित की गई थी। चित्रा 3 कोशिकाओं की व्यवहार्यता दिखाता है, जो दो रोगियों(चित्रा 3ए)और दो नियंत्रणों(चित्रा 3बी) से प्राप्त कोशिकाओं के औसत के रूप में एक रंगीन परख का उपयोग करके निर्धारित करता है (चित्रा 3बी)दिन 1(चित्रा 3ए)या दिन 4(चित्रा 3बी)पर काटा जाता है और 7 दिन में काटा जाता है। इस प्रयोग के लिए, 50,000 कोशिकाओं को 96 बहु-अच्छी प्लेट पर चढ़ाया गया था और प्रोटोकॉल का पालन करते हुए ट्रांससंक्रमित किया गया था। सामान्य तौर पर, ट्रांसफेक्शन ने कोशिकाओं की व्यवहार्यता को काफी कम नहीं किया, कोशिकाओं की परिपक्वता के चरण और ट्रांसफेक्शन की स्थिति (यानी, नकली, तले हुए siRNA/miRNA, या siRNA/miRNA) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चित्रा 3 रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं (पैनल ए) और नियंत्रण-व्युत्पन्न कोशिकाओं (पैनल बी) से प्राप्त डेटा का प्रतिनिधित्व करता है। यह आवश्यक था, क्योंकि पूर्ण प्रयोग करने के लिए पर्याप्त कोशिकाएं (1 दिन और दिन 4 ट्रांसफेक्शन के लिए व्यवहार्यता और पश्चिमी दाग, प्रति ट्रांसफेक्शन छह अलग-अलग स्थितियों में) एक नमूने के साथ प्राप्त करने में सक्षम थे। फिर भी, आंकड़ा या तो नियंत्रण या रोगी से व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ प्राप्य प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है ।

फिर, प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करके लक्ष्य एमआरएनए पर siRNA ट्रांसफेक्शन की प्रभावशीलता का आकलन किया गया था। चित्रा 4 में परिणाम EIF4EBP1 के प्रभावी डाउनरेगुलेशन, इन कोशिकाओं में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में एक अनुवादात्मक नियामक, दोनों दिन 1(चित्रा 4ए)और दिन 4(चित्रा 4सी)पर एक विशिष्ट siRNA के साथ ट्रांसफेक्शन पर दिखाते हैं । इसी नियामक ने विभिन्न नियंत्रण स्थितियों (यानी, ट्रांसट्रांससंक्रमित, नकली, तले हुए सिआरएनए और EIF4EBP1 siRNA बिना ट्रांसफेक्शन रीडएजेंट: एसआईआर *) के तहत अभिव्यक्ति भी बनाए रखी। 1 दिन और दिन 4 ट्रांसफेक्शन के लिए पश्चिमी दाग प्रयोगों की मात्रा क्रमशः चित्रा 4बी और चित्रा 4डीमें दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, एचआईवी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा 1 दिन या दिन 4 पर ट्रांसफेक्शन के बाद एमआईआर-146ए-5पी के अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किए गए थे(चित्रा 4ई)। मिरना की नकल से संक्रमित कोशिकाओं ने ट्रांसट्रांसेटेड कोशिकाओं पर मिरना अभिव्यक्ति में ४८ से ७२ गुना वृद्धि दिखाई, जबकि सभी ट्रांसफेक्शन नियंत्रण कोई प्रशंसनीय परिवर्तन नहीं दिखाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज सफलतापूर्वक ध्रुवीकृत होते हैं और एम 1 या एम 2 मैक्रोफेज फेनोटाइप की ओर सक्रिय होते हैं। एक स्वस्थ नियंत्रण (ए) और एक एचआईवी-व्युत्पन्न सेल नमूना (बी) से प्राप्त कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण परिणाम सीडी80, सीडी83, सीडी 163 और CD209 के स्तर को दर्शाते हैं। प्रयोग दो अतिरिक्त नियंत्रण और इसी तरह के परिणामों के साथ दो अतिरिक्त एचआईवी पॉजिटिव नमूनों के साथ दोहराया गया था । ब्याज की सेल आबादी को आगे और साइड स्कैटर मापदंडों के आधार पर गेट किया गया था, जिसके बाद दोहरा भेदभाव हुआ । (ग) बार ग्राफ दिखा CD80, CD83, CD163, और M1 और M2 ध्रुवीकृत कोशिकाओं में CD209 । ग्राफ तीन नियंत्रण से प्राप्त औसत डेटा और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है- (सीटीआरएल) और तीन एचआईवी-व्युत्पन्न (पीटीएस) कोशिकाओं के सेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्राथमिक मानव CD14+ कोशिकाओं को कुशलता से miRNAs से संक्रमित कर रहे हैं । (क) स्वस्थ नियंत्रणों से प्राप्त प्राथमिक मोनोसाइट्स का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, 24 घंटे के बाद ट्रांसफेक्शन, दिखाना >90% ट्रांसफेक्शन दक्षता। (ख) प्रतिनिधि conफोकल छवि 24 घंटे के बाद ट्रांसफेक्शन लिया पता चलता है कि क्षेत्र में सभी कोशिकाओं को एक के पास अवरक्त रंग (सफेद में) के साथ संयुग्मित मिरना व्यक्त करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं की व्यवहार्यता। ग्राफ सलाखों के दो एचआईवी+ रोगियों (ए) और दो स्वस्थ नियंत्रण (बी) के औसत सेल व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व करते हैं एक colorimetric परख का उपयोग कर निर्धारित, miR-146a-5p या siRNA के साथ ट्रांसफेक्शन के बाद EIF4EBP1 (siRNA) और दिन 1 (A) या दिन 4 (बी) पर उचित नियंत्रण, सभी दिन 7 पर परीक्षण किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: SiRNA/miRNA ट्रांसफेक्शन पर प्रोटीन के स्तर का कुशल डाउनरेगुलेशन सीडी 14+ मोनोसाइट्स के अलगाव के बाद । नियंत्रण और एचआईवी-व्युत्पन्न मोनोसाइट्स (1 x 106 कोशिकाओं) को EIF4EBP1 mRNA के खिलाफ सिराना का उपयोग करके 1 दिन (ए) या दिन 4 (सी) के बाद अलगाव पर ट्रांसिफ किया गया था। पैनल (बी) और (डी) GAPDH की तुलना में EIF4EBP1 अभिव्यक्ति के मात्राकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और रोगी (पीटी) या नियंत्रण (Ctrl) (A) या रोगी या नियंत्रण (बी) के लिए ट्रांसट्रांस) के लिए नकली पर प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है । (ई) एचआईवी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में एमआईआर-146ए-5पी अभिव्यक्ति दिखाने वाले दो प्रयोगों का प्रतिनिधि बार ग्राफ 4 दिन (बार 1-4) या दिन 1 (सही बार) पर ट्रांस्पर किया गया और 7 दिन में काटा गया । गुना परिवर्तन की गणना ट्रांसट्रांससंक्रमित नमूने (एसआईआर = सिआरएनए) पर की जाती है। एसआईआर * या एमआईआर-145ए-5p * ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के बिना सिआरएनए या एमआईआर-146ए-5p के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन का संकेत देता है। प्रयोग नियंत्रण-व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ 2x दोहराया गया था और अनिवार्य रूप से एक ही परिणाम (डेटा नहीं दिखाया गया) का उत्पादन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में एचआईवी संक्रमित विषयों से प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग को दर्शाता है । एचआईवी+ cART के दौर से गुजर रोगियों को कई वर्षों के लिए संक्रमण के साथ रहते है और यह भी अंय सह संक्रमण एक समझौता प्रतिरक्षा प्रणाली से संबंधित हो सकता है । एचआईवी क्रोनिक संक्रमण की उपस्थिति में इम्यूनोमॉडुलेशन का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं को सीधे रोगियों से काटा गया था। चूंकि miRNAs को सेल विकास और भेदभाव में प्रमुख भूमिकाएं निभाने के लिए दिखाया गया है, प्रोटोकॉल इन प्राथमिक कोशिकाओं(चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4)में मिरना अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की क्षमता पर केंद्रित है। एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके, यह प्रोटोकॉल सिनास(चित्रा 3, चित्रा 4)के लिए भी बहुत अच्छी तरह से काम करता है। परिपक्व मैक्रोफेज की संभावित फागोसाइटिक गतिविधि के कारण, नकली और हाथापाई सिराना नियंत्रण के अलावा, एक नियंत्रण का उपयोग किया जाता है (चित्रा 3 और चित्रा 4में एसआईआर * या एमआईआर * के रूप में इंगित किया जाता है), जिसमें ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान एजेंट छोड़ा जाता है। डेटा इस बात की पुष्टि करता है कि कोशिकाओं में उचित siRNA/miRNA डिलीवरी के लिए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट की आवश्यकता होती है, क्योंकि अभिकर्मक के बिना, कोशिकाएं अनायास मिरना या सिआरएनए को तेज नहीं करती हैं, यहां तक कि जब वे पहले से ही मैक्रोफेज में अंतर कर रहे हैं (चढ़ाना और ध्रुवीकरण के बाद दिन 4, चित्रा 3 और चित्रा 4)।

मानव प्राथमिक CD14+ मोनोसाइट्स के अलगाव और ट्रांसफेक्शन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करते समय, प्रक्रिया को पुन: उत्पन्न करने योग्य और सफल बनाने के लिए अनुकूलित महत्वपूर्ण कदम हैं। विशेष रूप से, 1) चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या उनके अस्तित्व और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है, और 1 x १०६ कोशिकाओं/३५ मिमी पकवान सबसे अच्छा काम करने के लिए पाया गया था । 2) हौसले से अलग CD14+ कोशिकाओं को समान रूप से संस्कृति पकवान को संलग्न नहीं है अगर FBS की उपस्थिति में वरीयता प्राप्त है । नतीजतन, ट्रांसफेक्शन के बाद मध्यम 4 एच की जगह लेते समय, सभी असंबद्ध कोशिकाओं को हटा दिया जाएगा, जिससे प्लेट-टू-प्लेट स्थितियां अत्यधिक परिवर्तनीय हो जाएंगी। 3) यह पाया गया कि ट्रांसफेक्शन के बाद मध्यम 4 एच की जगह, ट्रांसफेक्शन की दक्षता को प्रभावित नहीं करते हुए ट्रांसफेक्शन के कारण विषाक्तता को कम करता है। 4) ट्रांसफेक्शन शर्तों को निर्माता (25 एनएम) द्वारा अनुशंसित सांद्रता की तुलना में कम सिआरएनए या मिरना (15 एनएम) की आवश्यकता के लिए अनुकूलित किया गया था। 5) कोशिकाओं की अत्यधिक अनुयायी प्रकृति के कारण, लाइसिस बफर को सीधे प्लेट में जोड़ने से प्रोटीन या आरएनए की मात्रा में काफी सुधार होता है। हालांकि, अगर प्लेट से कोशिकाओं को हटाना आवश्यक है (यानी, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए), तो ईटीए के साथ पीबीएस का उपयोग करना और कोशिकाओं को धीरे से कुरेदना सबसे अच्छा है। यह विधि एकत्र कोशिकाओं की संख्या को लगभग 20%-30% तक कम कर देता है, इसलिए आगे के विश्लेषण के लिए पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त करने के लिए तदनुसार प्रयोगों की योजना बनाना महत्वपूर्ण है।

जब सही ढंग से पालन किया जाता है, तो यह प्रक्रिया मोनोसाइट्स की अत्यधिक शुद्ध सीडी 14+ आबादी, सिफेस के ट्रांसफेक्शन और छोटे आरएनए जैसे एमआईआरएनए, संस्कृति की स्थिति और एम 1 या एम 2 मैक्रोफेज में भेदभाव को दर्शाती है। यह विधि एचआईवी के अलावा जटिल बीमारियों या संक्रमण ों का अध्ययन करने के लिए लागू की जा सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक रोगी के नमूने और सेलुलर इम्यूनोलॉजी मेटाबोलिज्म कोर को फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण प्रदान करने के लिए एचआईवी नैदानिक/ट्यूमर बायोरेपोसिटररी कोर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस परियोजना को एनआईएच पी20जीएम 121288 और पी30GM114732 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen AM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA BD Biosciences 366643
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794 Flow cytometry
CD14 PerCP Invitrogen 46-0149-42 Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711 BD Horizon 563889 Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421 BD Horizon 564127 Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITC BD Horizon 557226 Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APC BD Horizon 551073 Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep Magnet StemCell Technologies 18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19669
EIF4EBP1 mAb Cell Signaling 9644 Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNA Santa Cruz sc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated Hyclone SH30070.03HI
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter B43618
GAPDH mAb Santa Cruz SC-47724 Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding Inhibitor eBiosciences 14-9161-73 Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis Software Beckman Coulter B16406 Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 Sigma L4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p Qiagen YM00472124
MISSION miRNA Negative Control Sigma HMC0002 Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture Dish Thermo Scientific 150318
PBS Gibco 20012027
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Recombinant Human GM-CSF R&D Systems 215-GM-050
Recombinant Human IFN-γ R&D Systems 285-IF-100
Recombinant Human IL-4 R&D Systems 204-IL-010
Recombinant Human M-CSF R&D Systems 216-MC-025
RPMI 1640 with L-Glutamine Corning 10040CVMP
Scrambled Control siRNA Santa Cruz sc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent Kit Lipocalyx VB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation Reagent Roche 5015944001 Colorimetric assay to assess cell viability

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Plaisance-Bonstaff, K., Faia, C., Wyczechowska, D., Jeansonne, D., Vittori, C., Peruzzi, F. Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes. J. Vis. Exp. (154), e59967, doi:10.3791/59967 (2019).

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